HSP70在苯并(a)芘致细胞DNA损伤中的保护作用

[目的]研究热休克蛋白70(HSP70)对苯并(a)芘[B(a)P]所致肺腺癌细胞A549的DNA损伤的保护作用。[方法]用含HSPTO基因cDNA的pcDNA3．0／HSP70重组质粒转染A549细胞,提高A549细胞HSP70表达水平,以空载体质粒pcDNA3．0转染作载体对照。对肺腺癌A549细胞(A549)、空载体质粒pcDNA3．0转染A549细胞(A549／pcDNA)和HSP70过表达A549细胞(A549／HSP70),用不同浓度的B(a)P(1、5、10、50、100μmol／L)染毒24h,MTT法测定细胞存活率、单细胞琼脂糖凝胶电泳检测细胞DNA损伤。用溶剂二甲基亚砜处理细胞组作为未染毒细胞组。[结果]B(a)P染毒作用时,A549/HSP70细胞在50、100μmol／L浓度组存活率明显高于A549细胞。A549、A549／pcDNA和A549/HSP70细胞的DNA损伤程度都伴随B(a)P染毒浓度增加而增加。与各自未染毒细胞相比,染毒A549和A549／pcDNA细胞的Olive尾矩值均有明显增加(P<0．05),A549／HSP70细胞在5、10、50、100μmol／L浓度时,Olive尾矩值明显升高(P<0．05)。与A549细胞组相比,在各染毒浓度下,A549/HSP70细胞Olive尾矩值均有降低(P<0．05)。A549／pcDNA细胞Olive尾矩值均无明显改变。[结论]HSP70对苯并(a)芘所致肺腺癌细胞A549的DNA损伤具有保护作用。     

槲皮素抑制HSP70表达对紫外线C致DNA损伤的影响

目的研究热休克蛋白70(HSP70)在紫外线C致DNA损伤中的保护作用。方法用254 nm紫外线不同照射剂量(10,20,40,80 J/m2)照射槲皮素(quercetin)抑制HSP70表达的A549细胞株(A549/quercetin),用Western-blot检测HSP70的水平,用碱性单细胞凝胶电泳检测DNA损伤,用彗星细胞率和Olive尾矩评价DNA损伤情况。A549细胞作为正常对照组,DMSO处理作为溶剂对照组(A549/DMSO)。结果无论在A549组、A549/DMSO组,还是在A549/quercetin组,DNA损伤的彗星细胞率随着紫外照射的剂量增加而逐渐增加,在10 J/m2时,未观察到HSP70的保护作用,3组的彗星细胞率差异无统计学意义;在20 J/m2照射时,可以观察到HSP70的保护作用,但不明显;40 J/m2照射时,观察到HSP70对DNA有很明显的保护作用;80 J/m2照射时,HSP70的保护作用又逐渐地消失了。进一步分析40 J/m2照射的Olive尾矩显示,与A549组或A549/DMSO组相比,A549/quercetin组Olive尾矩明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论HSP70能保护细胞免受一定剂量范围内的紫外线C照射引起的DNA损伤。     

姜黄素介导MAPK信号通路对非小细胞肺癌细胞Bcl-2、Bcl-xl及Bax蛋白表达的影响

目的 研究姜黄素介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路对非小细胞肺癌细胞Bcl-2、Bcl-xl及Bax蛋白表达的影响。方法 对非小细胞肺癌A549细胞实施体外培养、分组,并用10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L姜黄素处理24 h后,借助显微镜对A549细胞形态结构进行观察;通过MTT法、流式细胞仪对A549细胞增殖抑制率、凋亡率进行测定,经免疫细胞化学法测定MAPK的阳性表达,免疫印迹法测定Bcl-2、Bcl-xl、Bax蛋白表达。结果 姜黄素组的非小细胞肺癌A549细胞增殖抑制率高于对照组(P <0.05);姜黄素组的非小细胞肺癌A549细胞凋亡率高于对照组(P <0.05);姜黄素组的非小细胞肺癌A549细胞内MAPK阳性表达率低于对照组(P <0.05)。姜黄素组A549细胞内Bcl-2、Bcl-xl蛋白浓度低于对照组,Bax蛋白浓度高于对照组(P <0.05)。结论 姜黄素能介导MAPK信号通路,通过下调Bcl-2、Bcl-xl,上调Bax蛋白表达,抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进癌细胞凋亡。     

热休克蛋白70的表达在二氢二醇环氧苯并(a)芘致DNA损伤中的作用

目的研究热休克蛋白70（HSP70）的表达在二氢二醇环氧苯并（a）芘（BPDE）致DNA损伤中的作用。方法培养人肺腺癌A549细胞，作如下处理：BPDE染毒组：以不同剂量BPDE（0、2、4、8pmol／L）染毒2h；预热＋BPDE染毒组：细胞预热（42℃ 2h，37℃恢复1h）后，再按BPDE染毒组同样处理，各组均设溶剂对照。采用单细胞凝胶电泳技术和Western blot法分别检测DNA的损伤情况与HSP70的表达。结果（1）DNA损伤情况：BPDE染毒组DNA损伤程度随BPDE染毒剂量增加而加强，明显高于溶剂对照，差异有统计学意义（P〈0．01），组间相互比较，差异亦有统计学意义（P〈0．01），且DNA损伤程度与BPDE染毒剂量呈正相关（r=0．96，P〈0．05）；预热＋BPDE染毒组DNA损伤程度随BPDE染毒浓度递增，与预热溶剂对照相比，差异有统计学意义（P〈0．01），但在4、8μmol／L的BPDE组间，DNA损伤程度的差异无统计学意义（P〉0．05），与BPDE染毒组比较，各剂量下DNA损伤程度均明显增加。（2）HSP70表达情况：BPDE染毒组在2、4μmol／L的BPDE作用时HSP70表达逐渐升高，与溶剂对照相比，差异有统计学意义（P〈0．05），但在8μmol／L剂量时，表达下调，与溶剂对照组相比，差异无统计学意义（P〉0．05）；预热＋BPDE染毒组HSP70的表达均比预热溶剂对照明增加，在4μmol／L的BPDE作用时HSP70表达水平最高，与2、8μmol／L剂量组相比，差异有统计学意义（P〈0．05）。与BPDE染毒组相比，各剂量下HSP70的表达水平均明显增加，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论HSP70对BPDE所致A549细胞DNA损伤的保护作用并不明显。     

热化联合对肺癌A549细胞生长、c-Jun N-末端激酶磷酸化及热休克蛋白70表达的影响

目的研究热化联合对肺部肿瘤生长的影响及其可能的机制。方法采用临床常用剂量(43℃加热联合50μg/L紫杉醇),通过单纯化疗、单纯热疗及热化联合的方法处理肺癌A549细胞,以未处理的A549细胞作对照,应用噻唑蓝比色法检测各处理方式下细胞增殖率的变化,进行损伤修复实验观察比较各组细胞的侵袭力,并通过蛋白免疫印记法检测JNK磷酸化和热休克蛋白70(HSP70)的表达。结果热化联合组细胞增殖率低于单纯化疗、单纯热疗及热化联合加JNK抑制剂SP600125组(P<0.05),而热化联合加SP600125组的细胞增殖率与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);热化联合组的细胞侵袭力较其他组有所减弱;热化联合组JNK磷酸化的水平高于对照组及单纯化疗组(P<0.05);HSP70在热化联合组的表达低于单纯热疗组(P<0.05)。结论热化联合对肺癌A549细胞生长增殖的抑制作用强于单纯热疗和单纯化疗,这种抑制作用可能是通过激活JNK信号通路或抑制HSP70的表达完成的。     

甲醛致A549细胞DNA-蛋白质交联及其修复效应

目的 探讨甲醛诱导DNA-蛋白质交联作用及其修复效应.方法 于37℃条件下,以不同浓度的液态甲醛(0、50、100、200、400、800、1 600 μmol/L)对培养人类肺肿瘤(A549)细胞(对数生长期)染毒1 h后,检测A549细胞的DPC系数.于37℃下对100 μmol/L液态甲醛染毒1 h的A549细胞的DPC修复0、6、12、18、24 h,设1个空白对照组,并检测A549细胞的DPC系数.采用KCI-SDS沉淀法检测DPC系数.结果 与溶剂对照组(0 μmol/L)比较,100、200、400、800、1 600μmol/L甲醛染毒组A549细胞的DPC系数均较高,差异有统计学意义(P＜0.05).50 μmol/L甲醛染毒组A549细胞的DPC系数与溶剂对照组相比虽有升高趋势,但差异无统计学意义(P＞0.05).经过100 μmol/L的液态甲醛给A549细胞染毒后,0 h修复组DPC系数高于空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).液态甲醛诱导A549细胞产生的DPC经过6、12和18 h修复后,DPC系数与0 h修复组相比虽有下降趋势,但差异均无统计学意义(P＞0.05);经过24 h修复后,DPC系数低于0 h修复组,差异均有统计学意义(P＜0.05),但与空白对照组相比,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 较高浓度的甲醛可以明显诱导DPC形成,甲醛所致的DPC可以得到修复.     

硫酸镉诱导人胚胎肝细胞热应激蛋白70表达及氧化应激的研究

目的研究硫酸镉诱导人胚胎肝(L-02)细胞热应激蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)表达及氧化应激作用,以探讨HSP70表达与细胞抗氧化作用的关系。方法将对数生长期的L-02细胞分别暴露于终浓度为0(对照,双蒸水)、1、2、4、8、16、32、64、128μmol/L的硫酸镉溶液培养24 h,采用MTT法测定细胞活性。将对数生长期的L-02细胞分别暴露于含终浓度为0(对照,双蒸水)、1、2、4μmol/L硫酸镉的培养基中,培养24 h后,检测细胞裂解液中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、超氧化物歧化酶(SOD)的活力和丙二醛(MDA)的含量以及细胞HSP70的表达。结果与对照组比较,2～128μmol/L硫酸镉染毒组L-02细胞的存活率降低,差异有统计学意义(P0.05);且随着硫酸镉染毒浓度的升高,L-02细胞的存活率呈下降趋势明显。与对照组比较,4μmol/L硫酸镉染毒组L-02细胞SOD、GSH-Px活力均上升,差异有统计学意义(P0.05);而各浓度硫酸镉染毒组L-02细胞内MDA的含量均无明显变化。随着硫酸镉染毒浓度的升高,L-02细胞内HSP70蛋白的阳性表达呈上升趋势。结论在本研究剂量下,硫酸镉可诱导L-02细胞株HSP70表达上调,引起细胞抗氧化活性增强。     

硝酸铅诱导大鼠肝组织及L-02细胞热应激蛋白70基因表达的研究

目的 研究铅诱导热应激蛋白70(HSP70)基因表达的变化.方法 以5、10、20μmol/L硝酸铅染毒胚胎肝细胞株L-02细胞,运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增技术观察HSP70 mRNA表达的变化.将Wistar大鼠以180、60、20mg/kg3个剂量染毒硝酸铅,并设正常对照组,每组16只,雌雄各半,连续染毒28 d;运用RT-PCR扩增技术观察肝组织HSP70 mRNA表达的变化,并用原子吸收光谱法检测动物肝脏铅含量.结果 在L-02细胞未出现明显细胞毒作用的20μmol/L染铅组HSPT0基因表达明显上调.大鼠肝组织HSP70 mRNA表达与硝酸铅浓度呈剂量-反应关系,180、60 mg/kg染铅组HSP70 mRNA表达明显增加,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);20 mg/kg染铅组与对照组的差异无统计学意义(P＞0.05).各染铅组大鼠肝脏铅含量较对照组明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 硝酸铅能够诱导大鼠肝组织及L-02细胞HSP70 mRNA表达明显增强.     

hOGG1基因低表达对氢醌的细胞毒性及遗传毒性的影响

目的 探讨hOGG1基因低表达对氢醌(HQ)的细胞毒性及遗传毒性的影响.方法 0、5、10、20、40、80μmol/L浓度的(HQ)染毒A549细胞和hOGG1基因低表达的A549-R细胞,噻唑蓝比色法检测2种细胞存活率,荧光法测定2种细胞内活性氧(ROS)含量,微核试验分析2种细胞染色体损伤,彗星试验观察细胞的DNA损伤和修复.结果 随着HQ染毒浓度的增加,2种细胞的存活率均下降,A549-R细胞和A549细胞IC50分别为160.49和228.42 μmol/L,且差异有统计学意义(P＜0.05).0、5、10、20、40、80 μmol/L HQ染毒组A549-R细胞ROS含量、微核率均明显高于A549细胞,差异有统计学意义(P＜0.05);各浓度HQ染毒组A549-R细胞拖尾率和Olive尾距(OTM)值均明显大于A549细胞,并有剂量-反应关系,差异有统计学意义(P＜0.05).hOGG1基因低表达的A549-R细胞比A549细胞对HQ引起的DNA损伤修复更慢,修复2.0 h后才出现拖尾率和OTM值的明显降低,3.0 h后仍未完全修复.结论 氧化损伤可能是HQ毒作用的机制之一,hOGG1基因低表达可增加A549-R细胞对HQ的敏感性.     

硝酸铅诱导L-02细胞HSP70表达及氧化应激的研究

目的研究硝酸铅诱导人胚胎肝细胞株L-02细胞热应激蛋白70(HSP70)表达以及细胞氧化应激的变化,并探讨HSP70表达与抗氧化作用的关系。方法以0、10、20和40μmol/L硝酸铅染毒人胚胎肝细胞株L-02细胞,以免疫组化技术观察HSP70表达的变化,并检测L-02细胞裂解液超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物还原酶(GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)含量的变化。结果 20、40μmol/L硝酸铅组L-02细胞未出现细胞毒作用,HSP70出现阳性表达,且40μmol/L剂量组呈明显阳性;同时40μmol/L剂量组SOD活力高于对照组(P0.05)。结论该研究剂量的硝酸铅能够诱导L-02细胞HSP70表达明显增强,且细胞抗氧化作用增强。     

锌促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖及分化

目的　研究锌对体外培养大鼠成骨细胞增殖和分化的影响。方法　从大鼠颅骨分离出成骨细胞,于 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 培养基中进行传代培养。实验设置４ 个组,分别为对照组和１０ μｍｏｌ／ Ｌ、２５ μｍｏｌ／ Ｌ及５０ μｍｏｌ／ Ｌ Ｚｎ２ ＋ ３ 个剂量组,采用３ Ｈ Ｔｄ Ｒ 参入法确定成骨细胞在不同时点 Ｄ Ｎ Ａ 的合成状况,应用流式细胞仪技术分析细胞周期、３ Ｈ脯氨酸参入法测定胶原蛋白的合成;采用酶动力学和放免方法分别测定碱性磷酸酶活性和骨钙素含量。结果　３ 个锌剂量组细胞３ Ｈ Ｔｄ Ｒ 掺入量在各个时点均明显高于对照组;２５ μｍｏｌ／ Ｌ 及５０ μｍｏｌ／ Ｌ Ｚｎ２ ＋ 可以促进成骨细胞从 Ｇ０／ Ｇ１ 期向 Ｓ期转化。３ 个锌剂量组胶原蛋白、骨钙素的合成量、碱性磷酸酶活性均高于对照组。结论　锌能够促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖及分化。     

MK-siRNA对人乳腺癌细胞的生长、粘附及迁移能力的影响

目的:探讨siRNA MK转染对乳腺癌MCF-7细胞增殖和转移能力的影响。方法:构建特异性抑制Midkine基因siRNA片段,转染至乳腺癌MCF-7细胞中,CCK-8法比较细胞增殖能力的改变,体外迁移实验比较细胞运动能力的改变,基质胶粘附实验比较细胞粘附率的变化。结果:MK表达下调后,MCF-7细胞的增殖能力明显降低(P<0.05),体外迁移能力显著降低(P<0.05),siRNA细胞对基质胶的粘附率明显降低(P<0.05)。结论:MK基因表达下调能降低乳腺癌细胞迁移运动和降低细胞对基质胶的粘附率,并降低肿瘤细胞的增殖,提示MK在乳腺癌恶性进展中起重要作用。     

环孢素A对滋养细胞生物学行为的良性调节作用

环孢素A（CsA）是一种强效免疫抑制剂,在临床上被广泛应用于防治器官移植后排斥反应和治疗某些自身免疫性疾病。体外研究发现,低浓度CsA既能促进滋养细胞增殖、减少滋养细胞凋亡,也能增强滋养细胞的迁移与侵袭。体内研究发现,低剂量CsA可明显降低自然流产模型小鼠的胚胎吸收率,改善妊娠结局。这些研究结果提示,低剂量CsA对滋养细胞的生物学行为具有良性调节作用,有可能成为防治自然流产、子痫前期等滋养细胞功能异常导致的妊娠相关疾病的一种新策略。     

微囊藻毒素-LR对人肝癌HT17细胞周期及细胞凋亡的影响

目的 研究微囊藻毒素-LR(MC-LR)对人肝癌HT17细胞周期、凋亡的影响及其可能的作用机制.方法 调整HT17细胞密度为1×104/孔,分别设终浓度为0(溶剂对照,0.1%DMSO)、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、2.0、5.0μmol/L的MC-LR染毒组和去铁敏(DFO,1 mmol/L)染毒组以及...     

人早孕流产蜕膜细胞的原代培养研究

目的建立纯度较高的适于实验研究的人蜕膜细胞。方法胶原酶I消化法培养人蜕膜细胞,光镜、扫描电镜、透射电镜观察细胞内部结构,间接免疫染色进行细胞鉴定。结果倒置显微镜下,可见细胞呈不规则多角形,呈片状铺展生长,核大卵圆形,胞质透明、糖原丰富,内质网扩张明显。免疫组化法检测细胞功能性指标胎盘催乳素,有99%培养的蜕膜细胞呈阳性。结论该法简便易行,可获得合乎实验要求的人蜕膜细胞,为进一步开展实验研究建立细胞模型。     

烹调油烟对小鼠骨髓细胞和睾丸细胞染色体畸变率影响的研究

用自动吸入烹调油烟（ＣＯＦ）的染毒方法研究各剂量组ＣＯＦ对昆明种小鼠骨髓细胞和睾丸初级精母细胞畸变率、骨髓细胞染色体畸变率的影响。结果显示：吸入ＣＯＦ的各剂量组小鼠骨髓细胞和睾丸初级精母细胞畸变率明显增高，中、高剂量与阴性对照组相比差异显著，而且呈剂量反应关系。表明ＣＯＦ进入体内后，既具有体细胞诱变性，也能透过血睾屏障，具有生殖细胞的诱变性。     

MYCT-1基因特异的siRNA对GES-1细胞凋亡,增殖及细胞周期的影响

目的探讨沉默MYCT-1基因对GES-1细胞凋亡、细胞周期及细胞增殖的影响。方法采用siRNA转染GES-1细胞后分别应用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响,应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变,应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测siRNA对细胞增殖的作用。结果siRNA转染GES-1细胞后,与对照细胞相比,细胞凋亡率明显增高(P<0.05);细胞增殖率降低(P<0.05),细胞周期检测表明细胞停滞于S期(P<0.05)。结论MYCT-1基因维持一定的表达水平对于正常细胞生长调控是必需的,MYCT-1基因对细胞周期的调控主要体现在S期向G1期的转变过程。     

不同浓度幽门螺杆菌对胃癌上皮细胞SGC-7901生长的影响

[目的]探讨幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)对体外培养胃上皮细胞的增殖与凋亡作用.[方法]6种浓度Hp标准株NCTC11637分别感染SGC-7901细胞,观察细胞形态,测定增殖细胞核抗原(PCNA)表达、细胞增殖指数(PI)和凋亡率.[结果](1)Hp感染细胞形态均出现早期细胞凋亡的特征性改变; (2)Hp≥9.6×105 cfu/ml时,细胞凋亡率显著升高(P＜0.01); (3)细胞PCNA表达率和PI在Hp≤1.9×105 cfu/ml时明显增高(P＜0.05);而Hp≥4.8×106 cfu/ml时显著降低(P＜0.05).[结论]Hp感染可直接诱发胃上皮细胞的增殖与凋亡,增殖与凋亡的菌量依赖性不同.     

细胞内快速连续传代培养甲肝病毒的研究

目的:研究甲肝病毒在细胞内快速连续传代培养病毒增殖情况,探索疫苗生产工艺改进的可能性。方法:将甲肝病毒吕8株感染KMB17细胞后形成带毒细胞,每7 d传代1次,检测每次收获物的甲肝病毒抗原(HAAg)滴度及感染性滴度,比较滴度的变化,同时检测一步生长曲线,分析病毒增殖特性有无变化。结果:甲肝病毒吕8株感染KMB17细胞后每7 d传代1次,其第1~8代抗原滴度为1 024~2 048 Eu/0.1 ml,感染性滴度为7.33~7.67 lg CCID50/ml,第9代开始下降,抗原滴度仅为256 Eu/0.1 ml,感染性滴度为6.83~7.00 lg CCID50/ml;在连续传10代内,细胞均未出现CPE现象;第10代与第1代相比,其一步生长曲线病毒增殖高峰均为20~25 d,没有明显变化。结论:甲肝病毒吕8株在KMB17细胞上每7 d传代1次,在第8代以内,其抗原滴度及感染性滴度均能达到较高的程度。经细胞内连续快速传代后,HAV吕8株生长的增殖高峰约为第20~25 d,与传代前样品没有明显差别。     

成人成肌细胞的分离与体外培养

目的 建立一种优化的体外成人成肌细胞分离与原代培养方法.方法 首先用两步消化法对取自成人骨骼肌组织进行消化获取相对较纯的成肌细胞,通过差速贴壁法进行进一步的纯化,并对获取的成肌细胞进行细胞形态学观察、免疫组织化学、透射电镜鉴定及生长曲线的绘制与分析.结果 该方法可获取高纯度的成肌细胞,且在体外可快速稳定增殖.结论 该方法所获取的成肌细胞可为Duchenne肌营养不良的治疗、血友病、血栓闭塞性脉管炎(伯格氏病)、心肌梗死和慢性心衰的基因治疗的研究提供一种充足、可靠的实验靶细胞.