SARS病毒S1蛋白N端片段在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的:获得纯化的重组SARS病毒S1蛋白N端部分,研究其与机体产生针对SARS病毒免疫应答的规律和机制.方法:将编码SARS病毒S1蛋白N端334个氨基酸残基的基因进行克隆,并在原核表达系统中表达,获得了纯化的重组蛋白.利用SARS患者恢复期已知的SARS抗体阳性血清,鉴定纯化的重组S1蛋白片段.结果:克隆表达的重组蛋白基因序列与公布的SARS病毒S1蛋白N端的基因序列相同,所表达的重组蛋白相对分子质量约为64 000.3份SARS患者恢复期的血清均与重组蛋白反应,在相对分子质量64 000处形成特异性的反应条带,而来自SARS流行前的正常人对照血清则不能与重组蛋白反应.结论:获得的重组蛋白与SARS病毒抗体呈现特异性的反应,为进一步研究SARS病毒感染免疫应答机制和制备SARS病毒的重组疫苗奠定基础.     

应用合成的SARS病毒S蛋白重叠肽筛选B细胞表位

目的筛选SARS病毒S蛋白的B细胞表位。方法使用SARS-CoV S DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,获得SARS病毒S蛋白的免疫血清。人工合成包含169条部分氨基酸序列重叠的SARS-CoV S蛋白的多肽库。将多肽片段包被ELISA板,利用免疫小鼠血清,通过抗体结合试验来筛选SARS病毒S蛋白的线性B细胞表位。并将筛选结果与使用B细胞表位分析软件预测的结果进行比较。结果使用重叠肽合成法筛选到SARS-CoV蛋白两条多肽片段S335-352和S442-458,能与免疫动物血清特异性结合,与使用Bcipep数据库预测B细胞表位的结果相一致。结论鉴定了两个新的SARS病毒S蛋白B细胞表位。     

SARS病毒S蛋白的B细胞表位预测

目的预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位.方法基于SARS 蛋白基因组序列,采用Kyte-Doolittle的亲水性方案,Emini方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以对S蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位.结果推测最有可能的B细胞表位位于S蛋白N端第91～98区段、第1 121～1 153区段和第185～193区段内或它们的附近.其它,如S蛋白N端第1 050～1 059、752～765、41～50、666～674、264～287、340～348、408～416区段和第424～439区段内或附近也可能存在B细胞表位.结论用多参数预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位,为分子免疫学的深入研究提供线索.     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的探讨SARS冠状病毒的刺突(spike，S)蛋白的免疫学特性，以及S蛋白作为SARS—CoV病毒疫苗组分的可行性。方法将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET—15b，并在大肠杆菌中表达，经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rSa和rSb；将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB，得到重组DNA疫苗pSecS，免疫小鼠，得到SAS—CoV S蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rSa和rSb建立的SARS—CoV S抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果分段的重组蛋白rSa和rSb在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达，并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应，原核表达的重组分段S蛋白具有SARS—CoV S蛋白相似的抗原性。结论原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS—CoV检测中；所构建的SARS—CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体，这为进一步SARS DNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

SARS-CoV S2蛋白基因的克隆及其在Vero E6细胞中的表达

目的克隆人SARS病毒S2蛋白分子的编码序列,并在VeroE6细胞上获得表达.方法从人SARS病毒cDNA文库中用PCR技术克隆编码SARS病毒S2蛋白的片段.将它插入质粒载体PVAXl中构建重组S2-pVAXl真核表达载体,并对插入片段序列进行测序.采用脂质体法转染VeroE6细胞,用Western blotting检测SARS-CoV S2蛋白的表达情况.结果用PCR方法扩增出一个1 845bp的基因片段,并插入pVAXl载体中,成功构建出重组S2表达载体,经测序证实克隆的S2片段阅读框正确完整.将其转染的Vero E6细胞经Western Blotting检测获得一条特异性目的蛋白条带.结论成功克隆基因并获得表达S2分子的Vero E6细胞系.     

基因免疫制备抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体

目的通过基因免疫方法,制备抗SAILS病毒N蛋白的单克隆抗体并对单抗进行初步鉴定。方法将含有N蛋白的编码基因的真核重组质粒pSecTagB／N免疫BALB／c小鼠,然后取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用原核表达的SARS病毒N蛋白筛选阳性克隆。然后通过免疫印迹法进一步证明抗体对N蛋白的特异性,用ELISA方法检测抗体对灭活SARS全病毒的免疫反应。结果筛选得到10株抗N蛋白的单克隆抗体,ELISA和免疫印迹结果表明这些抗体特异性针对N蛋白上的抗原决定簇,且有7株抗体对SARS灭活病毒有阳性反应。结论所得的单克隆抗体特异针对N蛋白。     

SARS病毒S蛋白部分片段B-细胞表位的多参数预测

目的预测SARS病毒S蛋白(spike glycoprotein)部分片段(aa No.400～600 & aa No.1 100～1 195)的B-细胞表位.方法应用多种参数和方法进行综合分析,包括跨膜分析、保守区分析、同源性比较、Hopp ＆ Woods亲水性参数、抗原性参数、可及性参数、β-转角、万氏法等综合预测方法.结果显示B-细胞识别的表位可能在436～456和1 136～1 146残基或其附近,这两个被预测的表位均含有β-转角和不规则卷曲结构.结论本研究为应用合成肽抗原制备抗SARS病毒S蛋白抗体、诊断非典型肺炎(severe acute respiratory syndrome, SARS)提供了依据.     

SARS冠状病毒S蛋白抗原表位串联基因的设计和表达

目的:表达严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,为研制新型的SARS病毒疫苗提供新思路。方法:应用生物信息学分析软件分析SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,设计全新的抗原表位编码基因序列,构建表达载体并在大肠杆菌中表达该基因。结果:设计并合成了SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列的新基因序列,在大肠杆菌中实现了该基因的高表达。结论:可以重新设计新基因产生新型候选重组疫苗。     

SARS病毒研究取得重大进展

日前 ,新的研究报告显示 ,SARS病毒是一种崭新的冠状病毒 ,而非某种已知冠状病毒的近期变种。SARS病毒基因组研究表明在不同国家发生的SARS病毒没有显著的变异。美国和加拿大研究人员研究明确证实该病毒有冠状病毒的典型特征 ,同时该病毒还有别于以往经过测序的所有冠状病毒。与其他冠状病毒相比 ,未发现编码rep、S、E、M或N蛋白的基因发生任何明显的主要基因重排或出现任何大范围插入或缺失的情况。与一些其他的冠状病毒一样 ,SARS病毒有多个处于S和E基因之间以及处于M和N基因之间的小型非结构ORFs。SARS病毒是一种在物种进化…     

重组新冠病毒S蛋白三聚体免疫原性研究

目的 检测重组新冠病毒S蛋白三聚体是否具有免疫原性。方法 将不同剂量的重组新冠病毒S蛋白三聚体搭配同剂量铝盐+CpG1080混合佐剂制成候选疫苗,免疫C57BL/6小鼠。采用ELISA和ELISpot的方法,分别检测小鼠血清中抗S蛋白三聚体的IgG抗体水平和脾细胞中分泌特异性IFN-γ的T细胞水平。结果 在免疫后的小鼠血清中检测到了较高水平的抗S蛋白三聚体的IgG抗体滴度,同时在脾细胞中也检测到了分泌特异性IFN-γ的T细胞数量增加。结论 重组新冠病毒S蛋白三聚体具有良好的免疫原性。     

抗SARS病毒药物体外筛选取得新进展

中科院上海生命科学院 5月 16日报告 ,经过 3个多星期的联合攻关 ,己分别在SARS病毒基因克隆、蛋白质表达与结构分析及药物设计等研究方面取得了重要进展。科研人员完成了SARS病毒的 3个关键蛋白的表达 ,并进行了初步的验证 ,其中一种蛋白已开始用于抗SARS病毒药物的体外筛选。上海生命科学研究院生化与细胞所汪恒研究组科研人员在提取SARS病毒RNA的基础上 ,利用RT -PCR技术成功地克隆了SARS病毒的S、M、N、E及RNA聚合酶、3CL蛋白水解酶等 6种主要蛋白基因的cDNA。药物所沈旭研究组和蒋华良研究组则在此研究的基础上 ,进行…     

SARSN状病毒S蛋白S1区多肽与SARS病人血清的免疫反应

目的 测定根据计算机预测的SARS冠状病毒S蛋白S1区的抗原表位多肽与SARS病人血清的免疫反应．以寻找和确定SARS相关冠状病毒的中和抗原表位。方法 采用多肽合成仪合成SARS冠状病毒S蛋白S1区的多肽．并用ELISA方法检测合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应。结果 合成的8个多肽与SARS病人血清免疫反应的光密度值是其与正常人血清免疫反应的光密度值的1．5～2．6倍。结论 合成的多肽与SARS病人血清的免疫反应较低，提示这些多肽是否为SARS冠状病毒的抗原表位还要进一步研究。     

汉滩病毒S基因体外转染Vero-E6细胞

0 引言 汉滩病毒属布尼亚病毒科汉坦病毒属,主要引起人类肾综合征出血热,我国是肾综合征出血热发生和流行的主要疫区. 故寻找安全有效、低廉的疫苗是控制本病流行和发生的关键[1],基因免疫是将编码外源蛋白的核酸表达质粒直接转化到机体,以激发机体产生针对外源蛋白的特异性免疫应答的过程. 由于基因免疫具有同时激发机体的体液免疫和细胞免疫的特点,操作简单,成本低廉, 特别适合传染病的预防和治疗. 本研究将汉滩病毒S片段编码区基因(核蛋白编码区基因)插入到真核表达载体pVR1012中,成功地构建了重组表达质粒pVRS22, 并用该质粒进行了体外非洲绿猴肾传代细胞Vero-E6细胞的瞬时转染.     

SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的 探讨SARS冠状病毒的刺突(spike,S)蛋白的免疫学特性,以及S蛋白作为SARS-CoV病毒疫苗组分的可行性。方法 将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET-15b,并在大肠杆菌中表达,经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rS_a和rS_b;将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB,得到重组DNA疫苗pSecS,免疫小鼠,得到SAS-CoVS蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rS_a和rS_b建立的SARS-CoVS抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果 分段的重组蛋白rS_a和rS_b在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达,并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应,原核表达的重组分段S蛋白具有SARS-CoVS蛋白相似的抗原性。结论 原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS-CoV检测中;所构建的SARS-CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体,这为进一步SARSDNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

胰腺癌新基因S100P与绿色荧光蛋白融合基因慢病毒载体的构建

目的:构建胰腺癌新基因SLOOP与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因慢病毒载体.方法:实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增获得SlOOP的全外显子片段.使之克隆到带GFP荧光报告基因慢病毒表达载体质粒中,慢病毒包装质粒和穿棱质粒共转染293T细胞,包装成功后收集上清,浓缩,鉴定.取浓缩纯化后的病毒上清感染293T细胞和宿主胰腺癌细胞.荧光显微镜观察293T细胞的荧光表达,RT-PCR鉴定胰腺癌细胞中SLOOP的表达水平.结果:电泳鉴定结果与目的基因表达条带完全吻合,克隆测序结果与NCBI收录的S LOOP基因序列完全一致.重组慢病毒质粒可高效转染293T细胞.荧光显微镜下可观察到大量绿色荧光.共转染后293T细胞上清可高效感染293T细胞,感染后宿主细胞中S LOOP高表达.结论:成功构建了S LOOP与GFP融合基因慢病毒表达载体,为进一步研究SLOOP基因的相关功能提供了适合的稳定转染载体.     

SARS病毒表面蛋白抗原决定簇的免疫信息学分析

SARS病毒是一种新近发现的冠状病毒,其表面蛋白可与细胞上的相应受体结合,导致人类发生严重急性呼吸道综合征(SARS)等疾病.通过免疫信息学的方法,我们对该病毒的表面蛋白进行了分析.结果显示,SARS病毒与常见的人类冠状病毒相比,其编码的表面蛋白中可以被人类免疫系统识别的抗原决定簇明显改变和减少.由此表明,SARS病毒引起人类发生严重疾病的原因可能与该病毒逃避机体免疫识别有关.因此,利用免疫信息学分析SARS病毒特有的或免疫应答比较强的决定簇,从中找到抗原肽疫苗的候选位点,可以为研制针对SARS病毒的有效疫苗提供重要的理论依据.     

SARS病毒蛋白保守性分析

目的：寻找和确定SARS病毒中高保守的蛋白,以指导针对这些高保守蛋白为药物靶的药物分子设计。方法：采用比较基因组的方法和PSI-Blast搜索方法分别探讨SARS病毒不同蛋白在冠状病毒属内部及在正链RNA病毒内的保守情况。结果：确定了SARS非结构蛋白,特别是RdRp、Hel、nsP12、nsP13等蛋白在冠状病毒属内部表现很高的序列相似性,同时它们在正链RNA病毒范围内呈现不同程度的保守性。结论：主要参与病毒的复制、转录及后处理过程的非结构蛋白RdRp、Hel、nsP12、nsP13的高保守性,表明与病毒扩增相关的基因调控机制的保守是病毒进化的重要特征;同时这些非结构蛋白的高保守性及功能重要性表明它们更适合作为有效的药物靶分子。     

SARS冠状病毒S2基因变异性分析

目的 测定SARS冠状病毒GD322株S2基因序列并对SARS-CoVS2基因进行系统进化树分析。方法用RT-PCR法从SARS-CoV GD322株基因组中扩增S2基因片段并克隆至pGEM—T载体,转化大肠杆菌DH5a株后测序。利用Lasergene、ClustalX、DNAman和Treeview等软件,将基因序列翻译成氨基酸序列后,与早、中、晚期各地暴发的SARS-CoVS2蛋白序列进行比对,构建系统进化树,并在Internet网数据库中对S2蛋白氨基酸序列进行T细胞抗原表位预测。结果随着SARS-CoV的传播流行,S2基因趋于稳定,晚期的SARS-CoVS2基因的同源性达到99．9％。T细胞抗原表位预测发现。SARS-CoVS2蛋白第57位氨基酸突变对T细胞抗原表位有影响。结论SARS流行过程中SARS-CoVS2基因较为稳定,S2蛋白57位氨基酸的突变可影响病毒T细胞抗原表位。     

SARS冠状病毒S蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备

目的: 表达SARS冠状病毒S蛋白片段,并制备特异性单克隆抗体(mAb).方法: 原核表达SARS冠状病毒S蛋白片段,从SARS病毒cDNA中扩增S蛋白(N端205至419aa)基因片段,测序结果正确.将该基因片段插入pQE-30中,构建重组质粒pQE-30-S1m,以重组质粒转化E.coli M15诱导表达His-S1m蛋白.纯化后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb.结果: 表达并纯化了重组蛋白His-S1m,获得1株抗His-S蛋白的mAb1H2.Ig亚类鉴定为IgG1a,轻链为κ型.经Western blotting检测,mAb1H2与S蛋白发生特异性反应,而与His蛋白无交叉反应.结论: 成功表达了重组S蛋白并制备了特异性mAb,为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究S蛋白的功能奠定了基础.