血管内皮生长因子转染骨髓间充质干细胞心肌移植对心肌梗死后大鼠心功能及血管新生的作用

目的建立重组人血管内皮生长因子(VEGF)165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的方法,探讨该细胞心肌移植对缺血性心脏病心功能及血管新生的影响,并比较联合治疗与单独基因或细胞治疗的疗效差异。方法采用密度梯度离心-贴壁培养法获取Wistar近交系大鼠MSC,用脂质体将pcDNA3.1-hVEGF165转入该细胞,通过ELISA、RT—PCR和Western印迹检测后者VEGF的表达情况;以Wistar近交系大鼠建立心肌缺血模型,随机分成4组(每组12只),心肌梗死模型建立2周后,联合组在心肌梗死区移植转染VEGF165基因的MSC,细胞组移植等量的MSC,基因组注射脂质体-pcDNA3.1-VEGF165DNA复合物,对照组注射等容积培养液;另取12只未结扎冠脉的大鼠为假手术组。细胞移植4周后,用Buxco系统检测心功能;然后处死动物,取心肌标本,测量心肌梗死面积;用5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)、肌钙蛋白T免疫组化双染法确定移植细胞的存活与分化;用Ⅷ因子染色法检测血管新生,RT-PCR法检测VEGF165基因的体内表达情况。结果(1)pcDNA3.1-hVEGF165基因通过脂质体转染大鼠MSC后获稳定表达;(2)移植4周后,联合组心肌梗死面积(27．8％±3．0％)明显低于细胞组(37．0％±10．1％)与基因组(37．1％±5．2％,均P<0．05),心功能改善优于细胞组与基因组;(3)联合组心肌梗死区毛细血管密度(每视野40．2个±5．5个)高于细胞组(27．2个±6．3个,P<0．01)和对照组(18．5个±5．8个,P<0．01),较基因组(35．8个±7．7个)亦有增加的趋势(P=0．189);(4)Brdu、肌钙蛋白T双染示各治疗组心肌梗死区心肌细胞数量不同程度的多于对照组;(5)联合组VEGF基因的体内表达(hVEGFmRNA相对含量0．18±0．04)高于基因组(0．10±0．03,P<0．01)。结论转染VEGF基因的MSC移植可使鼠冠脉结扎造成的心肌梗死面积缩小、心功能明显改善,其疗效优于单独应用基因或细胞治疗,为缺血性心脏病的细胞基因联合治疗提供了理论依据。     

自体骨骼肌卫星细胞移植对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的 了解自体骨骼肌卫星细胞(satellite cell,SC)移植至心肌对心肌梗死(myocardial infarction,MI)大鼠心功能的影响及其可能机制.方法 45只Wistar大鼠采用随机抽签法分为假手术组、对照组及移植组,对照组及移植组大鼠经结扎冠状动脉前降支建立MI模型.将体外培养2周的大鼠自体SC以注射的方式移植到移植组大鼠梗死区周围,4周后测定各组大鼠血流动力学、心功能、血清血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)浓度及缺血心肌毛细血管密度的变化,同时观察移植细胞在梗死区的生长、增殖情况并探讨它们相互的关系.结果 SC在梗死区中可增殖分化为横纹肌纤维;与假手术组比较,尽管对照组及移植组大鼠之收缩压、舒张压、平均动脉压、左室收缩压及左室压力最大上升/下降速率均明显降低(P＜0.05,P＜0.01),左室舒张末压均明显增高(P＜0.01),但移植组左室压力最大上升速率、左室压力最大下降速率及左室舒张末压较之对照组则有明显改善(P＜0.05,P＜0.01);SC移植4周后,对照组大鼠毛细血管密度较之假手术组明显增高(P＜0.05);移植组大鼠缺血心肌中毛细血管密度及血清VEGF浓度较之假手术组、对照组亦明显升高(P＜0.05,P＜0.01).结论 SC在心肌梗死区中能增殖分化为横纹肌样细胞,并可分泌VEGF促使缺血心肌毛细血管增生,从而共同参与改善心功能.     

内皮前体细胞移植在糖尿病足治疗中的作用

内皮前体细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)具有修复损伤血管内皮,促进新生血管形成的功能。近年来,EPCs被用于治疗糖尿病足,并取得良好的疗效。本文就EPCs治疗糖尿病足的最新进展进行综述。     

帕金森病大鼠模型的改进及神经前体细胞移植治疗的行为学研究

目的 探讨提高6-羟多巴胺(6-OHDA)帕金森病大鼠模型成功率的技术改进方法，并对改进模型进行行为学评价?观察神经前体细胞定点移植对改进型PD大鼠模型行为学的影响。方法 6-0HDA双点微量注射于大鼠左侧大脑制备PD大鼠模型并观察其行为学变化。小鼠胚胎干细胞的培养和无血清神经诱导，神经前体细胞恼内移植，移植后PD大鼠行为变化。结果 改进注射方法后PD大鼠模型制备成功率为73.3％，较常规制备方法明显提高；神经前体细胞脑内移植后的PD大鼠的旋转次数明显减少；结论 使用6-OHDA双点注射选择性破坏大鼠多巴胺能神经元，可建立较稳定的且成功率较高的PD模型。小鼠ES细胞诱导的神经前体细胞脑内移植后PD大鼠旋转次数明显减少。     

过表达Periostin蛋白对内皮前体细胞功能影响的实验研究

目的构建Periostin蛋白过表达慢病毒载体, 并检测其对内皮前体细胞(EPCs)功能的影响。方法从小鼠骨髓中获取EPCs, 并进行鉴定。采用Oligos设计获得目的基因, 构建慢病毒载体LV5/Periostin。慢病毒感染EPCs, 荧光显微镜下观察被感染细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况, Western blotting检测Periostin蛋白表达情况。CCK-8法和流式细胞计数检测被感染细胞的增殖和凋亡情况, 划痕法和Transwell小室法检测被感染细胞迁移和侵袭能力的改变情况。结果被重组慢病毒感染的EPCs明显表达GFP; 过表达慢病毒组细胞增殖活性较阴性对照组低, 而凋亡细胞较阴性对照组多(P < 0.05);过表达慢病毒组细胞的迁移率较空白对照组细胞高, 侵袭细胞数目较多(P < 0.05)。结论可以从小鼠骨髓中成功分离和培养EPCs, 过表达Periostin蛋白会降低EPCs体外增殖的活性, 促进其凋亡; 但会增加EPCs的体外迁移和侵袭能力。     

内皮素-1对大鼠骨髓内皮前体细胞凋亡和细胞周期的影响

目的:探讨内皮素-1(ET-1)对大鼠骨髓内皮前体细胞(EPCs)凋亡及细胞周期的影响.方法:采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓单核细胞,在M199培养液中培养扩增EPC并进行鉴定.EPCs被分为对照组和ET-1组(100 μmol/L),各组再分为不同干预时间组(24,48,72,96 h),流式细胞仪检测EPC凋亡率和细胞周期比例.结果:24,48,72,96 h ET-1组凋亡率均比相应时段对照组低(P<0.01);72 h ET-1组和96 h ET-1组分别较48 h ET-1组有所降低(P<0.05和P<0.01).24,48,72,96 h ET-1组G0/G1期细胞比例均较相应时段对照组减少(P<0.01);24,48,72,96 h ET-1组S期细胞比例均较相应时段对照组增加(P<0.01);24,48,72,96 h ET-1组G2/M期细胞比例均较相应时段对照组增加(P<0.01).结论:ET-1可以同时促进EPC凋亡和增殖,随着干预时间延长,增殖效应逐渐显著.     

神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后分化神经元的形态学观察

目的 观察小鼠胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后新生神经元的分化情况.方法 将表达绿色荧光蛋白的小鼠胚胎干细胞采用无血清方法定向诱导为神经前体细胞,移植至Aβ1-40损伤的大鼠海马齿回,免疫荧光染色观察分化神经元的递质表型、受体表达以及与受者神经元的突触性接触.结果 小鼠胚胎干细胞来源的神经前体细胞移植后能长时间存活并分化为谷氨酸能、γ-氨基丁酸能神经元,表达NMDA受体和GABAA受体;发出类似神经元的长突起伸入到受者脑组织中去,并且在其胞膜和突起周围可观察到大量受者神经元来源的突触素阳性颗粒.结论 神经前体细胞移植Aβ损伤大鼠海马后能分化为不同类型的神经元,与受者神经元之间可能存在突触结构.     

神经前体细胞移植治疗大鼠急性脊髓损伤的功能评价

目的：神经前体细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的行为变化及功能评价。方法：采用改良A11en法建立大鼠脊髓损伤模型，术后9d，实验组脊髓损伤局部注射移植永生化神经前体细胞系G3。采用只注射培养液和不作治疗处理作为对照组。细胞移植后，采用BBB评分进行功能评价，每周评分1次，检测脊髓损伤大鼠后肢运动功能的改变。分别在细胞移植的第8周和第12周进行运动诱发电位的神经电生理检查，检测脊髓的传导功能。结果：实验组移植水生化神经前体细胞后，其BBB评分和对照组相比差异无显著性；但运动诱发电位与对照组相比明显提高。结论：永生化神经前体细胞移植可显著提高大鼠急性损伤脊髓的传导功能恢复。     

内皮祖细胞移植治疗对心肌梗死后心功能的影响

缺血性心肌病(Ischemic cardiomyopathy,ICM)是指由于长期心肌缺血导致心肌局限性或弥漫性纤维化,使心脏收缩和(或)舒张功能受损,引起心脏扩大或僵硬、充血性心力衰竭、心律失常等一系列临床表现的综合征。缺血性心肌病是冠心病类型之一,是由于长期的心肌缺血造成心脏的重塑,以心衰为其结局,严重危害世界人民的健康。对于这类疾病,心脏移植是一种较为理想的治疗方法,但是由于心脏供体少,手术价格昂贵,且术后的免疫排斥反应明显,制约了其在临床的运用。     

静脉输注内皮祖细胞治疗大鼠急性心肌梗死的实验研究

目的:探讨静脉输注体外培养扩增的内皮祖细胞(EPC)对急性心肌梗死大鼠的血管新生、心肌梗死面积以及心功能的影响。方法:分离大鼠骨髓单个核细胞,EBM-2+Single Quots培养基培养,鉴定EPC表面标志,EGFP-Ad标记。建立大鼠急性心肌梗死模型,在心梗后24 h,将体外培养的EPC经尾静脉缓慢注入动物体内。分别在细胞输注后7,14,28 d,检测输注细胞在心肌梗死周边区的分布、新生血管密度、心梗面积以及心功能等多项指标。结果:细胞输注后第7天,EPC治疗组心梗面积(25.08±1.18)%,明显低于对照组的(32.63±1.16)%;细胞输注后第14天时,EPC治疗组梗死周边区可见大量EGFP阳性细胞,并形成管腔样结构,EPC治疗组血管密度为(14.36±1.48)/mm2,明显高于对照组的(6.33±0.69)/mm2;细胞输注第28天,EPC治疗组大鼠各项心功能指标均明显优于对照组。结论:静脉输注的EPC能有效的向心肌梗死周边区募集,形成新生血管,减少心肌梗死面积,促进心功能的恢复。     

内皮祖细胞治疗心肌梗死后心力衰竭患者心肌酶及能量代谢的改变

目的应用粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF）动员内皮祖细胞（endo-thelial progenitor cells,EPCs）治疗心肌梗死后心力衰竭患者,研究其对心肌组织中超氧化物歧化酶（superoxide dis-mutase,SOD）活性、脂质过氧化物（lipid peroxidation,LPO）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）及心肌能量代谢的影响。方法选取38例心肌梗死患者,入院后均接受心肌梗死的常规治疗,随机分成治疗组和对照组。治疗组除常规治疗外还给予动员剂G-CSF（450μg/d）皮下注射,连续注射5天。检测两组治疗前、治疗后第3、7、14、28天外周血EPCs数量;于治疗前、治疗后1个月检测两组SOD、LPO、MDA含量,并行心脏超声检测左心室射血分数（left ventricular ejectionfraction,LVEF）等左心室心功能指标,应用相关公式计算左心室收缩末圆周室壁应力（circumferential end-systolic wallstress,cESS）、心肌能量消耗（myocardial energy expenditure,MEE）。结果治疗组的EPCs数量较治疗前及对照组增加明显,于第7天达到峰值,增加有统计学意义（P〈0.01）;两组患者治疗后心肌能量代谢均好转,心肌组织中SOD活性提高,LPO、MDA生成减少,LVEF升高,cESS下降,MEE水平降低,心功能得到改善,治疗组改善优于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论应用G-CSF动员EPCs治疗心肌梗死后心力衰竭患者,EPCs具有保护缺血心肌,增强SOD活性,抑制LPO、MDA的生成,降低心肌耗氧,有效改善心脏功能的作用。     

人外周血单个核细胞向内皮祖细胞及内皮细胞分化的实验研究

目的 探讨体外分离、培养成人外周血单个核细胞,并将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞的方法.方法 密度梯度离心法提取人外周血单个核细胞,用含有生长因子的内皮培养基将其体外培养、定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟血管内皮细胞;分别用流式细胞技术及RT-PCR通过对内皮祖细胞及内皮细胞表面特异性抗原的检测进行细胞鉴定.结果 分离获得的单个核细胞培养7 d后形成梭状的内皮样细胞,部分细胞积聚成团形成克隆集落,流式细胞仪鉴定该细胞表达内皮祖细胞特异性抗原CD34、CD133及VEGFR.继续培养4周后细胞形成典型铺路石样改变,RT-PCR检测有成熟血管内皮细胞特异性基因vWF、eNOS表达.结论 可成功分离人外周血单个核细胞,并可将其定向诱导分化为内皮祖细胞及成熟内皮细胞.     

冠通方对体外培养内皮祖细胞（EPCs）数量和功能的影响

[目的]观察冠通方含药血清对体外培养的人外周血内皮祖细胞（EPCs）数量和功能的影响。[方法]将24只雄性Wistar大鼠随机分为冠通方组（低剂量组、中剂量组、高剂量组）和对照组,制备含药血清和空白血清。采用密度梯度离心法分离获得人外周血单个核细胞,加入各实验血清组培养液培养EPCs,经激光共聚焦显微镜、流式细胞仪鉴定为EPCs,分别在不同作用时间（12h,24h,48h,72h）后,倒置相差显微镜下观察并比较各组EPCs的数量、增殖能力、迁移能力和粘附能力。[结果]与对照组相比,冠通方组可促进外周血EPCs扩增,并显著改善外周血EPCs的粘附、迁移和增殖能力。[结论]冠通方可增加EPC的数量并改善其功能,这可能是冠通方防治冠心病患者经皮冠状动脉腔内成形术（PTCA）加支架植入术后再狭窄的作用机制之一。     

原发性高血压对循环内皮祖细胞的影响

目的探讨原发性高血压和循环内皮祖细胞(CEPCs)的关系及血压控制对CEPCs的影响。方法选取原发性高血压患者30例,包括血压未控制者和血压控制达标者各15例,并选取15例健康成人为正常对照。采集外周血进行CEPCs的分离、培养,测定CEPCs的数量、增殖能力、黏附能力及凋亡率,并进行比较分析。结果血压控制达标组和血压未控制组的CEPCs数量、凋亡率、增殖能力和黏附能力与正常对照组间差异均有统计学意义(P<0.01);血压未控制组与血压控制达标组的CEPCs数量、凋亡率、增殖能力间差异均有统计学意义(P<0.01),黏附能力间差异无统计学意义(P>0.05)。结论原发性高血压患者CEPCs受损;在规范服用降压药物控制血压达标的基础上,联合应用能够增加CEPCs数目、改善其功能的药物,可能会使原发性高血压患者获取降压外的效益。     

肺动脉高压大鼠循环内皮祖细胞及血浆一氧化氮水平的实验研究

目的探讨肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)模型大鼠循环内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)水平的变化及其与血浆一氧化氮(nitric oxide,NO)浓度的关系。方法利用野百合碱诱导大鼠发生肺动脉高压,使用流式细胞仪对其外周血CD45阴性、CD34/FLK-1双阳性的单个核细胞,以表示循环EPC,同时采用Greiss法对其血浆NO浓度进行检测。利用简单线性回归分析二者之间的关系。结果 PH模型组循环EPC水平明显低于对照组(0.016%±0.007%vs 0.031%±0.011%,t=3.144,P<0.01)。血浆NO浓度亦显著下降(19.66±2.78μmol/L vs 54.31±3.81μmol/L,t=20.784,P<0.01)。二者之间呈正相关(r=0.792,P<0.05)。结论 PH的发生可能与血浆NO浓度降低导致循环EPC水平下调有关。     

大鼠缺血心肌微血管内皮细胞的培养和鉴定

目的 建立大鼠缺血心肌微血管内皮细胞（Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs）培养模型,为进一步研究其生物学特征提供实验基础.方法选取220~280 g成年雄性SD大鼠,结扎法建立心肌缺血模型,植块法培养结扎后24 h、3 d、7 d的心肌缺血模型大鼠CMECs,倒置相差显微镜观察培养细胞的形态学特征,观察不同时间点缺血模型CMECs生长状况,免疫细胞化学方法显示CMECs特异性抗原.结果 镜下观察部分CMECs刚游离出组织块时呈星形或多边形,当细胞生长至亚融合状态呈短梭形并呈铺路石样,部分区域可见管腔样或血管网络状结构,具备典型微血管内皮细胞特征;心肌缺血7 d时,缺血心肌组织CMECs密度最大;免疫细胞化学染色鉴定,Ⅷ因子、CD31相关抗原均为阳性,阳性率分别为（95.1±1.2）%、（95.0±1.6）%.结论 本方法可获得纯度高、结构和功能良好的缺血CMECs,为缺血性心血管疾病研究奠定基础.     

内皮祖细胞的培养与扩增研究进展

内皮祖细胞移植已经成为治疗缺血性疾病的一种新策略,但内皮祖细胞数量不足成为限制其治疗应用的主要障碍。如何培养和有效扩增内皮祖细胞具有十分重要的意义。内皮祖细胞获取的方法繁多,他汀类药物、雌激素、促红细胞生成素等对增加内皮祖细胞数量有着积极的作用,现就此内容进行综述。     

新生小鼠心肌干细胞培养与分化的研究

目的了解新生小鼠心肌干细胞原代和传代的培养及其分化潜能，为缺血及坏死心肌重建的临床应用提供科学依据。方法在无菌超净台中剪取新生小鼠心脏组织，经胰酶反复消化后，弃去消化液，所得剩余组织块用胶头滴管反复吹打后离心，加入培养液培养，待其长满培养瓶后进行传代，传代培养约1周可见搏动的心肌细胞，也可见成团细胞的同步收缩。结果采用改良后的方法从消化后的心肌组织块中成功培养得到原代细胞，进行免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为c—kit、sea-1阳性的细胞，表面不表达CD34、CD8、肌球蛋白重链（MHCⅡ）。细胞经传代培养1周左右，开始出现搏动，也可见成团细胞的同步收缩。再次经免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为c-kit、sea-1阴性，MHCⅡ阳性的细胞，仍然不表达CD34、CD8。结论在原方法的基础上，通过对其进行改良，从心脏中成功分离得到纯度更高、活性更好的心肌干细胞，其表型为c-kit^＋、sea-1^＋、CD34^-、CD8^-、MHCⅡ^-，经过传代培养之后，分化为搏动的心肌细胞，细胞表面标记变为c-kit^-、sca-1^-、CD34-、CD8^-，并表达心肌结构蛋白MHCⅡ。     

糖尿病患者内皮祖细胞功能的研究进展

血管功能损伤是糖尿病心血管并发症发病的关键过程。内皮祖细胞(EPCs)在血管损伤后能够从骨髓动员,向受损的血管部位迁移、归巢,最终分化为内皮细胞,促进血管修复。目前研究发现,糖尿病患者EPCs受损导致的血管再生障碍可能在糖尿病心血管并发症的发病过程中发挥主要作用。该文对高糖诱导EPCs损伤所涉及的机制以及目前改善糖尿病患者EPCs功能的方法进行综述。