银染mRNA差异显示方法的建立

目的：建立银染mRNA差异显示方法，为差异表达基因片断的分离克隆奠定基础，方法：采用随机引物和锚定引物各1条，建立差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT－PCR）和银染方法，对DDRT－PCR过程中各实验影响因素进行优化，割取差异条带进行二次扩增。结果：当总RNA用量为0．2ug，引物浓度为0．6－1．0umol/L,dNTP浓度为200unmol/L,MgCl2浓度为1．6－2.0mmol/L，时，同时起始5个循环的退火温度为50℃，扩增效率最佳，特异性好，背景 干净，结论：DDRT－PCR方法简便，灵敏，高效，可用于分离差异表达基因。     

人骨肉瘤差异表达基因的筛选

目的 研究人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的差异表达基因，探讨骨肉瘤的基因改变，为建立骨肉瘤的基因诊断方法打下基础。方法 采用mRNA差异展示技术，应用3条锚定引物和8条随机引物从人骨肉瘤组织与正常骨组织中分离出差异表达基因，对其进行,是序，用打点杂交技术证实其是否为差异表达基因，将筛选出差异表达基因在GenBank检索进行序列同源性分析。结果 筛选及克隆出6条差异条带，为ZOL03，ZOL51，1C82，1C74，2A21及2G12，RNA打点杂交证实它们在骨肉瘤中表达，在正常骨组织中不表达。6条差异片段经序列测定，在GenBank数据库中进行序列相似性分析，证实ZOL03，ZOL51同源性极低，1C82，1C74，2A21，2G12同源性较低，此6条片段为新基因序列ORF finder分析未发现具有开放读框，均属于非编码区序列，其中ZOL03和ZOL51两个序列在GenBank数据库中登录，接受号为BI894276和BI936370。结论 分离并克隆了人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的6条差异表达基因，同源性差，均确认为新基因，可能是骨肉瘤差异表达相关基因。     

介绍cDNA基因和差异表达基因的克隆技术

cDNA文库的构建是克隆cDNA基因重要的方法，方法的发展经历了置换合成法、SMART方法、固相cDNA文库的构建和逆转录病毒cDNA表达系统构建。细胞内分布克隆方法用于克隆功能性基因。而差异表达基因克隆方法用于克隆不同生命状态下表达基因。     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的：克隆小鼠血管抑素(Angiostatin)cDNA，构建其真核表达载体pCMV-Angiostatin重组质粒，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法：根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列，用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Angiostatin cDNA，连接pMD18T载体测序，经测序证实后，通过中间栽体pKS，构建pCMV-Angiostatin重组质粒。结果：测序表明扩增的Angiostatin cDNA序列与报道基本一致，Angiostatin cDNA正确插入表达载体。结论：成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建。     

CFTR基因在小鼠肠道组织中的差异表达

本试验旨在研究肠道组织CFTR基因表达与分泌性腹泻发生的关系。选取昆明小鼠24只,雌雄各半,随机分为3组（每组8只）：对照组经小鼠腹腔注射0.2mL生理盐水,试验组小鼠经腹腔注射LPS（6mg/kg.BW）分别作用1h、8h,于注射后通过小鼠精神状态、肠道组织形态学判定分泌性腹泻模型的建立,利用荧光定量PCR法检测各段肠道组织CFTR基因的表达。结果发现,LPS成功诱导小鼠发生了分泌性腹泻;CFTR基因在小鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠组织中均有不同的表达丰度,以结肠最高,但各段肠道间差异不显著;与对照组相比,LPS上调了十二指肠、空肠和回肠CFTR基因的转录,下调了结肠CFTR基因的转录。提示肠道组织CFTR基因转录水平的上调与LPS诱导分泌性腹泻的发生密切相关,且在各肠段发挥的作用不同,其中空肠在Cl-分泌中发挥主要作用,结肠的作用最弱。     

冷应激大鼠肾上腺差异表达基因的克隆

目的 分离常温生活ＳＤ大鼠和－１０℃冷应激４ｈ大鼠肾上腺的差异表达基因。方法 取同一祖父母的近效系Ⅲ组ＳＤ大鼠,将实验组在－１０℃冷应激４ｈ,取大鼠肾上腺采用ｍＲＮＡ差异展示技术分离差异表达条带。将差异条带克隆、测共分离出差异条带１６２条,５９条为新表达的差异片段,４７条为高表达的差异带１６２条,５９条为新表达的差异片段,４７条为高表达的差异片段,３６条为弱表达的差异片段,２０条为实验组未表达条带     

小鼠Lin28基因的克隆及原核表达

目的 探讨获取小鼠Lin28蛋白的方法.方法 提取8.5 d ICR小鼠胚胎mRNA后反转录为cDNA序列,用一对两端引入特定酶切位点(Nco Ⅰ及Xho Ⅰ)引物,从该cDNA中扩增出Lin28基因编码区序列;将获得的Lin28基因编码区序列克隆到pMD18-T载体上.对质粒双酶切回收其中Lin28基因片段,与pET-30a(+)载体相连接并转化Rosetta( DE3)型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,最后采用SDS-PAGE对表达结果进行分析.结果 对所克隆的Lin28蛋白编码区的DNA序列分析表明,Lin28 CDS区包括终止密码子在内为630 bp,与参照DNA( NM_145833)相比同源性为99.37％,与参照氨基酸序列相比同源性为100％;在IPTG诱导下pET-30a(+)-Lin28重组质粒可表达与预期相符的约为27.5×103的蛋白质.结论 利用克隆的小鼠Lin28基因,采用原核表达方法,成功获得小鼠Lin28蛋白,为进一步开展以重组蛋白诱导体细胞重编程研究奠定基础.     

蜂胶黄酮对衰老小鼠胸腺bcl-2、bax基因mRNA表达的影响

目的：研究蜂胶黄酮对D-半乳糖致衰老小鼠胸腺bcl-2、bax基因mRNA表达的影响,探讨蜂胶黄酮的抗衰老机制。方法：用D-半乳糖建立衰老小鼠模型,以蜂胶黄酮治疗,RT-PCR法观察小鼠胸腺bcl-2、bax基因mRNA表达。结果：与正常对照组比较,模型组bcl-2基因表达降低,bax基因表达升高,差异有统计学意义（P〈0.01）;与模型组比较,治疗组bcl-2基因表达升高,bax基因表达降低,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论：蜂胶黄酮能增加衰老小鼠bcl-2基因表达,降低bax基因表达,具有抗衰老作用。     

糖尿病小鼠胚胎早期发育的差异表达基因

目的利用小鼠糖尿病模型,探讨母体糖尿病环境对早期胚胎基因表达的影响。方法ICR雌性小鼠腹腔注射150mg／kg剂量STZ诱发糖尿病,与正常雄鼠交配受孕,取14d胎龄的胚胎,提取胚胎的总RNA。将Cy3和Cy52种荧光分别标记到实验组和对照组的RNA上,制成RNA探针,并与包含24859个基因的表达谱芯片进行杂交及扫描,重复3次实验,采用Agilent扫描仪进行扫描软件读取数据。结果筛选出差异表达基因397个,其中有328个基因在实验组表达量比对照组大2倍,69个基因在实验组表达量比对照组小2倍。结论母体糖尿病环境能影响早期胎儿的基因表达,通过上调代谢相关基因和下调发育相关基因影响小鼠胚胎的早期发育。为深入探讨糖尿病胚胎病理和代谢疾病的分子机理提供了基本数据和研究的方向。     

冷应激大鼠垂体差异表达基因的克隆

0　引言　冷暴露机体变化机制及其预防措施的研究一直是特殊环境医学研究的重要课题 [1 ] .在冷应激条件下 ,机体变化非常广泛、复杂 ,研究结果也很凌乱 ,无法整理出一个系统性结论 .任何机体酶和蛋白质的差异 ,其根本是基因表达的差异 .研究表明 ,冷应激时 ,机体变化的基础就是基因表达的变化 ,但是有关的研究报道至今尚未见到 .如果能成功分离出冷应激时机体的特异表达基因 ,对于提高冷环境作业能力、防治冷损伤都具有十分重要的意义 .我们采用 m RNA差异展示技术 ,分离正常生存环境和低温环境下的大鼠垂体差异表达基因 ,从而为从分子水…     

基因芯片技术筛选大鼠ARDS差异表达基因的研究

目的 用全基因表达谱芯片技术筛选大鼠急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的差异表达基因并对其进行分析,以进一步阐明ARDS发病的分子机制.方法 分别从正常和ARDS大鼠肺组织中提取总RNA,分离纯化mRNA,经逆转录合成掺入生物素标记的cDNA探针,然后与基因芯片(涵盖27044转录本,代表22012个基因)杂交,扫描芯片荧光信号图像,用Sam3.0进行统计处理,用博奥生物分子功能注释系统V4.0进行功能分析.随机选择3个差异表达基因,用荧光定量KT-PCR.验证.结果 芯片检测结果显示,在ARDS大鼠肺组织中,表达上调1.5倍以上的基因有73个,下调1.5倍以上的基因有298个.其中,代谢相关基因上调的有1个,下调的有34个;免疫相关基因上调的有3个,下调的有7个;信号传导相关基因上调的有2个,下调的有9个;神经相关的基因上调的有3个,下调的有3个.结论 全基因表达谱芯片技术是筛选AR.DS差异表达基因的有效方法,用该法筛选出一些差异表达基因,为初步阐明ARDS的发病机制奠定了基础.     

小鼠趋化因子CXCL10真核表达载体的构建

应用RT—PCR方法，从小鼠脾脏T细胞的mRNA中，扩增获得编码小鼠趋化因子CXCL10的cDNA，并加上人单核细胞趋化蛋白1的信号肽基因，将其克隆到Pucm—T载体，经酶切及测序鉴定，进而构建CXCL10重组真核表达载体。采用脂质体法体外转染COS-7真核细胞，经Western blot和趋化指数检测，转染细胞能够表达CXCL10蛋白，其上清对淋巴细胞具有趋化作用。CXCL10的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用奠定了基础。     

利用Tet-OnTM基因表达系统直接克隆p53下游基因

目的直接克隆p53下游基因,并对其功能进行初步研究.方法采用哺乳动物细胞诱导表达系统-Tet-onTM基因表达系统,建立p53基因诱导表达可调控的细胞系;通过mRNA差异显示技术直接克隆p53下游基因,并利用原位杂交技术检测其在小鼠胚胎发育过程中的表达.结果克隆到一个新的p53下游基因侯选基因,并检测到它在小鼠胚胎发育过程中有特异性表达.结论直接克隆p53下游基因的成功,为进一步研究p53基因的功能奠定了基础.     

有无上皮细胞共培养条件下前列腺增生间质细胞的基因差异表达

目的 研究前列腺增生间质细胞在有无上皮细胞共培养条件下的基因差异表达.方法 利用前列腺间质与上皮细胞共培养模型及DDRT-PCR技术,对单独培养的前列腺增生间质细胞和与上皮细胞共培养的前列腺增生间质细胞的mRNA进行差异表达分析,获得差异表达片段(ESTs);并对这些ESTs进行斑点杂交印迹分析及克隆测序,将所测阳性克隆的cDNA序列与网上公用核苷酸数据库中的已知序列进行同源性比较.结果 得到差异表达片段44个;经同源性分析,有29个ESTs与已知基因有较高同源性,15个ESTs为新的cDNA片段.结论 前列腺增生间质细胞在有无上皮细胞共培养条件下,存在差异表达基因,这些基因可能在前列腺间质细胞与上皮细胞的相互调控中发挥作用.     

Gene cloning of murine α-fetoprotein gene and construction of its eukaryotic expression vector and expression in CHO cells

Summary To clone the murine α-fetoprotein (AFP) gene, construct the eukaryotic expression vector of AFP and express in CHO cells, total RNA were extracted from Hepa 1–6 cells, and then the murine α-fetoprotein gene was amplified by RT-PCR and cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3. 1. The recombinant of vector was identified by restriction enzyme analysis and sequencing. After transient transfection of CHO cells with the vector, Western blotting was used to detect the expression of AFP. It is concluded that the 1.8 kb murine α-fetoprotein gene was successfully cloned and its eukaryotic expression vector was successfully constructed. YI Jilin, male, born in 1953, Professor     

人骨肉瘤中5个新基因片段在不同骨肿瘤中的差异表达

目的 筛选数个在人骨肉瘤中检出率高的差异表达基因片段并探讨其临床意义。方法 以筛选出5个新基因片段作为研究对象，采用RT－PCR技术检测37例骨肉瘤，68例其他骨肿瘤及19例截除肢体上的正常骨组织标本。结果 在37例骨肉瘤中，表达检出率高的5个片段依次为：ZOL03为92．6％，1C82为89．4％，1C74为73．9％，2G12为66．5％，2A21为53．7％；在23例骨软骨瘤中表达率依次为：ZOL03为6．5％，1C82为14．7％，1C74为8．3％，2G12为11．9％，2A21为12．2％；在29例骨巨细胞瘤中表达率依次为：ZOL为8．3％，1C82为15．6％，1C74为12．5％，2G12为13．8％，2A21为5．4％；在16例软骨肉瘤中表达率依次为：ZOL03为9．4％，1C82为14．3％，1C74为7．5％，2G12为6．8％，2A21为6．2％；在19例正常骨组织标本中表达率依次为：ZOL03为0，1C82为6．4％，1C74为0，2G12为4．8％，2A21为3．9％，这5个基因片段检出率在骨肉瘤与其他骨肿瘤中存在显著差异（P＜0．01）；其检出率与骨肉瘤与正常骨组织中存在显著差异（P＜0．01）。结论 ZOL03，1C82，1C74，2G12及2A21这5个基因片段可能与骨肉瘤的发生，发展有关，监测骨组织中此5个基因片段的表达水平的变化可能对骨肉瘤的早期发现更有意义。     

应用抑制消减杂交技术克隆人大肠癌转移相关新基因

目的 克隆新的大肠癌转移相关基因,为进一步阐述大肠癌转移的分子机制提供线索。方法 利用抑制消减杂交技术,以1对来自同一亲本、转移能力不同的大肠癌细胞株SW620和SW480为研究对象,构建2种大肠癌转移促进基因和转移抑制基因的cDNA消减文库。随机挑取文库克隆进行差异筛选,对所得的差异片段进行测序和同源性分析,利用Northern Blot对新基因的表达情况进行验证。结果 两种消减文库分别含有235和232个白色克隆,90%以上的白色克隆含有插入片段。随机挑取约200个阳性克隆进行差异筛选。共获得29个差异片段。测序及同源分析发现15个为未知基因,GenBank登陆号为CD485499-CD485513。其中与5号染色体序列同源的基因有6个。结论 抑制消减杂交技术是筛选、克隆大肠癌转移相关新基因的有效手段;5号染色体上可能存在多个与大肠癌转移相关的新基因位点;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。     

ATRA诱导上调基因RIG-C的cDNA克隆和序列分析及蛋白表达

目的 克隆和表达维甲酸诱导上调的新基因RIG-C。方法 运用Blast、pfam等生物信息学手段对RIG-C的全长cDNA序列进行结构与功能预测;将RIG-C全长阅读框架插入原核表达载体pET22b中,在JM109(DE3)菌株中进行诱导表达;将全长RIG-C插入真核表达的绿荧光蛋白载体pEGFP-Cl中,转染NIH3T3细胞以观察RIG-C的亚细胞定位。结果 RIG-C基因cDNA全长1266bp,编码421个氨基酸,N端具有多个WD40结构域,C端有一个SOCS家族典型结构。原核表达的RIG-C蛋白大小约45kd,NIH 3T3细胞表达的RIG-C定位于细胞浆。结论 克隆和表达了新基因RIG-C,为进一步研究其生物学功能和蛋白质的空间结构奠定了基础。     

小鼠促进骨髓抑制恢复相关因子IL-7基因的识别与克隆

目的寻找促进骨髓抑制恢复的相关细胞因子,进行骨髓抑制时基因表达差异分析,并对表达上调较大的细胞因子进行克隆验证。方法尾静脉注射5-Fu构建小鼠骨髓抑制模型,运用基因芯片方法分析正常小鼠与骨髓抑制模型第0,3,7,11,14天的基因表达差异,针对表达上调较大的鼠IL-7基因设计引物,以RT-PCR克隆其编码序列,并构建phCMV/IL-7真核表达载体。结果得到一组符合促进骨髓抑制恢复细胞因子特点的基因,其中细胞因子IL-7表达量升高30倍。结论IL-7符合促进骨髓抑制恢复细胞因子的特点,为研究骨髓抑制恢复的新方案奠定了基础。     

宫颈癌相关基因的筛选及生物信息学分析

目的 从分子水平揭示官颈癌的发病机制,为临床诊疗提供新工具.方法 在公共基因芯片数据库GEO中找到宫颈癌的相关基因芯片数据,使用BRB-ArrayTools软件包对其进行统计学分析,找到官颈癌相关基因;利用Panther在线分析软件对这些基因进行生物学分析.结果 在宫颈癌组织共找到37条差异表达基因,上调23条,下调14条.这些基因的功能大致分为细胞骨架结构、转运载体、细胞信号转导、转录调控、细胞粘附、细胞凋亡等.结论 利用生物信息学的方法 能有效分析基因芯片数据并获取生物内在信息,官颈癌的发生是由于多种基因表达改变所致,为确定宫颈癌的早期诊断标志与新治疗靶位开辟了新的思路.