弓形虫HT分离株ROP5蛋白基因的克隆、序列分析及其表达研究

目的克隆和表达弓形虫虎源分离株（HT株）ROP5蛋白基因。方法运用RT—PCR技术从弓形虫HT株中扩增出ROP5基因，将其克隆人T载体中进行测序和分析．并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1650bp，编码549个氨基酸。其中前24个氨基酸构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比，有12个核苷酸有差异，导致7个氨基酸发生改变，两者核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99．2％和98．9％。转化重组质粒pETROP5的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG的诱导下，可表达出相对分子质量为64800的重组蛋白，并且能与弓形虫抗体发生血清学反应，表达量占菌体蛋白的15．6％。结论成功克隆和表达了弓形虫HT株ROP5蛋白基因，表达的重组蛋白具有良好的反应原性。     

弓形虫虎源分离株ROP10基因的克隆、序列分析及其表达研究

采用RT-PCR技术从弓形虫虎源分离株中扩增出ROP10基因,将其克隆入pMD18-T载体中进行测序和生物信息学分析,并将目的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中进行诱导表达。该基因全长1761bp,编码586个氨基酸,其中前28个氨基酸残基构成信号肽序列。与GenBank中报道的RH株相比,16个核苷酸存在变异,导致7个氨基酸发生改变,但两者N-联糖基化位点的数量和位置没有差异,两虫株核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分别为99.2%和98.8%。转化重组质粒pETROP10的大肠杆菌BL21(DE3)在IPTG的诱导下,可表达出分子量为67.6 kDa的重组蛋白,表达量占菌体蛋白的13.8%。     

产肠毒素D金黄色葡萄球菌的筛选及其基因克隆和蛋白表达

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素D基因（entD），表达和纯化其重组蛋白（rSED），以进一步制备抗rSED抗体，研制SED金标免疫快速检测试纸条。方法利用PCR技术．从野生型金黄色葡萄球菌中筛选产肠毒素D金黄色葡萄球菌标准株，扩增entD基因，克隆至pGEM—T Easy载体．亚克隆至原核表达载体pET28a，重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导表达蛋白，Ni-NTA亲和层析纯化蛋白，免疫印迹检测抗原活性。结果分离获得1株产肠毒素D金黄色葡葡球菌标准株．成功克隆entD序列．测序表明该基因共684bp，与其他entD序列（GenBank登陆号：M28521）具有99％的同源性。rSED蛋白在大肠杆菌中得到高效的可溶性表达。免疫印迹结果表明．rSED蛋白能被抗天然SED抗体识别。结论通过基因重组技术制备的重组SED蛋白具有良好的免疫反应性。     

人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。     

汉坦病毒部分S基因在毕赤酵母中的分泌表达

目的 构建并表达汉坦病毒(HV)Z10株(HV-Z10)S基因蛋白编码区前300 bp核苷酸序列,研究该基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其产物的生物活性.方法 根据HV-Z10 S基因前300 bp(S300)的核苷酸序列,按照编码氨基酸的密码子转换成酵母偏爱的形式,设计合成8条引物,通过连续PCR,获得人工合成Z10株S基因前300 bp的基因序列SP300,经测序,SP300与S300的核苷酸相似性为76.2%,但编码的氨基酸序列完全一致.将SP300克隆到酵母穿梭载体pPICZaA,构建含α-factor分沁信号肽的重组表达载体pPICZaA-SP300.将pPICZaA-SP300、pPICZaA-S300化学法转化酵母GS115菌株,筛选重组转化子.结果 重组了SP300与S300的酵母转化子经甲醇诱导,表达出重组蛋白rNP300及rN300,SDS-PAGE显示相对分子质量为12×10~3左右.经ELISA检测及Westem Blot分析,表达产物能与抗汉坦病毒抗体起免疫反应.结论 SP300和S300基因在毕赤酵母中获得分泌表达,使用酵母偏爱密码子的SP300基因在毕赤酵母中的表达量与S300的表达量基本一致,表达量在诱导24 h后最高.     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7 espA基因的克隆与表达

目的 通过DNA重组技术表达肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7的EspA蛋白，并分析其免疫学性质。方法 采用PCR技术从EHEC O157：H7基因组中扩增espA基因，T／A法克隆，连接至pET-28a（＋）载体上，转化宿主细胞E．coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，亲和层析法纯化目的蛋白，SDS-PAGE测定其相对分子质量，同时分析其N端氨基酸序列，免疫家兔鉴定其抗原性。结果 重组espA基因片段的测序结果与GenBank上基因序列只有1个碱基不同，一致性为99．83％，所编码的氨基酸序列没有改变。重组EspA蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达，表达量约30％。免疫家兔所得抗体滴度为1：32。结论构建高效表达EspA蛋白的重组载体pET-28a（＋）-espA，表达的蛋白具有良好的免疫原性，为进一步制备亚单位疫苗奠定基础。     

地方株HPV16L1基因免疫小鼠诱发的抗体反应

为了检测pcDNA-L1的表达，评价地方株HPV16L1基因诱导的体液免疫反应。我们采用PCR技术从宫颈癌组织中获得HPV16L1基因，以pGEM-Teasy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1，进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析，再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1(-)中，构建重组pcDNA-L1，转染Cos-7细胞，通过IFA试验验证L1蛋白的表达。     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应（PCR）方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain—like基因片段，构建原核表达载体，诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入SalI和EcoRI酶切位点。应用FIT—PCR扩增弓形虫RH株Calpain—like基因片段，插入pGEM—T载体，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，亚克隆到原核表达质粒pET32a，重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子eDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段；含pET32a／Calpain—like的重组质粒在宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain—like基因，弓形虫Calpain—like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

血管性血友病因子裂解酶金属蛋白酶域的克隆和表达

目的:克隆和表达血管性血友病因子裂解酶(vWF-cp)的金属蛋白酶域。方法:应用PCR从含有人vWF-cp金属蛋白酶域的质粒中扩增出该区域,克隆至pUC18载体后行序列分析,并将其重组于带有6×HisTag的融合蛋白表达载体pET28a(+)中,在大肠杆菌DE3／plySs中诱导表达。融合蛋白经Ni-NTA柱纯化后,采用Westernblot印迹鉴定。结果:PCR扩增得到658bp的vWF-cp金属蛋白酶域的基因片段,测序结果与GenBank序列一致。重组表达质粒经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导5h后表达的融合蛋白占菌体总蛋白的28％,进一步纯化后其纯度在95％以上。结论:在大肠杆菌中高效表达了人vWF-cp的金属蛋白酶结构域,为深入研究vWF-cp结构与功能的关系奠定了基础。     

鼠疫F1蛋白原核分泌性表达及鉴定

目的构建重组质粒,在大肠杆菌中表达鼠疫菌F1抗原。方法用PCR方法扩增出带有信号肽的F1基因,将其克隆到表达载体pET30a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3);用IPTG诱导目的基因表达,层析方法纯化F1蛋白,测定其分子量、等电点、N末端氨基酸序列,用Westernblot法检测其抗原性。结果根据双酶切和DNA测序结果显示,F1基因成功连接到表达载体pET30a(+)中,F1蛋白主要为分泌性可溶表达。测定纯化后F1蛋白的相对分子量约为15.6kD,等电点为4.15,N末端氨基酸序列与理论序列一致。经Westernblot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了F1蛋白分泌性原核表达系统,所表达的重组F1蛋白具有较好的抗原性,为新型鼠疫疫苗研制提供基础。     

重组幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的高效表达及其初步纯化

目的 在大肠杆菌中高效表达幽门螺直菌的热休克蛋白A基因（hspA)，并对其初步纯化。方法 用巢式PCR扩增hspA基因。经测序证实后，克隆于表达载体pIM-1中，转化大肠杆菌。以SDS－PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达，并测定N－端氨基酸的序列。采用固相镍离子亲和层析，对重组hspA进行初步纯化。结果 扩增的hspA基因为357bp，并在大肠杆菌中得到高效可溶性表达。重组蛋白的表达量最高可达细菌总蛋白的60．5％。免疫印迹及氨基酸测序结果证实，表达产物为幽门螺杆菌hspA亚单位。固相镍离子亲和层析初步纯化的重组HspA的纯度为87．8％，结论 hspA亚单位的高效表达与初步纯化，为批量获得Hp亚单位抗原打下了基础。     

北京地区2000-2004年分离的呼吸道合胞病毒B亚型株G蛋白基因的序列分析

目的 了解近年来北京地区流行的B亚型呼吸道合胞病毒（BSV）G蛋白的基因特征。方法 2000年冬季至2004年冬季自首都儿科研究所附属儿童医院收集的急性呼吸道感染患儿呼吸道标本，从中分离到B亚型RSV毒株，每年随机选取1至2株毒株，用RT-PCR扩增其G蛋白全基因后克隆至pBS-T载体中，筛选出阳性克隆后测序，并与B亚型标准株（CH18537）和文献报道的毒株序列进行比较分析。结果 所测毒株G蛋白全基因核苷酸长度分别为915、921和981bp，推导的氨基酸长度分别为292、293、312和315从。分离株与B亚型标准株CH18537间存在着明显的差异，CH18537株同分离株间的核苷酸的同源性为91．9％～93．7％，氨基酸的同源性只有85．0％～89．0％。分离株间核苷酸的同源性为93．4％～98．8％，氨基酸的同源性为88．2％～98．6％。氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端，而胞内区和跨膜区相对保守。此外，在进行G蛋白基因分析的8株B亚型分离毒株中，我们发现有3株BSVG蛋白在490～495位核苷酸缺失，3株RSVG蛋白在c末端791位后出现了60个核苷酸的插入，导致C末端259位后出现20个氨基酸的插入。这60个核苷酸与相邻的前60个核苷酸高度重复，只出现3至4个核苷酸的差异。该3株分离株与文献报道的有60个核苷酸插入的两株（S00-4和BA4128／99B）核苷酸和氨基酸同源性分别为97．5％～98．6％和95．5～98．1％，在插入的20个氨基酸中，有高达50％（9～10个氨基酸）左右的丝氨酸和苏氨酸氧连接的糖基化位点。结论 RSVB亚型G蛋白基因变异存在着多样性，分离株既有核苷酸替代，又有基因缺失和插入，还有糖基化位点的改变和氨基酸长度的改变。这种变异使G蛋白高度糖基化，提示最终可能导致病毒抗原性的改变。北京分离的有60个核苷酸插入的变异株与日本及西班牙报道的变异株有非常近的亲缘关系，提示这种G蛋白基因中有60个核苷酸插入的B亚型变异株已经在子代病毒中形成稳定遗传并在世界范围内传播。     

HGV E1区5′端基因的克隆、序列分析及表达

通过ＲＴ－ＰＣＲ从庚型肝炎患者血清中扩增出庚型肝炎病毒Ｅ１区５′端基因Ｅｐ，经限制性内切酶消化后克隆入ｐＵＣ１９质粒中。序列分析结果表明，该基因与中国河北株相关基因核苷酸的同源性为９２％。将该基因亚克隆入原核表达载体ｐＥＸ３１ｂ中，成功地构建了ｐＥＸ３１ｂ－Ｅｐ重组质粒，经４２℃诱导表达，在Ｍｒ２００００处可见一条明显的表达带，表达产物约占总菌体蛋白的８％。经蛋白铜染洗脱法纯化蛋白，ＥＬＩＳＡ检测表明，该蛋白具有抗原性。     

斑点热群立克次体HL-93株ompA蛋白基因片段的克隆及序列分析

以根据立氏立克次体（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ，Ｒｒ）分子量为１９０×１０~３蛋白抗原基因序列设计的一对引物Ｒｒ １９０．７０ｐ和Ｒｒ １９０．６０２ｎ，用聚合酶链反应技术从斑点热群立克次体ＨＬ－９３株染色体ＤＮＡ中扩增出了１９０×１０~３蛋白基因的部分片段。通过载体质粒ｐＧＥＭ－Ｔ将该部分基因片段克隆进入了大肠杆菌ＪＭ１０１，并进行了核苷酸序列分析。通过与已报道的立氏立克次体、日本立克次体１９０×１０~３蛋白基因该部分片段的ＤＮＡ序列进行比较发现：ＨＬ－９３株立克次体与立氏和日本立克次体该部分ＤＮＡ分别有３１和２４个核苷酸不同，与这两种立克次体该部分ＤＮＡ的同源性分别为９４％和９５．４％。根据改变的核苷酸推定的与这两种立克次体的氨基酸序列的同源性分别为８７％和８９％。序列分析表明ＨＬ－９３株立克次体属于斑点热群立克次体新成员。     

狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白基因的克隆和重组腺病毒的构建

克隆了狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白(GP)基因，并进行了GP全基因序列测定和对比分析。结果显示CVS-N2c GP基因编码区长1575bp，编码524个氨基酸，与国内外发表的狂犬病毒疫苗株3aG株、ERA株、和HEP-Flury株GP基因的核酸序列同源性分别为89．0％，89．3％，94．5％，而推导的氨基酸序列同源性分别为87．6％、88．4％、和91．2％。在此基础上，用pAdEasy载体系统构建了表达GP基因的重组腺病毒。电镜下确定重组病毒颗粒的直径约70nm，Western blot显示重组病毒表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒血清识别，表达的GP蛋白分子量约为66kD，与天然的狂犬病毒GP的分子量相符。该表达CVS-N2c毒株GP基因的重组腺病毒是筛选有效狂犬病毒基因工程疫苗的基础。     

猫α-synuclein蛋白的表达纯化及生物学特征分析

目的对猫突触核蛋白(α-synuclein)进行克隆、表达及纯化,并探讨其生物信息学特征。方法在Genebank中α-synuclein基因的保守区域内设计引物,从猫脑c DNA文库中PCR扩增得到猫的α-synuclein基因,再将此基因双酶切后克隆到p ET28a原核表达载体中,构建重组质粒,测序正确的重组质粒转化BL21(DE3)大肠杆菌,采用IPTG诱导表达。然后对猫α-synuclein氨基酸的同源性和疏水性进行分析。结果实验成功从猫脑c DNA文库中扩增出α-synuclein基因,基因全长381个碱基,编码126个氨基酸。获得的全长基因成功克隆进入p ET28a,最后转染大肠杆菌BL21(DE3),获得可溶性表达的α-synuclein蛋白质,蛋白质分子量为13.12k D,与预期分子量一致。生物信息学分析显示猫α-synuclein蛋白与人源及鼠源α-synuclein氨基酸具有很高的同源性,分别为87.35%和83.15%,但是与鼠和人的氨基酸序列比较,猫α-synuclein氨基酸缺失41~54位氨基酸。蛋白质结构预测显示猫α-synuclein具有很好的疏水性,有助于诱导表达时形成可溶性蛋白,这一结果在本研究中得到证实。结论本研究首次克隆了猫α-synuclein基因,并在大肠杆菌中实施了可溶性表达,为后期研究α-synuclein的进化、蛋白晶体结构、生物学功能和帕金森动物模型的构建奠定了一定的基础。     

广州地区HCMV低传代临床病毒株UL143基因的多态性研究

目的研究广州地区人巨细胞病毒（HCMV）临床低传代分离株UL143基因的多态性。方法对3株经多重PCR鉴定的HCMV临床低传代分离株进行HCMV UL143基因全序列扩增，扩增产物克隆到pMD18-T载体上测序，并将其序列与GenBank中公布的其它临床分离株UL143基因一起进行分析。结果D3株UL143基因因碱基缺失形成多处终止密码无法产生有功能的蛋白；Toledo株UL143基因开放读码框由279个核苷酸组成．编码蛋白由92个氨基酸残基组成：其它临床分离株UL143基因开放读码框均由252个核苷酸组成。DNA序列比较保守，变异均为碱基替换。编码蛋白由83个氨基酸残基组成，氨基酸序列也很保守，不同临床分离株氨基酸变异率为1．2％-2．4％：HCMV UL143蛋白翻译后修饰位点在除Toledo株之外的所有分离株中均高度保守．没有缺失或新增；不同临床分离株UL143蛋白二级结构有所不同；除Toledo株外，其余分离株UL143蛋白的等电点均为8．75。结论临床低传代分离株HCMV UL143基因DNA及其编码产物的氨基酸序列极为保守。但仍存在一定多态性。     

鸡蛋主要过敏原卵类粘蛋白基因的克隆及原核载体构建与表达

目的:本研究利用PET表达载体克隆,表达鸡蛋主要过敏原卵类粘蛋白基因,为鸡蛋过敏疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了一定的基础.方法:提取鸡输卵管组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增卵类粘蛋白基因(ovomucoid,OVM),并与已知序列进行同源性比较,将该片段连接入原核表达载体pET-28a,IPTG诱导表达目的蛋白.结果:成功克隆鸡蛋主要过敏原卵类粘蛋白(ovomucoid,OVM)的全长基因,该基因的开放阅读框长度为633 bp(包括终止密码子),编码210个氨基酸,与GenBank提供的OVM基因序列同源性达99%.该序列编码的蛋白为小分子量蛋白,相对分子质量约为21 kD,与理论值均相符.IPTG诱导表达后,SDS-PAGE 分析表明目的蛋白在宿主大肠杆菌BL21 (DE3) 中高效表达.结论:本研究采用体外重组的方法克隆出卵类粘蛋白基因,并实现在大肠杆菌中大量表达,这为后续鸡蛋食品基础性研究奠定基础.     

恶性疟原虫海南株翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因在M15中的表达

获得翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因后与表达载体pQE-30重组,然后转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导后表达TCTP融合蛋白,薄层扫描结果显示目的蛋白占菌体总蛋白的23.4%,目的蛋白中可溶性蛋白所占比例高于非溶性蛋白。Ni-NTA纯化后C端测序,结果C端13个氨基酸序列与由GenBank国际基因库中恶性疟原虫TCTP基因推导出的C端13个氨基酸序列及组成完全一致。结果表明成功地在M15中表达了恶性疟原虫海南株TCTP基因,为进一步研究提供了实验材料。