猴免疫缺陷病毒(SIV)实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立快速、敏感、特异的猴免疫缺陷病毒(SIV)TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对SIV病毒核酸进行定量检测。方法 RT-PCR扩增SIVmac251保守gag基因序列796 bp片段,进行TA克隆,构建标准品质粒pMD-SIVgag。通过对SIV定量外标准品的定量分析,优化反应体系,检测TaqMan探针实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性。结果所建立的SIV QPCR检测方法,质粒DNA模板在107～102拷贝之间表现较好线性和相关性,标准曲线所得斜率为-3.26,相关系数为0.999。检测灵敏度达到200拷贝,方法重复性测试,检测25份临床样品CV%均小于1%。结论建立的SIV QPCR检测方法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)核酸拷贝量。     

日本2005年实验动物学会第52届年会将召开

目的探讨裸小鼠和SCID小鼠两种免疫缺陷动物人胃癌原位移植后肿瘤生长和转移等生物学特性的差异。方法将MKN-45细胞株接种至裸小鼠皮下,成瘤后采用组织学完整的组织块移植于裸小鼠和SCID小鼠胃壁建立原位移植模型,观察所建模型的原位成瘤率、移植瘤生长、侵袭和转移情况。结果①两种免疫缺陷动物的原位成瘤率都为100%;②裸小鼠原位移植瘤平均体积2884±1337mm3,腹腔淋巴结、肝、肺、膈转移率分别为67%、83%、33%和8%;③SCID小鼠原位移植瘤平均体积4582±1326 mm3(P<0.05),肝转移率90%(P>0.05),与裸小鼠较为接近, 腹腔淋巴结转移率90%,肺和膈转移率分别为100%(P<0.01)和60%(P<0.05)。结论证明应用T、B细胞联合免疫缺陷的SCID小鼠较裸小鼠更适用于建立胃癌的原位移植模型。     

PCR技术在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染模型中的应用

目的(1)建立RT PCR方法,定性测定SIV感染猴血浆中病毒RNA,比较其与传统血浆病毒分离方法的敏感性;(2)建立DNA PCR方法,检测SIV感染猴外周血淋巴细胞(PBMCs)中的前病毒DNA。(3)检验DNA PCR和RNA PCR方法在猴SAIDS模型应用中的实用性和可操作性。方法用SIVmac251静脉感染恒河猴,定期采血,从血浆中提取病毒RNA,以RNA为模板通过RT PCR法扩增,凝胶电泳定性;从感染猴PBMC中提取带有整合的SIV前病毒DNA的细胞基因组DNA,巢式PCR扩增,凝胶电泳定性。结果DNA PCR和RNA PCR经两轮扩增后均得到一长度为477bp的特异条带,测序鉴定确为目的片段。9只实验猴感染SIV后7d,RNA PCR结果为79阳性,DNA PCR结果为100%阳性,而血浆病毒分离只有59阳性;此后一直到感染后的42d,RNA PCR和DNA PCR的结果一直为100%阳性,而血浆病毒分离阳性率在感染后35d下降到49,到42d时下降为零。结论PCR方法比病毒分离方法的敏感性高。尤其是DNA PCR,既可检测具有活跃病毒复制的受感染细胞,又可检测那些携带病毒处于转录休眠期的细胞,所以在感染的早期和中后期———血浆病毒水平较低的情况下或病毒处于潜伏感染的阶段,它作为猴艾滋病(SAIDS)模型病毒学指标之一有其必要性和重要性。这个指标的检测方法应该是较血浆病毒RNA检测更为敏感。     

第60届日本实验动物年会重点科研内容介绍与分析

正2013年5月,随中国实验动物学代表团,参加了第60届日本实验动物科学技术年会。除日本本国研究者外,中国、中国台北、意大利、澳大利亚、韩国、菲律宾、印度、新加坡等多个国家和地区的实验动物界派人参加会议,会议汇集了的近千名实验动物相关领域的科研、技术及管理专家。本次会议共接收了论文及报告投稿200多篇,涉及了实验动物的各个领域。按照不同议题设置5个分会场进行报告,现将其中部分重点内容作一简要介绍与分析,与读者分享。     

发展中的日本实验动物科学——记第39届日本实验动物学会年会

日本实验动物学会第39届年会于1992年5月27日至5月29日在东京都文京区赤坂都市中心召开。本届年会会长是日本动物遗传学家、国立遗传学研究所的森胁和郎教授。此次年会的热点在于动物模型和PCR(多聚酶链反应)技术在实验动物科学中的应用。会议安排了题为“基因导入法育成的动物模型的开发和利用”的公开专题演讲,并邀请美国Jackson实验室的Joseph H.Nadeau教授作了特别演讲,题目是“小鼠基因图的比较和人类疾病动物模型”。在一般演讲中,以动物模型为题的论文占了1/6强。PCR、转基因动物和胚胎冷冻等新技术已被广泛应用于实验动物科学     

第65届日本实验动物学会年会参会及考察活动

正应日本实验动物学会的邀请,由中国实验动物学会组织,多家单位派出的多名研究人员共16人组成的出访团,中国医学科学院医学实验动物研究所党委副书记邓巍博士担任团长、郑州大学医药科学研究院章金涛教授和上海实验动物研究中心谢建芸研究员担任副团长、中国医学科学院医学实验动物研究所于品博     

日本第37回实验动物学会年会见闻

年会于1990年5月23～25日在日本京都公园饭店举行。京都大学山田淳三教授担任本届会长,日本全国1,000多名实验动物工作者出席。整个年会分为特别讲演、招待讲演,一般讲演、讨论会和受奖者讲演等部分。在特別讲演中,京都大学医学部的中西重忠教授作了《用遗传工程和胚胎发生工程学方法对活性多肽在血压调节、神经传导中的作用机理研究》的学术报     

参加第60届日本实验动物年会汇报

正2013年5月14日至19日期间第60届日本实验动物科学技术年会在日本茨城县筑波市召开。应日本实验动物学会邀请,由中国实验动物学会组织,在学会理事长秦川教授的带领下,我荣幸的作为代表团工作人员,参加了这次国际学术交流活动。在本次交流活动中,除了参加于2013年5月15日至17日在日本茨城县筑波市召开的学术交流会议,我们还参观了理化研究所及筑波大学实验动物中心,受到相关负责人的热情接待。日本理化研究所筑波分所同时也是理化研究所的生物资源中心,中心拥有包括实验动物部,植     

参加第60届日本实验动物年会汇报

2013年5月14日至19日期间第60届日本实验动物科学技术年会在日本茨城县筑波市召开。应日本实验动物学会邀请,由中国实验动物学会组织,在学会理事长秦川教授的带领下,我荣幸的作为代表团工作人员,参加了这次国际学术交流活动。     

事业岁岁新——日本实验动物学会第35届年会略记

又到了日本实验动物学会一年一度召开年会的季节。今年的第35届年会于5月18～20日在日本石川县金泽市文化会堂举行。本届年会首次邀请了外国代表参加,盛况空前。共有179名实验动物科学工作者作了报告,7名科学工作者作了专题讲演,另有特别讲演者2名和邀请讲演者2名。特别讲演的题目是:动物模型和汉药研究的新发展——柴胡桂枝汤的抗癌作用机制。在一般报告中,有关动物模型的开发和研究占了很大的比重。日本同行认为,1980年代是开发各种动物模型的时代,近两年的进展是十分快的。     

HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的比较

目的 由于检测SIV p27抗原试剂盒来源困难,有时不稳定,鉴于HIV-1 p24与SIVp27有较强的交叉抗原,本研究比较HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原得出的结果是否存在一定的相关性.方法 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒定性和定量检测样品中SIV p27抗原,并对检测结果进行回归和相关分析.结果 HIV-1 p24和SIV p27两种ELISA试剂盒检测SIV p27抗原的灵敏度分别是150 pg/mL和62.5 pg/mL.两种试剂盒检测病毒液和血浆中SIV p27抗原的定性结果一致.定量结果的统计分析得出病毒液的直线回归决定系数R2=0.857,直线相关系数r=0.926,P＜0.01,直线正相关程度较高;血浆的直线回归决定系数R2=0.512,直线相关系数r=0.716,P＜0.05,直线正相关程度较低.结论 HIV-1 p24 ELISA试剂盒能够替代SIV p27 ELISA试剂盒定性检测病毒液和血浆中SIV p27抗原,但只能定量检测病毒液中SIV p27抗原.     

抗人SOCS3单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的 制备高效价的抗人SOCS3单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定.方法 以重组GST-SOCS3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株.用ELISA及Western blot鉴定单克隆抗体的特性,并测定其效价、Ig亚类及相对亲和力.结果 筛选到一株可稳定分泌抗人SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株.Western blotting显示在相对分子质量为6.3×104处出现特异性反应带.杂交瘤细胞培养上清效价为1:640,腹水效价为1:25600,Ig亚类为IgG2a,相对亲和力达4.84×106 L/mol.结论 成功制备能特异性识别人SOCS3的单克隆抗体,为进一步研究人体细胞因子信号传导的负反馈调节及SOCS3在微生物感染中的免疫调节作用奠定了基础.     

抗蛋白酶激活受体?鄄2单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备出一种具有多种用途的抗蛋白酶激活受体-2(PAR-2)单克隆抗体(mAb).方法:用人工合成的11肽PAR-2作为免疫原,采用皮下多点注射方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞采用间接ELISA法筛选.通过ELISA、Dot blot、免疫组化染色、流式细胞分析、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性.结果:获得1株可稳定分泌抗:PAR-2 mAb的杂交瘤细胞.其分泌的mAb为IgM型,ELJSA法检测杂交瘤细胞培养上清效价为1:16;点杂交分析表明此抗体可特异性结合PAR-2;免疫组化染色显示该单克隆抗体与人肺组织中的肺泡上皮细胞和平滑肌细胞,结肠组织中的腺上皮细胞和疑似淋巴细胞,扁桃体中的淋巴细胞,包皮组织中的鳞状上皮细胞呈阳性反应;流式细胞仪分析显示与人肺腺癌细胞系A549细胞中的PAR-2呈阳性反应;激光共聚焦扫描显微镜观察发现荧光标记的阳性反应物位于A549细胞的胞膜和胞浆.结论:成功地制备出可用于免疫组化和点杂交的抗PAR-2单克隆抗体,为PAR-2相关性疾病的研究提供了有用的工具.     

酵母菌烯醇化酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备并鉴定抗酵母菌烯醇化酶单克隆抗体杂交瘤细胞株.方法用面包酵母烯醇化酶做抗原,用细胞融合技术制备单克隆抗体,并采用ELISA法对单克隆抗体进行筛选和鉴定.结果建立了2株持续分泌抗面包酵母烯醇化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株.其中3G5-F3-F5小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1:12 800;单克隆抗体的重链属IgG1亚类,轻链属K型;Western Blotting证实单抗能与面包酵母的烯醇化酶抗原(4.8×104)特异性地结合.结论本研究建立了抗酵母菌烯醇化酶杂交瘤细胞株单克隆抗体,为快速诊断系统性念珠菌感染打下了实验基础并创造了条件.     

猴免疫缺陷病毒衣壳蛋白p27在大肠杆菌中的表达及纯化

目的获得用于SIV检测的衣壳蛋白p27重组抗原。方法利用生物信息学软件选择衣壳蛋白p27抗原表位集中的区域,合成SIV p27基因;将该基因与pMAL-p5x载体连接构建pMAL-p5x-p27重组质粒,并转化大肠杆菌BL21中,诱导表达;用Amylose Resin亲和层析柱对表达产物进行纯化。结果 SDS-PAGE分析显示,pMAL-p5x-p27重组质粒可在大肠杆菌中高效表达,表达产物分子量约为70×103;经纯化获得目的蛋白p27纯度可达90%。结论本研究利用原核表达系统成功表达了SIV p27蛋白,为SIV检测方法的建立奠定了基础。     

抗人滋养层细胞表面抗原-2单抗的制备及免疫学特性分析

目的:利用杂交瘤技术制备抗人滋养层细胞表面抗原-2(trophoblast cell-surface antigen 2,Trop2)单克隆抗体并鉴定其免疫学特性?方法:以胰腺癌细胞系BxPC3免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合后制备单抗?通过酶联免疫法?免疫荧光?免疫沉淀和质谱分析?流式细胞术?免疫组织化学等方法,鉴定单抗的免疫学特性?结果:通过细胞的融合与筛选,获得了持续分泌抗Trop2单抗的杂交瘤细胞株,该抗体可以识别细胞表面的Trop2膜蛋白,也可用于免疫组化识别人肿瘤组织中的Trop2蛋白,同时该抗体对乳腺癌细胞的生长具有一定的抑制作用?结论:该单抗具有作为Trop2阳性表达肿瘤靶向治疗的潜在应用价值?     

重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备

目的：制备重组创伤弧菌溶细胞素（recombinant Vibrio vulnificus cytolysin,rVVC）鼠源性单克隆抗体,并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定,为创伤弧菌溶细胞素（Vibrio vulnificus cytolysin,VVC）致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法：IPTG诱导含pET28a（＋）-vvhA的大肠杆菌表达rVVC,将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型,ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果：将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后,经ELISA检测,血清有效稀释度达1：12800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为B2C7和E3F4株,其抗体类型均为IgG1,且具有较高特异性,与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应。结论：本研究成功免疫BALB/c小鼠,获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG1型。     

SIV p27单克隆抗体的制备和鉴定

目的建立SIVp27杂交瘤细胞株，并对其分泌的SIVp27单克隆抗体进行初步鉴定。方法使用基因重组的SIVp27蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术使用半固体培养基法建立杂交瘤细胞株，制备单克隆抗体。通过染色体核型对杂交瘤细胞株进行鉴定；采用Western blot、免疫荧光法、酶联免疫吸附法确定单克隆抗体的交叉反应性、相对亲和力、抗原识别表位、免疫球蛋白的类型和亚类。对单克隆抗体进行鉴定。结果获得4株可稳定分泌SIVp27单克隆抗体的杂交瘤细胞，IC3、286为IgG1类，2E12为IgG2b类，3G3为IgG2a类。4株单抗均能识别SIV的p27蛋白，与逆转录病毒SRV、STLV无交叉反应，286、2E12与H1Vp24有交叉反应。免疫荧光法检测腹水效价为1：10240～1：40960。1C3、286、2E12、3G3染色体平均数分别为103、97、96、101。2E12与3G3识别不同的抗原表位。结论成功地制备出4株SIVp27单克隆抗体，均具有良好的特异性和亲和力，为进一步建立免疫分析方法，进行SIV／SAIDS及其艾滋病相关研究，奠定了基础。     

肠道病毒71型VP1蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)VP1外壳蛋白单克隆抗体。方法:利用重组纯化的EV71-VP1蛋白为抗原免疫BALB/c鼠,按常规杂交瘤技术进行细胞融合,对阳性杂交瘤细胞进行筛选及亚克隆,获得1株能稳定分泌抗EV71-VP1抗体的杂交瘤细胞株6F2B9,细胞体外扩大培养后的上清用Protein G柱纯化,超滤后用BCA法测其浓度,用免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体亚型,间接ELISA方法检测其效价和特异性,间接免疫荧光法检测其与EV71病毒的特异性结合能力。结果:本研究得到的抗EV71-VP1抗体DSE-136,纯化后浓度为1.9 g/L,免疫球蛋白亚类为IgG2b,轻链属于κ链;间接ELISA检测效价为1∶3.2×105;间接免疫荧光结果显示其可与EV71病毒特异性结合。结论:成功制备出1个效价高、特异性好的抗EV71-VP1单克隆抗体DSE-136,为VP1抗原诊断、疫苗研发及其效果评价奠定了基础。     

分泌抗人原发性肝癌单克隆抗体杂交瘤的制备及专一性分析

研制抗人原发性肝癌特异性单抗，为肝癌的导向诊断与治疗奠定基础。用人ＰＨＣ细胞系ＨｅｐＧ２免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，聚其脾细胞与同源骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，经间接免疫荧光染色加流式细胞仪筛选及专一性鉴定，单抗经ＰｒｏｔｅｉｎＡ法纯化。用ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度测定。