中国恒河猴Mamu-A*01基因筛查及其对抗原肽p11C的特异性CTL反应

目的 筛查中国恒河猴Mamu-A*01基因,比较中国恒河猴和印度恒河猴的Mamu-A*01基因序列和功能是否相同.方法 PCR方法检测128只中国恒河猴,用特异性引物扩增Mamu-A*01基因,将PCR扩增后的产物克隆测序后与印度恒河猴的Mamu-A*01基因进行同源比对;酶联免疫斑点检测 (ELISPOT) 方法分别检测5只Mamu-A*01基因阳性和5只阴性恒河猴针对SIV、SHIV抗原肽p11C的特异性CTL反应.结果 共筛查出5 只Mamu-A*01基因阳性恒河猴 (3.91%),经测序分析后与印度恒河猴的同源性可达99.1 %.这5只均为SIV/SHIV感染恒河猴,其中四只SIV感染的猴的ELISPOT结果显示针对p11C的高频CTL反应,斑点数在500-1400/106 PBMCs之间,而另1只SHIV感染的恒河猴及5只阴性猴没有斑点出现.结论 中国恒河猴含有Mamu-A*01基因,基因频率有区域性差异,中国恒河猴的Mamu-A*01可提呈特异性抗原肽p11C.     

云南地区恒河猴MHC部分基因频率及多态性的分析

目的 不同种群恒河猴(Macaca mulatta)主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)基因的差异性,很大程度上影响了用其作为动物模型的实验研究结果的稳定性、可靠性和可重复性.清晰了解云南地区恒河猴种群免疫遗传学背景对于运用该种群开展各项研究非常重要.恒河猴基因Mamu(Macaea mulaua)-A*01就被公认与猴免疫缺陷病毒(SIV)的感染与延缓病程相联系.Mamu-Ⅱ类等位基因Marnu-DRB1*0306、0309有研究表明也与SIV感染后的病程发展有关.方法 针对目前研究热点的Mamu-A*01基因及Ⅱ类Mamu-DRB1*0306、0309基因,采用序列特异性引物-聚合酶链式反应方法(PCR-SSP),对云南地区的140只恒河猴(其中92只来源于云南景东野外自然繁殖群、48只来源于本灵长类中心自繁群)进行检测.并对阳性样本用部分测序结合单链构象多态性分析(SSCP)的方法加以验汪.结果 Mamu-A*01检测结果为阴性.Mamu-DRB1*0306、0309基因频率分别为32%及45%.结论 初步显示云南地区恒河猴种群Mamu-A*01基因可能缺失或基因频率很低,但存在Mamu-DRB1*0306、0309基因.初步证明SSCP方法代替大规模测序是可行的,为云南地区恒河猴在AIDS研究中的应用提供了部分依据,一定程度上填补了该种群的遗传背景资料.     

SHIV-KB9感染中国恒河猴的实验研究

目的研究SHIV-KB9感染中国恒河猴的可能性,确定其有效病毒浓度,明确实验猴感染SHIV-KB9后的病毒复制和免疫反应情况,建立SHIV/SAIDS模型,并确定、完善SHIV/SAIDS模型评价指标。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查。选出6只无SIV、STLV、SRV/D和B病毒感染的恒河猴,分别用10倍系列稀释的病毒液静脉感染实验猴,使用流式细胞术、血常规检测、病毒分离、DNA-PCR和RT-PCR等方法确定实验猴是否被感染,以及感染后恒河猴体内病毒复制和免疫细胞损伤情况,持续测定3个月。结果实验猴的血浆病毒载量、病毒分离结果、CD4+/CD8+比值和CD4+细胞数等证实,4.8×106copies/mL以上浓度的SHIV-KB9病毒液能成功感染中国恒河猴。结论SHIV-KB9成功感染中国恒河猴为进一步建立SHIV/SAIDS模型奠定了良好的实验基础,为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。     

SHIV病毒在猴体内的复制与传代

目的为建立SHIV艾滋病动物模型提供毒力较强的病毒株,将新合成的SHIV XJ02170病毒适应猴体,并增强其毒力。方法实验前采集猴血清并进行血清学检查和PCR检测。选出13只无SIV,STLV1,SRV D和B病毒感染的猴。第一批实验,将SHIV前病毒DNA质粒经肌肉注射到猴体内,每只500μg;SHIV病毒液,经静脉注射到猴体内,每只2ml。病毒质粒和病毒液各接种2只猴。当第一批猴体检出病毒后,10ml感染猴的全血,抗凝后静脉注射到第二批猴体内,当第二批猴检出病毒后再将10ml感染猴的全血静脉注射到第三批猴体内,连续传代4次。每批实验均定期采集血液标本,分别用肝素和EDTA抗凝,进行病毒分离;病毒基因PCR检测;CD4,CD8测定;病毒抗体检测。结果SHIV XJ02170病毒和SHIV XJ02170前病毒DNA质粒在猴体内的传代中均能分离出病毒;从传代猴的血浆和外周血单核细胞(PBMC)中检出了病毒DNA和RNA基因;CD4,CD8测定结果显示有暂时性倒置现象,后变为正常倒置与正常交替出现;在传代的猴血清中检测出特异性HIV病毒抗体。结论SHIV XJ02170病毒与SHIV XJ02170前病毒DNA质粒,均能在恒河猴体内复制。     

PCR在猴艾滋病模型中检测SIV基因的应用

我们设计了两对特异的聚合酶链式反应(PCR)扩增SIV基因的引物，建设了SIV感染的PCR基因扩增检测法，实验结果表明，PCR方法可检出0．01Pg水平的SIV基因．PCR法、检测与病毒分离相比较，PCR检查敏感性高，特异性强，特别是恒河猴实验感染后期，病毒分离多为阴性，而PCR检查均获阳性结果。PCR基因扩增检测法应用于猴艾滋病模型的研究．将有助乎艾滋病药物的体内实验治疗和艾滋病疫苗的效果评价。     

SHIV1157ipd3N4中国恒河猴细胞适应株静脉感染中国恒河猴有效浓度的确定

目的 确定SHIV1157ipd3N4静脉途径感染中国恒河猴的有效病毒浓度,明确SHIV1157ipd3N4感染实验猴体内病毒复制和免疫损伤情况.方法 10只正常中国恒河猴分成6组,分别用10倍系列稀释的病毒液1 mL静脉感染,测定血浆病毒载量,CD4+/CD8+,CD4+T淋巴细胞绝对数,分析感染后恒河猴体内病毒复制...     

基于基因的艾滋病疫苗的研究

T淋巴细胞应答在控制人免疫缺陷病毒或猴免疫缺陷病毒(SIV)感染中有重要作用。通常采用恒河猴感染SIV或嵌合SHIV病毒为实验模型,接种DNA疫苗来诱导T淋巴细胞应答及检验疫苗保护效应。在灵长类动物上,DNA疫苗的免疫原性取决于基因表达水平、SIV蛋白中抗原的选择、融合蛋白的使用、接种途径及佐剂的添加。最近研究表明,用DNA致敏,用表达相应SIV抗原的减毒重组病毒载体进行强化,可以提高特异免疫原性,防止致病病毒的攻击。目前,DNA疫苗作为基于基因的获得性免疫缺陷综合征疫苗已进入治疗性或预防性的临床试验阶段。     

体内CD8~+T细胞剔除对无症状期SHIV感染猴的影响

目的 CD8+T细胞在一些病毒感染疾病的免疫反应中起着重要的作用,但CD8+T细胞在HIV无症状期的作用尚不明确,本研究通过体内CD8+T细胞剔除,研究CD8+T细胞对SHIV感染猴的影响,进一步了解艾滋病的发病机制。方法选择8只SHIV病毒感染的恒河猴,均处于无症状期,随机分成两组,实验组4只恒河猴在0、3、7 d注射抗CD8+T抗体cM-T807,不同的时间取外周血、腹股沟淋巴结。流式细胞术测定恒河猴外周血和淋巴结中CD8+T细胞数目,Real-time RT-PCR法测定实验猴血浆病毒载量,并使用IFN-γElispot方法测定其对猴细胞免疫的影响。结果 CD8+T细胞敲除后,4只猴的病毒载量都转阳,但反应性不一,HIV-1的靶细胞CD4+T细胞有轻微下降,后反弹,与病毒载量无相关性;CD8敲除猴的感染情况(血浆病毒载量和CD4细胞)比SHIV病毒急性感染轻,这与ELIPOT结果一致。结论 CD8+T细胞在HIV无症状期发挥重要的作用,但其作用具有个体差别。     

B亚型SHIVSF162p3中国恒河猴小剂量多次阴道黏膜感染

目的模拟HIV性传播感染特点进行中国恒河猴阴道黏膜小剂量多次感染研究,为我国艾滋病疫苗有效性评价提供新的模型构建思路。方法选用20-30TCID50剂量的SHIVSF162p3病毒阴道黏膜途径感染六只成年雌性中国恒河猴,共感染13次,每次攻毒间隔4～7 d。采取测定血浆病毒载量和外周血CD4+∶CD8+。结果 6只中国恒河猴经13次病毒攻击后,经检测均建立系统性感染,血浆病毒载量呈阳性;CD4+∶CD8+均有下降。结论成功建立了中国恒河猴阴道黏膜小剂量多次感染模型,为艾滋病研究提供了新的更接近于自然感染状态的模型建立模式。     

SHIV1157ipd3N4细胞适应株的制备及其生物特性

目的 体外制备SHIV1157ipd3N4病毒中国恒河猴细胞适应株,在细胞水平和中国恒河猴体内评价其生物学特性.方法 用SHIV1157ipd3N4病毒阴道感染中国恒河猴,在血浆病毒载量高峰期采血分离外周血单核淋巴细胞(PBMCs),与正常中国恒河猴PBMCs共培养.定期测定培养液中的P24抗原水平.当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存.测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50.静脉感染中国恒河猴,研究该批次SHIV1157ipd3N4在体内的病毒学、免疫学指标变化及变异情况,分析其基本的生物学特性.结果 本研究共制备了243 mL SHIV1157ipd3N4病毒原液,gp120序列分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变.病毒载量为1.586×108 copies/mL,P24抗原水平为1.16×103 pg/mL,TZM-bl细胞测定病毒的TCID50为3.16×103/mL.1 mL SHIV1157ipd3N4静脉成功感染中国恒河猴G1004V,高峰期病毒载量达到1.0×106 copies/mL以上.结论 此次制备的SHIV1157ipd3N4细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIV1157ipd3N4/中国恒河猴模型.     

小鼠念珠菌感染模型和遗传因素研究

白色念珠菌是能感染人类皮肤和粘膜的真菌.当宿主的免疫系统受到抑制时,可导致念珠菌病.建立动物实验模型对研究不同类型的人类念珠菌病非常必要,如系统性和皮肤粘膜的念珠菌感染模型.目前,最为常见的是系统性念珠菌动物模型.而能准确反映人类皮肤粘膜念珠菌感染的动物模型仍未稳定建立.值得庆幸的是,特异性基因剔除小鼠(Specific-gene knock out mice)的出现为研究念珠菌与宿主的免疫应答提供了更为直接和准确的模型.     

巨细胞病毒感染加重载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化

目的本研究以载脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein-E knockout,apoE-/-)小鼠为研究对象,给予低剂量的小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV),以期了解在模拟人体内潜伏感染状态下病毒对动脉粥样硬化形态学方面的影响,以及凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(lectin-like ox-LDL receptor-1,LOX-1)基因的表达变化,以探讨MCMV在动脉粥样硬化形成及发展过程中所起的作用。方法采用随机数字表法将32只高脂饮食apoE-/-小鼠随机分为2组,其中1组经腹腔感染MCMV,分别在感染后14周、18周和24周截取主动脉;另1组不感染MCMV。通过HE染色观察2组动物主动脉粥样硬化病变的面积、数目、分级和内膜/中膜比值,实时定量PCR(real-time PCR)检测动脉壁和唾液腺中的MCMV含量以及LOX-1基因表达量的变化。结果研究显示在慢性潜伏感染阶段,MCMV感染明显加重apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变面积;但随感染时间的延长,该作用逐步减弱。小鼠动脉壁中没有MCMV mRNA的表达。血浆MCMV抗体含量、唾液腺MCMV DNA含量和动脉粥样硬化病变程度没有相关性。感染后14周,病毒组LOX-1mRNA含量较对照组明显增高。结论在慢性潜伏感染阶段,MCMV感染可以明显加重apoE-/-小鼠主动脉AS病变,并使重度AS病变提前出现,但在血管壁局部并无MCMV活动性感染的证据。MCMV感染后可增加动脉壁LOX-1基因表达,LOX-1的高表达可能是MCMV加重动脉粥样硬化形成的途径之一。     

68Ga枸橼酸制备及炎症显像

目的 67Ga枸橼酸被应用于感染和炎症的定位闪烁显像,但因其核素半衰期长,临床上应用逐渐减少,而68Ga枸橼酸具有理想的半衰期.本研究将枸橼酸标记68 Ga,探讨68 Ga枸橼酸PET显像对细菌性感染检测的可行性.方法 直接将枸橼酸钠和68Ga混合,室温放置15min完成标记.将标记产物用生理盐水稀释,用薄层层析分析标记产物的放射性化学纯度.用PET观察68Ga枸橼酸在正常小鼠体内的生物分布变化.用金黄色葡萄球菌感染小鼠左腿腓肠肌,4天后尾静脉注射68Ga枸橼酸,注射后不同时间显像观察68Ga枸橼酸在炎症模型小鼠体内的生物分布变化.结果 68Ga枸橼酸的标记在15min内完成,标记率达到96％以上,不需要进一步纯化即可应用于PET显像.正常动物的PET显像表明,68 Ga枸橼酸主要分布于心脏,通过膀胱排泄.炎症模型小鼠的研究表明,随时间延长,68Ga枸橼酸的放射性在细菌感染处摄取逐渐增高.结论 用一种简单方法制备成68Ga枸橼酸,初步研究表明68Ga枸橼酸能够对小鼠金黄色葡萄球菌感染引起的炎症显像.     

血管紧张素转换酶2在SARS-CoV感染中的功能(第2部分)--SARS-CoV在ACE2表达细胞中的复制和ACE2基因敲除对小鼠SARS-CoV感染的保护作用

目的研究ACE2在SARS-CoV感染中的作用。方法利用表达人类ACE2的小鼠成纤维细胞系和ACE2基因敲除小鼠研究SARS-CoV在小鼠成纤维细胞中的复制和ACE基因剔除小鼠体内的复制。结果SARS-CoV可以感染，并在表达人类小鼠ACE2的小鼠成纤维细胞中的复制，ACE2基因的缺失严重影响了SARS病毒与组织的结合，和SARS病毒在动物体内的复制，ACE2基因剔除对小鼠SARS—CoV感染具有保护作用。结论ACE2是SARS-CoV的主要受体，并且是SARS治疗潜在的靶基因。     

仙台病毒抗肿瘤的研究进展

仙台病毒是实验大、小鼠的常见病原之一.大、小鼠感染仙台病毒后,可通过诱生Ⅰ型干扰素、调节免疫应答和致肿瘤细胞凋亡等干预肿瘤生长,该病毒已逐渐被开发为一种新型、高效的抗肿瘤制剂.本文综述了仙台病毒抗肿瘤、对科学研究的干扰作用等方面进展.     

茄病镰刀菌致ICR小鼠局部皮肤感染的实验研究

目的建立茄病镰刀菌感染皮肤的ICR小鼠模型。方法将茄病镰刀菌三个不同浓度的菌悬液分别接种于正常和免疫抑制ICR小鼠受损及正常未受损的皮肤,于接种后第7、14、21、28天处死动物,取皮疹和各脏器进行真菌镜检、培养和组织病理学检查。结果正常和免疫抑制组皮肤受损的小鼠均出现皮疹,而免疫抑制组皮疹程度重,持续时间长,且真菌镜检、培养及组织病理学大都可见菌丝。皮肤未受损的小鼠不发生皮疹。实验小鼠均未出现系统播散。结论接种109CFU/mL或1010CFU/mL茄病镰刀菌的孢子悬液于免疫抑制ICR小鼠擦伤的皮肤,可有效造成ICR小鼠的茄病镰刀菌皮肤感染。     

小建中汤水提组分对幽门螺杆菌感染小鼠胃黏膜损伤的治疗作用

目的观察小建中汤对幽门螺杆菌（Hp）感染小鼠胃黏膜损伤的治疗作用。方法给BABL/c小鼠连续5d灌胃Hp悉尼菌株（SS1Hp）菌液造成Hp感染模型,造模成功后连续4周给小鼠灌胃小建中汤水提组分,给药结束7d后通过胃黏膜直接涂片、快速尿素酶试验及胃黏膜组织细菌培养检查小鼠Hp根除情况,并对胃窦部黏膜进行病理组织学检查。结果小建中汤水提组分高、中、低剂量组的Hp根除率分别为85%、65%、45%,均明显高于模型组（P〈0.05或0.01）,同时胃窦部黏膜炎症较模型组均有不同程度的改善。结论小建中汤水提组分具有较好的抗Hp感染和抗胃黏膜损伤作用。     

Experimental amebiasis: a selected review of some in vivo models

The use of in vivo animal models in amebiasis has contributed significantly to the knowledge of this common human parasitic disease. Although there is no animal model that mimics the whole cycle of the human disease, the use of different susceptible and resistant laboratory animals and the availability for many years of techniques for the axenic culture of trophozoites of Entamoeba histolytica have allowed a better understanding of the parasite and the host-parasite relationship. The recent introduction of frontier methodologies in biology has increased our comprehension of this parasite. New information on the cellular and molecular biology and genetics of this organism has been extensively reported, and much of this has clearly required the more frequent use of animal models to verify specific facts. Based on experimental animals characterized previously, the introduction of new animal models with genetic or surgical modifications, especially in mice, has allowed a more adequate analysis of the mechanisms of pathogenesis. Multiple factors have been considered in the promotion of the invasiveness and virulence of E. histolytica. Additionally, the immunological and physiological responses of the host, depending on the environmental conditions, lead to the establishment or the rejection of the parasite. The role of inflammatory reaction to amebic infection constitutes one of the controversies that has been studied by several authors. In susceptible animals (hamsters and gerbils), inflammatory cell damage seems to be related to target cell lysis, while in resistant animals (mice), inflammatory cells appear to protect the host by lysing the parasite. Presently, the involvement of various substances in the development of lesions including lectins, proteases, amebapores, promoters of apoptosis, cytokines, nitric oxide, etc., is being examined using different in vivo models.     

卡介苗免疫预防小鼠白色念珠菌感染的实验研究

目的探讨卡介苗（BCG）预先免疫对小鼠白色念珠菌感染的影响。方法采用BCG或灭菌生理盐水皮内注射预先免疫2周,然后由尾静脉注射白色念珠菌进行攻击,观察小鼠死亡率及计算存活小鼠肾组织带菌量。结果BCG免疫组存活时间长于生理盐水免疫组（P〈0.01）;存活小鼠肾组织菌落计数：BCG免疫组远少于省里盐水免疫组（P〈0.01）。结论BCG对小鼠白色念珠菌感染具有很好的保护作用。     

利用雌激素构建小鼠淋病奈瑟菌感染模型

目的探讨用雌激素构建淋病奈瑟菌感染小鼠模型的方法。方法淋病奈瑟菌WHO-A接种经皮下注射苯甲酸雌二醇和真皮下埋植尼尔雌醇片（雌三醇）预处理的雌性ICR小鼠，小鼠阴道拭子接种T-M选择培养基培养分离淋病奈瑟菌，取小鼠阴道分泌物涂片染色观察淋病奈瑟菌感染情况，比较两种雌激素对小鼠淋病奈瑟菌感染的差异。结果与对照组相比，苯甲酸雌二醇小鼠体内淋病奈瑟菌有短时间的定植，而尼尔雌醇组与对照组无差异。结论雌激素（尤其是雌二醇）有利于淋病奈瑟菌在小鼠阴道内的定植。