人ENO1(Enolase-α)基因的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备

目的:构建人ENO1(human Enolase-α)基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白的表达,利用纯化后的蛋白制备具有活性的ENO1多克隆抗体.方法:用PCR方法从胃癌MKN45细胞全基因组中扩增出目的基因ENO1,将目的基因和原核表达载体pET30a(+)分别双酶切,回收酶切产物并用T4连接酶连接,获得重组质粒pET30a(+)-ENO1.将重组质粒转入大肠埃希菌菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,利用纯化的ENO1活性蛋白作为抗原免疫家兔,制备抗血清多克隆抗体,并用Western blot检测其特异性.结果:目的基因与原核表达载体经双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果表明重组人ENO1基因序列与NCBI(NM_001428.3)公布序列一致.经SDS-PAGE分析,结果显示重组蛋白的分子量约在47kDa,条带单一,无杂带出现,主要以可溶性形式存在.Western blot证实多克隆抗体制备成功.结论:成功表达、纯化了ENO1融合蛋白,制备了具有高特异性的多克隆抗体,为进一步肿瘤疫苗的研制和肿瘤标志物快速诊断的研究奠定基础.     

癌-睾丸抗原GAGE-1基因的重组、表达及纯化

目的 为进一步研究临床应用癌-睾丸抗原GAGE-1诱导特异性抗肿瘤免疫反应,对GAGE-1基因进行克隆、体外原核重组表达及蛋白分离纯化。方法 运用RT-PCR技术从人QGY-7701肝癌细胞株中扩增GAGE-1基因片段,插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GAGE-1,并导入大肠杆菌BL21,IPTG诱导目的蛋白表达;经包涵体透析复性及GST柱亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析鉴定。结果 扩增得到GAGE-1基因5’端251 bp片段,与GeneBank公布的序列一致,构建的PGEX-6p-1-GAGE-1原核表达质粒经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达分子量约35.7 kD的GST-GAGE-1融合蛋白,纯化后蛋白纯度为90%以上。结论 成功构建PGEX-6p-1-GAGE-1重组表达质粒,并成功表达纯化了GST-GAGE-1融合蛋白,为进一步深入研究GAGE蛋白奠定了基础。     

人NY-ESO-1基因的原核表达、纯化和初步应用

目的：克隆人NY-ESO-1基因，进行原核表达和分离纯化，并初步应用于肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测。方法：通过RT-PCR技术从人肝癌组织中扩增NY-ESO-1基因片段，插入原核表达载体pGEX4T-1( )中，构建重组表达质粒pGEx／ESO1，导入大肠杆菌BL21(DE3)，诱导目的蛋白表达，经包涵体透析复性和GSTrap亲和层析纯化目的蛋白，Westem blot鉴定。应用间接ELISA方法初步检测50例肝癌患者血清和20例正常人血清NY-ESO-1抗体的表达。结果：扩增得到NY-ESO-1基因3′端276bp片段，与GeneBank公布序列一致，构建的pGEX／ESO1原核表达质粒经IPTG诱导，在大肠杆菌中表达分子量约36kD的GST-ESO1融合蛋白，纯化后蛋白纯度为90％。50例肝细胞癌患者血清中4例检测到NY-ESO-1抗体(8％)，正常人血清均为阴性。结论：成功构建pGEX／ESO1重组表达质粒，得到有活性的NY-ESO-1融合蛋白，对肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测有-定的应用价值。     

癌基因LMO3的原核表达及多克隆抗体的制备及应用

目的:制备抗神经特异性表达的癌基因LMO3的多克隆抗体,进行LMO3分子检测和功能研究.方法:采用RT-PCR方法扩增LMO3的基因序列,构建其原核表达载体pET32a-LMO3.在大肠埃希菌中诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE分离纯化原核表达的融合蛋白,PBS溶解聚丙烯酰胺凝胶颗粒中的融合蛋白,乳化后免疫新西兰兔制备多克隆抗体.采用免疫印迹、免疫组化等对该抗体的特异性进行鉴定.结果:构建的重组质粒经酶切鉴定和测序证实序列正确.经诱导表达在相对分子质量为37×103处有一条明显的蛋白条带,与预期值一致;免疫动物所得抗血清效价为1∶16 000,该抗体能够识别原核表达的LMO3蛋白及细胞内源性表达的LMO3蛋白;免疫组化显示,LMO3在SHG44胶质瘤细胞株及脑胶质瘤组织中均有表达. 结论:制备了能识别天然LMO3分子的抗LMO3的多克隆抗体,为检测LMO3分子的表达和进一步研究其功能提供了有力的工具.     

精胺/精眯N1-乙酰基转移酶重组蛋白的原核表达及其抗体制备

目的 探讨精胺/精眯N1乙酰基转移酶(SSAT)的原核表达及抗SSAT多克隆抗体的制备.方法 RT-PCR法从人肺癌细胞总RNA中克隆SSAT cDNA后,构建SSAT原核表达质粒pET15b/SSAT并转化BL21(DE3)大肠杆茵细胞.SSAT重组蛋白经IPTG诱导表达后,利用PAGE凝胶纯化和Ni-NTA亲和层析纯化.用凝胶纯化的SSAT重组蛋白免疫家兔以制备抗SSAT多克隆抗体,所得抗体的特异性及效价用Western blot和ELISA技术检测.结果 SSAT重组蛋白可在大肠杆茵中诱导性高表达,用此蛋白免疫动物所得的SSAT抗体的效价以及特异性均较高.结论 建立了SSAT原核表达系统并成功制备出SSAT多克隆抗体.     

睾丸肿瘤抗原MAGE-C2基因cDNA的克隆、表达与纯化

目的　克隆人睾丸肿瘤抗原MAGE- C2基因的c DNA,并在大肠杆菌中进行表达与纯化,以便为研究其生物学功能及制备肿瘤疫苗奠定基础。方法　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中提取总RNA,用RT- PCR从中扩增出MAGE- C2的c DNA片段,将MAGE- C2的c DNA片段插入载体p GEM- T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体p GEX- 4 T- 2中,构建重组表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2 ,并转化大肠杆菌,用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化,并进行SDS- PAGE及Western- blot检测。结果　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中克隆到长4 0 0 bp的MAGE- C2的c DNA,测序正确;经Xho I和Bam H I酶切鉴定证实,MAGE- C2 c DNA成功克隆到表达载体p GEX- 4 T- 2中;构建的表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2在大肠杆菌中表达出Mr4 10 0 0的融合蛋白,经谷胱甘肽(GST)亲和层析后的融合蛋白纯度达到90 % ,该融合蛋白具有MAGE- C2抗原特性。结论　成功地克隆并表达了MAGE- C2 c DNA,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MAGE- C2抗原创造了条件。     

人源化抗肝癌scFv融合RC-RNase在大肠埃希菌中的表达及对人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤作用

目的 :在大肠埃希菌中可溶性表达新型重组人源化抗肝癌单链抗体融合RC RNase(scFv RC RNase) ,观察其对体外培养的人肝癌细胞SMMC 772 1的杀伤作用。方法 :将原核表达质粒Tih scFv RC RNase以大肠埃希菌E coliBL2 1(DE3 )为宿主菌 ,用异丙基硫代 -β -D -半乳糖苷 (IPTG )诱导表达。工程菌经超声碎菌、离心后 ,上清液用Ni NTAAgarose亲合层析法进行纯化。四甲基噻唑蓝 (MTT)法检测纯化蛋白对体外培养的人肝癌细胞SMMC 772 1的体外杀伤作用。结果 :IPTG诱导 5h后 ,SDS PAGE显示抗肝癌scFv RC RNase在大肠埃希菌E coliBL2 1(DE3 )中主要以可溶性的形式表达 ,表达量占菌体总蛋白量的 10 5 %。MTT法提示 ,纯化后的表达产物对体外培养的人肝癌细胞SMMC 772 1具有一定的杀伤作用 ,其半数致死量 (LD50 )为 0 0 0 7g/L。结论 :抗肝癌scFv RC RNase融合蛋白有望成为一种具有一定临床应用潜力的抗肝癌导向治疗药物。     

HPV16E7-HSP70 融合蛋白在大肠杆菌中表达及纯化

[目的]在大肠杆菌中表达HPV16E7-HSP70融合蛋白并进行纯化和复性,为进一步研究HPV16E7-HSP70融合蛋白抗喉癌免疫活性奠定基础.[方法]用构建的原核表达质粒pET28a HPV16E7-HSP70转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达;通过超声波裂解细菌,高浓度尿素裂解包涵体和Ni2+离子金属螯合亲和层析纯化目的蛋白;并对融合蛋白进行复性;用SDS-PAGE及Western Blot进行分析鉴定.[结果]SDS-PAGE 分析显示有分子量约为90kD的融合蛋白表达,表达产物以包涵体形式存在,表达量可达30％;纯化后目的蛋白的纯度达到95％;经Western Blot鉴定复性后的融合蛋白能与抗HPV 16E7抗体、抗HSP70抗体特异性结合.[结论]HPV16E7-HSP70融合蛋白能够在体外大肠杆菌中表达获得.     

牛蛙核糖核酸酶的表达和鉴定及功能检测

目的:在大肠埃希菌中高效表达牛蛙核糖核酸酶(ranacatesbeianaribonuclease,RCRNase),并对其纯化产物进行噻唑蓝(tetrazoliumblue,MTT)实验,观察对肝癌细胞的抑制效果。方法:用异丙基硫代D半乳糖苷(isopropylthioDgalactoride,IPTG)诱导原核表达质粒PET32aRCRNase在大肠埃希菌E.coliBl21(DE3)plysS中表达。菌体经超声、离心后,用NiNTAAgarose亲和层析法对包涵体进行纯化。采用MTT法检测纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞的杀伤活性。结果:纯化的目的蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulphatepolyacrylamidegeleletrophoresis,SDSPAGE)蛋白电泳表明,RCRNase在大肠埃希菌中是以包涵体的形式表达。用MTT法的结果中可以看出,纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞具有一定的抑制效果,其IC50值(半抑制浓度)是22.44μg/mL。结论:牛蛙核糖核酸酶在大肠埃希菌中得到大量表达,为进一步研究其生物学特性以及功能打下了良好的基础。     

人肺腺癌TLE1 N端Q结构域片段在原核系统表达纯化及其多克隆抗体的制备

背景与目的 TLEI是参与Wnt、Notch以及EGFR信号通路调控的一种重要蛋白.TLE1 N端Q结构域片段通过介导自身寡聚化及与LEFl结合发挥调控作用.本实验旨在构建人TLE1 N端Q区基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备并纯化人TLEI N端Q结构域蛋白片段,制备TLEl Q结构域多克隆抗体.方法 以人肺腺癌cDNA库为模板聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)特异性扩增TLE1-Q(1-136)基因序列,与pGEX-4T-1质粒连接后转化感受态大肠杆菌E.coli.以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D thiogalactoside,IPTG)诱导表达产生融合蛋白GST-TLEI-Q(1-136).经亲和层析,Thrombin酶切,FPLC纯化,SDS-PAGE鉴定目的蛋白TLE1-Q(1-136).免疫家兔,制备多克隆抗体.结果 测序证实重组表达质粒中的人TLE1 N端Q结构域基因序列正确,成功构建表达型重组质粒pGEX-4T1-TLE1-Q重组质粒转化大肠杆菌c+后,经诱导,重组蛋白GST-TLE1-021-136)得到表达.SDS-PAGE鉴定示纯化蛋白为目的蛋白人TLEl N端Q结构域片段TLE1-Q(1-136).免疫家兔后收获抗血清,ELISA显示抗体效价为1:20000,具有高度特异性.免疫印迹结果显示,制备的多抗可与TLEI.021.136)蛋白特异性结合.结论 成功构建了人TLE1 N端Q结构域重组融合蛋白表达质粒pGEX-4T1-TLE1-Q表达纯化了稳定可溶TLE1 N端Q结构域蛋白TLE1-Q(1-136),制备了人TLE1 N端Q结构域蛋白片段多克隆抗体,为进一步研究TLE1在肺癌生成中的作用奠定了基础.     

NY-ESO-1/LAGE-1 coexpression with MAGE-A cancer/testis antigens: a tissue microarray study

The characterization of the expression pattern of different families of cancer/testis (C/T) antigens in different tumors, at the protein level, might be of relevance in the development of multiantigen vaccine preparations for active specific immunotherapy. We have used tissue microarray (TMA) technology to explore in large numbers of tumor specimens the expression of NY-ESO-1/LAGE-1 C/T antigens and its correlation with MAGE-A expression by using D8.38 and 57B monoclonal antibodies (MAb). The epitopes recognized by these reagents in C/T antigens were identified by molecular mapping by using a bacterial expression system. Out of 2,052 samples, 119 (5.8%) scored positive upon staining with D8.38 NY-ESO-1/LAGE-1-specific MAb. Expression in >10% of cases was detectable in melanoma and basalioma (31.6 and 18.2%, respectively), large cell carcinomas and adenocarcinomas of the lung (17.8 and 10.5%, respectively), stomach adenocarcinomas of the intestinal type (13.2%), pT2-4 bladder TCC (18.2%), nonseminomatous carcinomas of the testis (10.4%) and liposarcomas (15.4%). Simultaneous expression of NY-ESO-1/LAGE-1 and MAGE-A C/T antigens was then addressed in a TMA where 101/845 and 73/845 samples (12 and 8.6%, respectively) showed evidence of MAGE-A or NY-ESO-1/LAGE-1 specific staining, respectively. In 35/845 specimens (4.1%) concomitant expression of MAGE-A and NY-ESO-1/LAGE-1 was observed (p = 0.0002). Discrepancies in the expression of NY-ESO-1/LAGE-1 and MAGE-A were conspicuously detectable in squamous cell carcinomas of the skin (MAGE-A positive but NY-ESO-1/LAGE-1 negative) and in liposarcomas (NY-ESO-1/LAGE-1 positive, but MAGE-A negative). Taken together, these data suggest novel areas of application of C/T antigens targeted active specific immunotherapy possibly based on multiantigen vaccine preparations.     

Expression of MAGE-A3, NY-ESO-1, LAGE-1 and PRAME in urothelial carcinoma

Background:

The potential for cancer-testis (CT) antigens as targets for immunotherapy in cancer patients has been heavily investigated, and currently cancer vaccine trials based on the CT antigens, MAGE-A3 and NY-ESO-1, are being carried out.

Methods:

We used specific q-RT-PCR assays to analyse the expression of the CT genes MAGE-A3, NY-ESO-1 (CTAG1B), LAGE-1 (CTAG2) and PRAME in a panel of bladder tumours from 350 patients with long-term follow-up and detailed treatment information.

Results:

Overall, 43% of the tumours expressed MAGE-A3, 35% expressed NY-ESO-1, 27% expressed LAGE-1 and 20% expressed PRAME. In all, 56% of the tumours expressed at least one of the CT genes analysed. Univariate Cox regression analysis of CT gene expression in non-muscle-invasive tumours showed that expression of MAGE-A3 (P=0.026), LAGE-1 (P=0.001) and NY-ESO-1 (P=0.040) was significantly associated with a shorter progression-free survival. In addition, we found that patients with tumours expressing PRAME responded poorly to chemotherapy (P=0.02, χ²-test).

Conclusion:

Cancer-testis genes are frequently expressed in bladder cancer and especially in tumours of high stage and grade. In addition, the CT gene expression may have both prognostic and predictive value. Development of specific immunotherapy against the CT antigens in bladder cancer may ultimately increase patient survival.     

宫颈癌IB1、IB2期的临床回顾性分析

目的 分析宫颈癌分期中ＩＢ１、ＩＢ２期的治疗结果以及淋巴结转移、宫颈间质浸润、组织分级与预后的关系。方法 ３５６例ＩＢ期宫颈癌全部行广泛性子宫切除和盆脸淋巴清除术,７２例辅以术前放疗（ＩＢ１期３９例,ＩＢ２期３３例）,８３例行术后放疗（ＩＢ１期６１例,ＩＢ２期２２列１例行术前,术后放疗（ＩＢ２期５例,ＩＢ２期６例）。结果 随访５年以上者２４９例,总的５年存活率６９．９％,ＩＢ１期为７３．３％（１８     

周围型肺癌CT征象及预后与Cyclin D1表达的相关性研究

目的：探讨周围型肺癌CT征象及预后与Cyclin D1表达的关系。方法：利用免疫组化SP法及螺旋CT扫描，回顾分析92例经病理确诊的周围型肺癌Cyclin D1基因表达与CT征象及其预后的关系。结果：深分叶、棘突征、短细毛刺征、纵隔淋巴结转移与Cyclin D1表达有关，X^2值分别为6．139、4．727、4．756和5．220，P值均〈0．05；肿瘤大小、空洞、胸膜凹陷、组织类型、肿瘤分化程度、肿瘤TNM分期、年龄、性别与Cyclin D1表达无关，X^2值分别为0．244、0．004、0．411、1．523、0．391、0．040、1．104、1．896，P值均〉0．05。Cyelin D1过度表达与预后有关。Cyclin D1为一负性预后因子，其过度表达提示预后不良。结论：Cyclin D1表达在肺癌的发生、发展及CT征象中可能起重要作用，检测该基因并结合CT征象可作为临床诊断及预后评估的指标。     

T1～T2期伴1～3个腋窝淋巴结转移乳腺癌患者改良根治术后放疗的作用

目的 回顾性分析370例T1～T2期、腋窝淋巴结转移数为1～3个乳腺癌患者改良根治术后的治疗结果,探讨放疗的作用.方法 用Kaplan-Meier法计算生存率,分析放疗对生存率和复发率的影响,同时分析对未放疗患者复发率有影响的临床病理因素.结果 中位随访时间为50个月(9～91个月).全组患者的5年无局部区域复发率为91.0%,总生存率为85.4%.放疗显著提高5年无局部区域复发生存率(100%和89.5%;x2=5.17,P=0.023),对总生存率无影响.对319例未行放疗患者的单因素分析显示T分期、腋窝淋巴结阳性数、C-erbB-2和PR状态是预测无复发生存率的有意义因素.结论 T1～T2期且腋窝淋巴结转移数1～3个乳腺癌患者改良根治术后,放疗显著降低局部复发率,但对总生存率无影响.T分期、腋窝淋巴结阳性数、C-erbB-2和PR状态是预测元复发生存率的有意义因素.     

T1-2N1M0期乳腺癌新辅助化疗后疗效分析及放疗选择的探讨

目的 评价T_1-2N₁M₀期乳腺癌新辅助化疗后辅助放疗对LC率的影响及地位。方法收集2005—2010年间收治的新辅助化疗患者资料,筛选出T_1-2N₁M₀人群,并对其辅助放疗的临床结果进行分析。共入组T_1-2N₁M₀患者144例,中位年龄45岁(23~72岁)。结果 术后30例(21%)获得乳腺原发灶和腋窝淋巴结pCR者均接受了辅助放疗,45例仅腋窝淋巴结阳性转阴性者中10例未接受辅助放疗,69例腋窝淋巴结转移仍为阳性者中6例未接受放疗,其余患者均接受了辅助放疗。全组中位随访时间88个月,46例复发转移(32%),其中pCR者5年LR率为3.0%。5年LR率新辅助化疗后腋窝淋巴结阳性转阴性者放疗组为7%、未放疗组为16%(P=0.181),腋窝淋巴结仍为阳性者放疗组为15.9%、未放疗组为33%(P=0.267)。全组pCR者DFS时间较非pCR者延长(P=0.017)。结论 新辅助化疗后获pCR者DFS期优于未获pCR者,获pCR患接受辅助放疗的LR率较低,腋窝淋巴结阳性转阴性者未能从术后辅助放疗中获益,而腋窝淋巴结转移仍为阳性者的LR率高,辅助放疗有获益趋势。     

Gal-3和MUC1蛋白在结直肠癌中的表达及与预后的关系

目的 检测MUC1和Gal-3蛋白在结直肠癌中的表达,探讨与结直肠癌临床病理特征及预后的关系.方法 应用免疫组织化学SP法检测MUC1和Gal-3蛋白在81例结直肠癌组织中的表达,另取癌旁正常组织20例及结直肠腺瘤组织20例作为对照组,并结合临床病理特征及随访资料分析临床意义.结果 结直肠癌中MUC1和Gal-3蛋白的表达明显高于癌旁组织和结直肠腺瘤组织(P＜0.05).MUC1和Gal-3蛋白的表达与结直肠癌的浸润、TNM分期、淋巴结转移有关,与患者的性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度和组织学类型均无明显关系(均P＞0.05).两者表达呈正相关(r=0.84,P＜0.05);MUC1、Gal-3蛋白阳性表达的患者5年生存率低于阴性表达者(P＜0.05).结论 MUC1和Gal-3与结直肠癌的发生、发展及生存期相关,联合检测可能对结直肠癌的诊断、治疗及预后评价具有一定的临床意义.