Math1基因重组慢病毒的构建及其在293T细胞中的表达

目的 构建携带Math1基因的重组慢病毒载体,检测其滴度,检测其在293T细胞中的表达.方法 PCR扩增Math1基因,将其连入慢病毒栽体pLenti-GFP中;在感受态细胞DH5α中培养扩增,并行Math1基因的测序鉴定;将重组的慢病毒四质粒共转染293T细胞,收获并浓缩病毒;感染293T细胞和提取细胞DNA后用实时定量PCR法检测病毒滴度.用逆转录PCR和westem blot法检测Mathl基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结果 构建的慢病毒载体pLenti-Math1-GFP经测序分析证实基因序列正确.四质粒共转染293T细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光.包装后慢病毒测定滴度约为3X10"Tu/L.逆转录PCR和Western blot法均能检测Math1基因在感染病毒的293T细胞中的表达.结论 成功构建携带Math1基因的重组慢病毒,并能在293T细胞中表达.     

人NESG1基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达

目的克隆人NESG1基因,构建与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体pGC-FU-NESG1-EGFP,包装慢病毒,感染293FT细胞并进行鉴定。方法以NESG1全长克隆为模板扩增其编码框序列,通过限制性内切酶AgeI酶切、T4 DNA连接酶连接,将NESG1插入慢病毒载体pGC-FU-EGFP,构建pGC-FU-NESG1-EGFP重组载体。质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经PCR及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染人胚肾细胞系293FT,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。病毒感染293FT细胞,荧光显微镜下观察感染效率,Western blot方法检测NESG1-EGFP融合蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒表达载体pGC-FU-NESG1-EGFP,三质粒共转染293FT细胞后可见大量绿色荧光;浓缩病毒后测定其滴度为2×107 TU/ml;以复感染系数MOI为1感染293FT细胞,感染效率在90%以上。Western blot证实细胞表达NESG1。结论成功构建NESG1慢病毒表达载体,包装得到高滴度慢病毒,为后续感染鼻咽癌细胞,探索其在鼻咽癌发生和发展中的作用奠定了基础。     

mCD99L2基因干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 构建mCD99L2(mouse CD99 antigen-like 2)基因RNA干扰慢病毒表达载体,检测其对293FT细胞的感染效率.方法 应用基因工程技术,首先设计并合成4对siRNA序列,退火、酶切并连接于慢病毒表达载体SD1259,构建携带针对目的 基因mCD99L2的siRNA慢病毒穿梭质粒表达载体(其中包括1条阴性对照序列);然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293FT细胞,转染48 h后收集上清离心过滤,浓缩病毒,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果 构建3个携带针对目的 基因mCD99L2的siRNA慢病毒穿梭质粒表达载体和1个阴性对照质粒,经测序鉴定正确;共转染293FT细胞包装病毒并浓缩后滴度达1×107/ml,适合感染目的 细胞.结论 应用基因工程技术成功构建了mCD99L2基因RNA干扰慢病毒表达载体,为进一步构建类人霍奇金淋巴瘤可视化细胞模型及动物模型奠定了基础.     

TGFβ1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建TGFβ1基因RNAi慢病毒载体.方法:根据人TCFβ1的mRNA序列选择3个靶序列并根据它们设计合成3对寡核苷酸序列.同时合成1对阴性对照寡核苷酸序列;将以上4对寡核苷酸序列退火后连人pRNA-U6/Lenti质粒,酶切和测序鉴定后,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293FT细胞,包装产生病毒颗粒.各组病毒载体转染Hela细胞后,运用Real-Time PCR和ELISA检测TGFβ lmRNA和蛋白的表达水平.结果:酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被准确克隆到pRNA-U6/Lenti质粒;各质粒与包装质粒共转染293FT细胞后能产生高滴度的慢病毒载体颗粒;各组慢病毒载体感染Hela细胞后,有两组可以显著抑制TGFβ1mRNA水平及蛋白水平的表达,其中以第一组效果最佳.结论:成功构建了人TGFβ1基因RNAi慢病毒载体.     

人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达

目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.     

Construction of lentiviral expression vector containing human TRADD gene and its inhibitory effect on proliferation in hyperplastic scar fibroblasts

目的 构建抗食管支架术后再狭窄携人TRADD基因慢病毒表达载体,并检测其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响.方法 以购买的人TRADD基因为模板,采用PCR法扩增目的基因片段,PCR产物经回收纯化后与线性化的慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro重组.重组质粒转化DH5α感受态细胞.菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆测序无误后,质粒共转染293FT细胞制备慢病毒.Real-time定量PCR法检测病毒滴度.Western blot检测TRADD-GFPFLAG融合蛋白的表达.MTT法检测TRADD基因慢病毒对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响.结果 菌落PCR扩增产物经凝胶电泳,阳性克隆得到1 200 bp片段,基因测序显示重组质粒中TRADD序列与GenBank中序列一致.包装产生的慢病毒转染293 FT细胞48 h后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,病毒滴度为3.22×108 IU/ml,Western blot检测到融合蛋白TRADD-GFP-FLAG在293FT细胞中获得有效表达,MTT法证实该融合蛋白具有生物活性,能有效抑制瘢痕成纤维细胞增殖.结论 成功构建并包装了pLVX-TRADD-EGFP-3 FLAG-Puro慢病毒表达载体,其可明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖.     

微小RNA miR-26a的克隆及其慢病毒表达载体的构建

目的 克隆微小RNA hsa-miR-26a并构建其慢病毒表达载体.方法 将PCR扩增得到的miR-26a前体序列和pIVTHM载体经双酶切后连接产生pIVTHM-miR-26a慢病毒表达载体,双酶切后测序鉴定,筛选阳性克隆.用pIVTHM-miR-26a、psPAχ2和pMD2.G 3质粒共转染包装细胞293FT,包装产生慢病毒.以293FT细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达水平测定病毒滴度.结果 经双酶切鉴定和测序证实,成功构建了miR-26a的慢病毒表达载体pIVTHM-miR-26a.倒置荧光显微镜下观察可见包装细胞293FT呈绿色荧光,并测得病毒滴度为5×105TU/ml.成功构建hsa-miR-26a的慢病毒表达载体.为深入研究miR-26a的生物学功能奠定了基础.     

人THAP11慢病毒载体的构建及表达研究

目的 构建人死亡相关蛋白11(THAP11)基因的慢病毒载体,并建立其慢病毒表达系统.方法 PCR方法获得人THAP11基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒pBPLV-THAP11-myc,并通过转染HEK293细胞观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达以及Western blot检测其表达.在脂质体介导下将重组质粒与包装质粒pLP1和pLP2、包膜质粒pLP/VSVG共转染293FT细胞包装产生慢病毒.结果 构建的质粒经PCR,酶切及测序鉴定正确;该质粒与包装质粒共转染293FT细胞获取的5.5×106TU/ml慢病毒滴度.结论 成功构建了人THAP11基因慢病毒载体质粒THAP11-myc-pBPLV,并建立了其慢病毒表达系统,为后续的应用研究奠定了基础.     

人β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体构建及在毛囊干细胞中的表达

目的 构建人β-连环蛋白(β-catenin)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体,感染人毛囊干细胞并予以鉴定.方法 提取人血管内皮细胞总RNA,RT-PCR扩增获得β-catenin基因全部序列,采用TA克隆技术获取基因亚克隆pUCm-T-β-catenin,AgeⅠ酶切连接pGC-FU载体构建β-catenin融合EGFP共表达慢病毒载体质粒pGC-FU-β-catenin-EGFP.质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经RT-PCR及测序鉴定正确后转染FT293细胞,Western blotting分析鉴定.质粒再转染FT293细胞进行慢病毒质粒包装,荧光显微镜观察,Real-time PCR测定病毒滴度.包装后慢病毒质粒感染体外分离和培养经免疫荧光染色鉴定的人毛囊干细胞,RT-PCR鉴定,荧光显微镜观察感染效率.结果 RT-PCR及测序鉴定证实目的 基因正确克隆至慢病毒载体中.在转染pGC-FU-β-catenin-EGFP的FT293细胞,Western blotting证实细胞表达β-catenin;质粒包装后荧光显微镜观察FT293细胞见大量绿色荧光时测得病毒滴度为2.0×108 TU/mL.在感染慢病毒质粒的人毛囊干细胞,当感染复数为10时,感染后48 h的感染效率可达80%以上,感染后3周的感染效率仍维持在80% ～90%.结论 成功构建β-catenin-EGFP融合表达慢病毒载体,可高效感染人毛囊干细胞且表达稳定、持久.     

TRADD慢病毒载体构建及其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

目的构建抗食管支架术后再狭窄携人TRADD基因慢病毒表达载体,并检测其对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法以购买的人TRADD基因为模板,采用PCR法扩增目的基因片段,PCR产物经回收纯化后与线性化的慢病毒表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro重组。重组质粒转化DH5α感受态细胞。菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆测序无误后,质粒共转染293FT细胞制备慢病毒。Real-time定量PCR法检测病毒滴度。Western blot检测TRADD-GFP-FLAG融合蛋白的表达。MTT法检测TRADD基因慢病毒对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。结果菌落PCR扩增产物经凝胶电泳,阳性克隆得到1 200 bp片段,基因测序显示重组质粒中TRADD序列与GenBank中序列一致。包装产生的慢病毒转染293 FT细胞48 h后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,病毒滴度为3.22×108IU/ml,Western blot检测到融合蛋白TRADD-GFP-FLAG在293FT细胞中获得有效表达,MTT法证实该融合蛋白具有生物活性,能有效抑制瘢痕成纤维细胞增殖。结论成功构建并包装了pLVX-TRADD-EGFP-3FLAG-Puro慢病毒表达载体,其可明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。