单纯疱疹病毒1型糖蛋白B基因疫苗的构建

目的：构建用于治疗和预防单纯疱疹病毒性角膜炎的核酸疫苗,探讨单纯疱疹病毒1型糖蛋白B(HSV-1gpB)基因作为基因疫苗的可能性。方法：利用PCR技术从HSV-1 SM44毒株基因组中扩增出编码HSV-1gpB去除N端部分信号肽序列(39 bp)的基因片断（2 673 bp）,定向插入真核表达质粒pcDNA3载体中,构建出重组真核表达质粒pcDNA-gpB,并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。 结果：双酶切重组质粒pcDNA-gpB,电泳可见两条带,分别为目的基因（2 700 bp）和线性质粒pcDNA3（5 400 bp）; 以重组质粒pcDNA-gpB为模板进行PCR扩增,在2 700 bp位置扩增出特异的产物;测序结果表明,克隆基因插入方向正确,与GenBank中登录的HSV-1 F株gpB基因序列比较,同源性达99.5%。 结论：利用PCR技术从HSV-1 SM44株基因组中扩增出编码HSV-1gpB去除N端部分信号肽序列（39 bp）的基因片断（2 673 bp）, 成功地构建了HSV-1基因疫苗pcDNA-gpB。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒Ⅰ型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础.方法:应用PCR方法从HSV-Ⅰ基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD.结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%.结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒.     

实验猕猴B病毒抗体检测结果分析

目的 研究实验猕猴B病毒抗体阳性情况.方法 选取安徽省实验猕猴中心400只猕猴,各采集静脉血5 mL, 3000 r/min离心10 min后,抽取上层血清,采用酶联免疫吸附试验与免疫酶试验检测血清B病毒抗体,观察B病毒抗体阳性率.结果 400份有效样本中,B病毒抗体阳性率为36.50%;雌性猕猴B病毒抗体阳性率为36.74%,雄性为为36.22%,两者差异无统计学意义(χ2=0.012,P=0.913).幼年猕猴B病毒抗体阳性率为30.68%,青年猕猴B病毒抗体阳性率为32.34%,成年猕猴B病毒抗体阳性率为66.67%,差异有统计学意义(χ2=26.200,P=0.000).结论 实验猕猴B病毒抗体阳性率处于较高水平,雌性猕猴B病毒抗体阳性率高于雄性猕猴,成年猕猴B病毒抗体阳性率较高.因此,需加强实验猕猴的管理,以减少B病毒感染,生产出安全性更高的实验猕猴.     

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D酵母表达载体的构建

目的:构建含有单纯疱疹病毒I型包膜糖蛋白D全基因片段的克隆载体及酵母表达载体,为进一步真核表达重组gD蛋白奠定基础。方法:应用PCR方法从HSV-I基因组中扩增糖蛋白D的全长基因,产物回收后与pMD-18T载体连接,并转化,经氨苄筛选及测序,建立克隆载体pMD18T-gD;克隆载体与表达载体双酶切后,产物连接、转化大肠杆菌JM109,筛选、测序后确定构建了酵母表达载体pGAPZαA-gD。结果:重组质粒pMD18T-gD和pGAPZαA-gD经PCR和酶切均出现相应长度的片段,测序结果证实为gD基因,序列分析同源性为99.66%。结论:成功构建了含有单纯疱疹病毒I型糖蛋白D全基因的克隆载体及酵母表达质粒。     

单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步研究

目的：构建、制备Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白D重组质粒DNA疫苗,初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果,为HSV-1新型疫苗奠定基础。方法：用PCR的方法从HSV－1病毒基因组中扩增糖蛋白D（glycoprotein D,gD)基因,利用基因重组技术构建重组质粒;将重组质粒体外转染真核细胞COS－7,Western blotting检测表达产物;于BALB／C小鼠后腿胫前肌注射免疫,0、2周名免疫1次,100μg/次。初次免疫后0,2,4,6周眼眶采血,ELISA间接法检测抗体。结果：重组质粒酶切出相应大小片段,经测序证实为HSV－1gD序列。Western blotting证实能够在体外真核细胞中表达。免疫小鼠后,产生特异性抗体,抗体滴度1：2000。结论：HSV-1gD重组质粒DNA有可能作为HSV－1的DNA疫苗,用于防治HSV－1感染及其相关疾病。     

HSV-1糖蛋白B和糖蛋白D的T细胞表位重组核酸疫苗的构建及其免疫原性

目的 构建Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1)糖蛋白B(gB)和糖蛋白D(gD)的T细胞表位重组核酸疫苗,并研究其作为核酸疫苗的免疫原性.方法 登录免疫表位数据库(IEDB),查阅已发表的无症状表位,联合运用SYFPEITHI、IEDB等生物信息学软件,预测潜在的HSV-1 gB和gD的T细胞表位.将已知表位和预测表位串联,...     

单纯疱疹病毒I型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步研究

目的构建、制备Ⅰ型单纯疱疹病毒糖蛋白Ｄ重组质粒ＤＮＡ疫苗，初步检测其诱导机体产生体液免疫应答的效果，为研制ＨＳＶ－１新型疫苗奠定基础。方法用ＰＣＲ的方法从ＨＳＶ－１病毒基因组中扩增糖蛋白Ｄ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄ，ｇＤ）基因，利用基因重组技术构建重组质粒；将重组质粒体外转染真核细胞ＣＯＳ－７，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测表达产物；于ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠后腿胫前肌注射免疫，０、２周各免疫１次，１００μｇ／次。初次免疫后０、２、４、６周眼眶采血，ＥＬＩＳＡ间接法检测抗体。结果重组质粒酶切出相应大小片段，经测序证实为ＨＳＶ－１ｇＤ序列。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ证实能够在体外真核细胞中表达。免疫小鼠后，产生特异性抗体，抗体滴度１∶２０００。结论ＨＳＶ－１ｇＤ重组质粒ＤＮＡ有可能作为ＨＳＶ－１的ＤＮＡ疫苗，用于防治ＨＳＶ－１感染及其相关疾病。关键词单纯疱疹病毒角膜炎ＤＮＡ疫苗糖蛋白Ｄ     

单纯疱疹病毒Ⅰ型DNA疫苗的构建

目的 构建表达单纯疱疹病毒1型糖蛋白D的DNA疫苗。方法 采用聚合酶链式反应（PCR），从HSV-1基因组中扩增出gD基因，插入中间载体pGEM-T，然后克隆入真核表达载体pcDNA3.1，构建重组质粒pLy-D，经部分测序和限制性内切酶分析证实，将pLy-D转染Cos-7细胞，并肌肉接种ICR小鼠。用免疫组化和ELISA方法分别检测gD蛋白表达及小鼠血清中的特异性抗体。结果 转染的Cos-7细胞中有gD蛋白的表达；经三次肌肉免疫接种的小鼠血清中有特异性HSV-1抗体产生，结论 本研究构建的重组质粒pLy-D能够在哺乳动物细胞中表达目的蛋白，免疫接种后可以诱导动物产生免疫反应。     

热休克蛋白70-Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D DNA疫苗的构建及表达

目的：针对Ⅱ型单纯疱疹病毒（HSV-2）包膜糖蛋白D（gD）,以热休克蛋白70（Hsp70）为载体,构建pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗。方法：将Hsp70和HSV-2gD蛋白的基因分别克隆至真核表达载体pVAX,构建成重组质粒pVAX-Hsp70-gD并测序鉴定。重组质粒pVAX-Hsp70-gD转染COS-7细胞,用免疫组化、SDS-PAGE和West-ern blotting方法鉴定重组质粒的表达情况。结果：测序证实重组质粒序列正确,表达产物的SDS-PAGE分析发现,在相对分子量为92 000处有外源蛋白表达,与预期蛋白带一致。免疫组化方法和Western blotting也证明,构建的重组质粒能在COS-7细胞内表达。pVAX-Hsp70-HSV2gD组核酸疫苗免疫的小鼠,其脾淋巴细胞培养上清中γ-干扰素的水平高于其他组（P〈0.05）。结论：成功构建了pVAX-Hsp70-HSV2gD DNA疫苗,为其进一步的研究打下了基础。     

单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗的构建及初步免疫观察

目的 构建用于防治单纯疱疹的核酸疫苗并观察其免疫效果。方法 用PCR反应,从HSV-F株基因组DNA中扩增出gD蛋白的全部编码序列,将其插入pcDNA3.1（ ）的PCMV下游,构建HSV gD核酸疫苗,并用酶切分析和测序鉴定;通过中和试验、ELISA方法和攻击试验检测是用pLy-D三次肌肉接种小鼠的免疫效果。结果 经鉴定证实了HSV gD核酸疫苗pLy-D的构建,实验小鼠产生了对HSV-1特异性的抗体（抗体滴度：ELISA法1：203,中和试验法1：37）。并经受了HSY-1病毒的攻击（存活率：70%）。结论 成功构建出了HSV gD核酸疫苗pLy-D,用其接种小鼠可以诱导产生特异性免疫反应,并具有良好的保护作用。     

猕猴B病毒囊膜蛋白gD基因真核细胞表达载体? 的构建及表达

目的 构建猕猴B病毒囊膜蛋白gD的真核表达载体, 并且检测其在293T细胞内的表达情况。 方法 首先通过基因合成手段获得含B病毒gD蛋白的基因片段, 在经由PstⅠ和NotⅠ双酶切后连接到pEGFP-N3载体, 随后将构建的pEGFP-N3-GD重组质粒转染到人胚胎肾上皮细胞系293T细胞。再用Western blot检测所提蛋白其在细胞内的表达情况, 并用激光共聚焦分析其在细胞内的表达定位情况。 结果 成功获得携带gD基因的阳性重组质粒pEGFP-N3-GD, 且pEGFP-N3-GD重组质粒能在293T细胞的表面正常表达。 结论 利用真核表达系统, 既能够在细胞表面产生B病毒gD蛋白的特异性重组抗原, 而且可用于B检测抗原的制备。     

猕猴B病毒gC蛋白特异性抗原表位的合成和表达

目的获得B病毒gC蛋白的特异性表位抗原。方法利用长片段基因合成的方法,合成B病毒C蛋白的特性抗原表位基因,将该基因连接到pMAL-5x载体,转化到BL21受体菌进行表达,并纯化表达产物。结果成功的获得了B病毒gC蛋白的特异性抗原蛋白,该蛋白以可溶的形式表达。结论利用原核表达系统,可以产生B病毒gC蛋白的可溶性抗原,可以作为B病毒的检测抗原。     

猕猴B病毒gB蛋白特异性抗原表位的合成和表达

目的获得可以用于B病毒检测的gB蛋白特异性表位重组抗原。方法利用基因合成的方法,合成包含B病毒gB蛋白主要特性抗原表位的基因,通过定向克隆的方法,将该基因克隆到原核表达载体pET-22b中,构建了重组表达质粒。筛选出阳性重组质粒,转化到BL21感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。结果成功的获得了B病毒gB蛋白的特异性抗原蛋白,该蛋白以可潜的形式表达。结论利用原核表达系统,可以产生B病毒gB蛋白特异性表位重组抗原,可以作为B病毒的检测抗原。     

B病毒糖蛋白的原核表达及ELISA检测方法的建立

目的表达B病毒糖蛋白,筛选出具有较好检测敏感性和特异性的抗原或抗原组合,用以检测猴血清中的抗体。方法原核表达B病毒糖蛋白C,D和G,经纯化、复性后用蛋白印记验证其抗原性,建立ELISA法,对方法进行评价。结果3个表达抗原反应特异性较好;以BV-ELISA为标准,各抗原的检测敏感性分别是：BVgC-ELISA84.6％,BVgD-ELISA88.5％,BVgC＋gD-ELISA96.2％,检测特异性分别是：BVgC-ELISA93％,BVgD-ELISA85.7％,BVgC＋gD-ELISA64.3％。结论表达的3个BV重组抗原都具备作为替代抗原检测BV抗体的潜力。     

猴源GII.17型诺如病毒基因组P结构域及其变体的原核表达、纯化和抗原性鉴定

目的 表达、纯化和鉴定猴源GII.17型诺如病毒(NoV)基因组P结构域及其变体蛋白.方法 基于本实验室获得的猴源GII.17型NoV基因组P结构域的核苷酸序列,按大肠杆菌密码子使用的偏好性优化P结构域的核苷酸序列,人工合成相应的基因.以此基因为模板,通过PCR方法扩增得到P结构域的变体基因.采用无缝连接的方法将P结构域基因及其变体克隆到原核表达载体,进行蛋白诱导表达和纯化.最后,通过免疫印迹法和ELISA法分析表达蛋白的抗原性.结果 测序结果表明,P结构域及其变体成功地克隆至原核表达载体.SDS-PAGE分析显示,P结构域在原核细胞的超声裂解上清和沉淀中都有表达,而其变体主要表达于上清.免疫印迹和ELISA结果显示,表达纯化得到的P结构域及其变体蛋白具有很好的抗原性.表达的蛋白免疫小鼠制备的相应抗体ELSIA效价可达到1∶32000.结论 成功地表达了猴源GII.17 NoV基因组P结构域及其变体蛋白,并且通过免疫小鼠得到了相应的抗体,为后期检测试剂盒的研发、病毒鉴定和病毒受体结合实验奠定了基础.     

乙型肝炎病毒血清前S1抗原的检测及其临床意义

目的:探讨乙型肝炎病毒与前S1抗原的相关性。方法:采用ELISA检测419例乙型肝炎病毒感染者血清中的前S1抗原。结果:在172例HBeAg阳性标本中前S1抗原阳性的140例,阳性率81.4%;200例HBeAg阴性而抗HBe阳性的标本中前S1抗原阳性的76例,阳性率38.0%;47例HBeAg和抗HBe均阴性的血清中前S1抗原阳性仅10例,阳性率21.3%;前S1抗原在血清学表达上与HBeAg的阳性符合率高达81.4%。结论:乙型肝炎病毒前S1抗原与HBeAg阳性高度相关,血清前S1抗原是乙肝病毒在体内复制的可靠标志。     

狂犬病病毒糖蛋白在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的 表达狂犬病病毒糖蛋白(GP),用于狂犬病疫苗免疫抗体评估和狂犬病病毒糖蛋白功能的研究. 方法 采用分析软件,分析其可能的抗原表位,利用PCR方法 扩增狂犬病病毒SRV9疫苗株G蛋白抗原位点区域基因,PCR产物经EcoRI和SalI双酶切后,插入大肠埃希菌表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a.将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞中,在IPTG诱导下表达目的 蛋白,进行SDS-PAGE分析.表达蛋白进行电洗脱纯化和Western blot鉴定分析.结果 成功构建了pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a表达质粒,序列分析表明,插入片段大小分别为1314 bp和1275 bp.SDS-PAGE分析结果 证明,在大肠埃希菌系统中成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达的融合蛋白含有GST标签,大小分别约为74×103和73×103.Western blot鉴定结果 表明,表达产物有抗原特异性并能与狂犬病病毒抗血清反应.结论 利用大肠埃希菌表达系统成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达产物有良好的反应原性.     

狂犬病病毒糖蛋白在酿酒酵母中的分泌表达

目的 使狂犬病病毒糖蛋白在酿酒酵母中获得分泌表达,为制备口服狂犬病疫苗奠定基础.方法 克隆狂犬病病毒糖蛋白基因,与菊粉酶信号肽序列连接为融合基因InG,该融合基因克隆至pYes2载体Gal1启动子下游,构建成诱导分泌表达载体pYes2-InU-G,该重组载体转化酿酒酵母筛选阳性克隆,阳性重组子经半乳糖诱导12 h后,收集上清进行SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定.结果 RT-PCR和Western-blot鉴定显示狂犬病病毒糖蛋白已获得分泌表达,并且具有良好的抗原性.结论 CVS24病毒株的糖蛋白在酿酒酵母中获得分泌表达且具有良好的抗原性,为进一步研究重组酵母能否在消化道中存活并继续进行分泌表达提供了研究条件.     

猴B病毒PCR检测方法的建立

目的　建立检测猴血B病毒的PCR方法。方法　根据MakotoH报道的引物 ,用PCR方法直接扩增猴血B病毒及扩增经Vero细胞培养后的猴血B病毒 ,扩增产物连于pGEM T载体。结果　这四对引物可同时对猴血B病毒及经Vero细胞培养后的猴血B病毒进行扩增 ,扩增结果一致 ,对扩增片段克隆测序的结果证实 ,其与美国猴B病毒E2 4 90株同源性为 10 0 %。结论　建立了从血样中直接检测猴B病毒DNA的PCR方法。