睾丸肿瘤抗原MAGE-C2基因cDNA的克隆、表达与纯化

目的　克隆人睾丸肿瘤抗原MAGE- C2基因的c DNA,并在大肠杆菌中进行表达与纯化,以便为研究其生物学功能及制备肿瘤疫苗奠定基础。方法　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中提取总RNA,用RT- PCR从中扩增出MAGE- C2的c DNA片段,将MAGE- C2的c DNA片段插入载体p GEM- T easy中,经全自动序列分析仪测序正确后,再克隆至表达载体p GEX- 4 T- 2中,构建重组表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2 ,并转化大肠杆菌,用IPTG进行诱导后,收集细菌,菌体裂解后,利用GST亲和层析柱对表达蛋白进行纯化,并进行SDS- PAGE及Western- blot检测。结果　从人胶质瘤细胞系BT- 32 5中克隆到长4 0 0 bp的MAGE- C2的c DNA,测序正确;经Xho I和Bam H I酶切鉴定证实,MAGE- C2 c DNA成功克隆到表达载体p GEX- 4 T- 2中;构建的表达载体p GEX- 4 T- 2 - MAGE- C2在大肠杆菌中表达出Mr4 10 0 0的融合蛋白,经谷胱甘肽(GST)亲和层析后的融合蛋白纯度达到90 % ,该融合蛋白具有MAGE- C2抗原特性。结论　成功地克隆并表达了MAGE- C2 c DNA,并对融合蛋白进行了初步纯化,为大规模获得MAGE- C2抗原创造了条件。     

肿瘤-睾丸抗原SSX1和SSX4的mRNA在肝细胞肝癌中的表达

目的检测肿瘤-睾丸抗原(Cancer-Testis antigens,CT)SSX1和 SSX4基因 mRNA 在肝细胞肝癌(HCC)中的表达,探讨 CT 抗原 SSX1和 SSX4 mRNA 在 HCC 中表达有无特异性。方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对35例 HCC 患者癌组织和相应的癌旁组织 SSX1和 SSX4基因表达进行检测,对其中6例 RT-PCR 扩增产物的目的片段进行 DNA 序列测定。结果 35例 HCC 患者中,SSX1和 SSX4的表达率分别为81%(27/35)和73%(23/35);癌旁组织、12例肝硬化和15例正常组织未检测到 SSX1和 SSX4的表达。6例 DNA 序列测定结果显示 RT-PCR 产物为 SSX1和 SSX4基因的 cDNA。SSX1和 SSX4的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、血清甲胎蛋白(AFP)水平、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染无显著相关性(P>0.05)。结论 SSX1和 SSX4在 HCC 中呈高特异性表达,是制备 HCC 疫苗理想的靶向分子,多种 CT 抗原联合表达为多效价疫苗治疗 HCC提供了理论基础。     

肿瘤-睾丸抗原SSX1和SSX4的mRNA在肝细胞肝癌中的表达

目的 检测肿瘤-睾丸抗原(Cancer-Testis antigens，CT)SSX1和SSX4基因mRNA在肝细胞肝癌(HCC)中的表达，探讨CT抗原SSX1 和SSX4 mRNA在HCC中表达有无特异性。 方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法对35例HCC患者癌组织和相应的癌旁组织SSX1和SSX4基因表达进行检测，对 其中6例RT-PCR扩增产物的目的片段进行DNA序列测定。 结果 35例HCC患者中，SSX1和SSX4的表达率分别为81％(27／35)和73％(23／35)；癌旁组织、12例肝硬化和15例正常组织未 检测到SSX1和SSX4的表达。6例DNA序列测定结果显示RT-PCR产物为SSX1和SSX4基因的cDNA。SSX1和SSX4的表达与患 者年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、血清甲胎蛋白(AFP)水平、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染无显著相关性(P >0．05)。 结论 SSX1和SSX4在HCC中呈高特异性表达，是制备HCC疫苗理想的靶向分子，多种CT抗原联合表达为多效价疫苗治疗HCC 提供了理论基础。     

11种癌-睾丸抗原基因在食管癌中表达的检测

目的 研究11种癌-睾丸（CT）抗原基因在食管癌中的表达,明确食管癌辅助免疫治疗疫苗的组成成分,为食管癌肿瘤疫苗的研制提供理论依据。方法 用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测35例食管癌肿瘤组织以及相对应的癌旁正常食管黏膜组织中11种CT抗原基因的表达。结果 所检测的11种CT抗原基因在正常食管黏膜中均无表达。在食管癌组织中表达率最高的为MAGE-3（62．9％）;其次为MAGE-4（31．4％）、LAGE-1（28．6％）、MAGE-1（25．7％）、CT10（20．0％）、NY-ESO-1（20．0％）、CT7（5．7％）和SCP-1（2．9％）,无一例食管癌组织表达SSX-1、SSX-2、SSX-4基因。在35例食管癌组织中,28例（80．0％）表达至少1种CT基因,21例（60．0％）表达2种以上的CT基因。其中,19．0％（4／21）同时表达4种及4种以上CT基因,占总数的11．4％（4／35）。不表达任何CT基因的7例中,Ⅱ期5例,Ⅰ期和Ⅳ期各1例。NY-ESO-1、LAGE-1、MAGE-1、MAGE-3和MAGE-4基因随肿瘤进展,其表达率增加;而SCP-1和CT10的表达主要集中在较早期的Ⅰ期及Ⅱ期食管癌组织。随着肿瘤分期的提高,CT基因的共表达率呈上升趋势,在Ⅲ期时达到最高,为28．6％。结论 （1）包含MAGE-3、MAGE-4和LAGE-1等抗原成分的CT抗原疫苗可应用于食管癌患者的免疫治疗;（2）对不同病理分期的食管癌患者应采取含有不同CT抗原成分的疫苗;（3）SSX-1、SSX-2、SSX-4在食管癌组织中无表达,其具体机制有待进一步研究。     

黑色素瘤抗原基因在胃癌组织中表达的研究

目的：探讨黑色素瘤抗原(MAGE)基因在胃癌组织中的表达，为应用MAGE基因产物对胃癌患者进行特异性抗肿瘤免疫治疗提供理论依据。方法：用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测30例胃癌组织及相应癌旁组织中MAGE-1、MAGE-2和MAGE-3基因的表达。结果：30例胃癌组织标本MAGE-1、MAGE-2和MAGE-3基因的表达率分别为46．7％、30．0％，和36．7％，有20例至少表达其中1种基因，而相应的癌旁组织均不表达MAGE。结论：MAGE基因在胃癌组织中有较高的表达率，其编码蛋白有望作为疫苗用于胃癌患者的免疫治疗。     

肿瘤-睾丸抗原MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4在胰腺癌中的表达及意义

检测肿瘤-睾丸抗原（CTA）黑色素抗原A（Melanoma Antigen-A,MAGE-A）在胰腺癌中的表达情况,寻找胰腺癌中高表达MAGE亚型。方法:应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法对52例胰腺癌组织及癌旁正常组织中MAGE亚型MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4的表达情况进行检测。结果:癌旁正常组织中无MAGE亚型的表达,MAGE-A1、MAGE-A3、MAGE-A4在52例胰腺癌的阳性表达率分别为5.77%（3/52）、44.23%（23/52）、23.08%（12/52）;经相关分析,MAGE-A1、MAGE-A4的阳性表达与患者的年龄、性别、病变部位、分化程度无明显相关关系（P>0.05）;MAGE-A3的阳性表达与肿瘤的分化程度呈负相关（r=-0.294,P=0.034）,而与患者的年龄、性别、病变部位无明显相关关系（P>0.05）。结论:胰腺癌中MAGE亚型中MAGE-A3表达率最高,其阳性表达与肿瘤的分级呈负相关关系;MAGE-A3有望成为胰腺癌免疫治疗特异性的靶点。      

黑色素瘤抗原基因在胃癌组织中表达的研究

目的 :探讨黑色素瘤抗原 (MAGE)基因在胃癌组织中的表达 ,为应用MAGE基因产物对胃癌患者进行特异性抗肿瘤免疫治疗提供理论依据。方法 :用逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)技术检测 30例胃癌组织及相应癌旁组织中MAGE 1、MAGE 2和MAGE 3基因的表达。结果 :30例胃癌组织标本MAGE 1、MAGE 2和MAGE 3基因的表达率分别为 4 6 7%、30 0 %和 36 7% ,有 2 0例至少表达其中 1种基因 ,而相应的癌旁组织均不表达MAGE。结论 :MAGE基因在胃癌组织中有较高的表达率 ,其编码蛋白有望作为疫苗用于胃癌患者的免疫治疗     

SSX基因家族与癌-睾丸抗原

SSX(synovial sarcoma X breakpoint,SSX)基因位于X染色体上,是一个由9个成员组成的基因家族。其中一些成员所编码的蛋白质具有癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CT抗原)的特点,即能在多种肿瘤组织中表达,而在正常组织(除睾丸)几乎不表达。SSX蛋白质具有一定的免疫原性,能在肿瘤患者体内引起体液免疫和细胞免疫。目前的研究结果提示SSX有可能成为用于肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。     

癌-睾丸抗原SSX基因家族在视网膜母细胞瘤中的表达研究

目的检测癌-睾丸抗原SSX1-5 mRNA在视网膜母细胞瘤（RB）组织中表达情况,以及用于RB免疫治疗的可能性。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术对18例RB组织、18例非肿瘤病变视网膜组织及18例眼部正常组织中SSX1-5 mRNA的表达进行分析。结果18例RB组织中,SSX1、SSX2和SSX4 mRNA的表达率分别为33.3%（6/18）、5.6%（1/18）和22.2%（4/18）;未检测到SSX3和SSX5的表达。RB组织中,至少表达1个SSX基因者为50.0%（9/18）;表达2个或2个以上者为11.1%（2/18）。在非肿瘤病变视网膜组织以及眼部正常组织中无1例表达SSX1-5 mRNA。SSX1-5基因的表达与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度和临床分期等均无显著相关性（P〉0.05）。结论SSX1-5在RB组织中表达频率不尽相同,但具有较强的特异性,提示该基因家族有可能成为RB免疫治疗的靶抗原。     

肿瘤-睾丸基因研究进展

肿瘤-睾丸(CT)基因可产生特异性抗原，诱导机体生成针对肿瘤细胞的特异性体液和(或)T淋巴细胞，在肿瘤免疫治疗中很有前景。现综述CT基因的研究进展、命名规范、数据库、分布情况、抗原表达及识别，并对研究中许多未知问题进行初步展望。     

乳腺癌患者肿瘤组织及外周血多药耐药基因表达的临床意义

目的:检测多药耐药基因在乳腺癌患者肿瘤组织及外周血中的表达,探讨其临床意义。方法:荧光定量RT-PCR法检测40例原发性乳腺癌患者肿瘤组织及外周血、13例辅助化疗后乳腺癌患者外周血及10例乳腺良性疾病组织与外周血中mdr1的表达情况。结果:40例原发性乳腺癌患者肿瘤组织mdr1阳性表达率为67.5%(27/40),与对照组组织(无阳性表达)相比差异有统计学意义,χ2=14.380,P=0.001;乳腺癌患者外周血mdr1阳性表达率为22.5%(9/40),高于对照组(无阳性表达),χ2=4.486,P=0.034;化疗后乳腺癌患者外周血中mdr1的表达率为53.8%(7/13),高于化疗前外周血mdr1的表达,二者差异有统计学意义,χ2=12.345,P=0.001。结论:乳腺癌患者存在先天性和获得性耐药性,检测肿瘤组织和外周血mdr1表达对制定个体化化疗方案有指导意义。     

一个肝癌相关基因的生物信息学及其基因表达分析

目的 :筛选并克隆肝癌相关基因 ,探讨肝癌发病机制。方法 :在国家人类基因组南方研究中心肝癌基因表达谱及其功能研究的工作基础上 ,发现 1个未知功能基因 (暂命名LLC基因 ) ,其DNA拷贝数在肝癌基因组中呈降低的趋势。本研究利用生物信息学和RT PCR的方法 ,对其进行功能预测并在转录组水平检测该基因的表达。结果 :LLC基因定位于染色体8p2 3 3区段 ,全长为 670 6bp ,含有 2个外显子 ,1个内含子 ,其开放阅读框长为 1871bp ,编码 1个含有 62 3个氨基酸的蛋白。该基因在 67%( 16/2 4)肝癌组织中呈现下调趋势。同时其在人体内多种组织均有表达。结论 :LLC基因有可能是一个新的肝癌相关抑癌基因     

基质金属蛋白酶-7mRNA在胃癌组织中表达的研究

目的 :检测基质金属蛋白酶 -7(MMP 7)基因在胃癌组织及癌旁组织中的表达 ,探讨MMP 7在胃癌发生发展中的作用。方法 :应用逆转录—聚合酶链反应 (RT PCR)检测胃癌组织及相应癌旁组织中MMP 7基因的表达。结果 :3 0例胃癌组织中有 2 3例表达MMP 7基因 ,阳性率为 76 7% ,相应的 3 0例癌旁组织均未检测到MMP 7基因表达。统计学分析表明 ,MMP 7基因在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异有统计学意义 ,χ2 =3 7 2 97,P <0 0 0 1。结论 :胃癌组织中MMP 7基因具有高表达率 ,且表达具有高度肿瘤特异性 ,提示MMP 7在胃癌的生长和侵袭转移过程中有非常重要的作用     

SEMA3B和SEMA3F基因在宫颈癌中的表达及其临床意义

目的:探讨新型候选抑癌基因SEMA3B和SEMA3F在宫颈癌组织中的表达及其与宫颈癌发生、发展的关系。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测40例宫颈癌组织、10例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)组织及10例正常宫颈组织中SEMA3B和SEMA3F基因产物的表达水平。结果:宫颈癌组织、CIN及正常宫颈组织中SEMA3B的表达缺失率分别为65·0%、20·0%和0,P<0·05;SE-MA3F的表达缺失率分别为37·5%、20·0%和0,P>0·05。晚期(Ⅲ~Ⅳ期)宫颈癌组织中SEMA3B的表达缺失率(85·0%)明显高于其在早期(Ⅰ~Ⅱ期)宫颈癌组织中的表达缺失率(45·0%),χ2=7·03,P=0·008;SEMA3F与宫颈癌的临床分期无明显关系,χ2=0·10,P=0·744;SEMA3F在宫颈鳞癌中的表达缺失率(52·0%)明显高于其在宫颈腺癌中的表达缺失率(13·3%),χ2=5·98,P=0·014;而SEMA3B的表达异常与宫颈癌的组织类型无关,χ2=3·55,P=0·06。两者与组织学分级均无明显关系,P>0·05。结论:SEMA3B表达异常可能在宫颈癌发生、发展及预后中起重要作用。     

凋亡抑制因子Survivin在鼻咽癌组织中的表达及其临床意义

目的:探讨凋亡抑制因子Survivin在鼻咽癌组织中的表达及其临床意义。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot免疫印迹法,检测25例鼻咽癌组织及对应的对侧鼻咽部黏膜、10例正常人的鼻咽部黏膜组织中SurvivinmR-NA和蛋白的表达。结果:Survivin在正常鼻咽部黏膜组织中不表达。80·0%(20/25)的鼻咽癌组织和40·0%(10/25)的对应对侧相对正常鼻咽部黏膜中均可检测到Survivin基因mRNA和蛋白的表达,SurvivinmRNA在鼻咽癌组织中的表达较对应的对侧鼻咽部黏膜组织高,其吸光度(A)比值分别为0·83±0·22和0·29±0·14,差异有统计学意义,P=0·00;Survivin蛋白在鼻咽癌中的表达同样高于对侧鼻咽部黏膜组织,其A值分别为33680±1466和17925±1908,差异有统计学意义,P=0·00。Ⅲ Ⅳ期的鼻咽癌患者中Survivin表达强度明显高于Ⅰ Ⅱ期的鼻咽癌患者,P<0·05。鼻咽癌组织中Survivin表达强度与患者的年龄、性别、分化程度及有无淋巴结转移无相关性,P>0·05。结论:Survivin的过度表达可能在鼻咽癌发生、发展过程中起一定作用,检测Survivin在鼻咽癌中的表达对鼻咽癌的诊断、临床分期有一定意义。     

人ENO1(Enolase-α)基因的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备

目的:构建人ENO1(human Enolase-α)基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白的表达,利用纯化后的蛋白制备具有活性的ENO1多克隆抗体.方法:用PCR方法从胃癌MKN45细胞全基因组中扩增出目的基因ENO1,将目的基因和原核表达载体pET30a(+)分别双酶切,回收酶切产物并用T4连接酶连接,获得重组质粒pET30a(+)-ENO1.将重组质粒转入大肠埃希菌菌株BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化,利用纯化的ENO1活性蛋白作为抗原免疫家兔,制备抗血清多克隆抗体,并用Western blot检测其特异性.结果:目的基因与原核表达载体经双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果表明重组人ENO1基因序列与NCBI(NM_001428.3)公布序列一致.经SDS-PAGE分析,结果显示重组蛋白的分子量约在47kDa,条带单一,无杂带出现,主要以可溶性形式存在.Western blot证实多克隆抗体制备成功.结论:成功表达、纯化了ENO1融合蛋白,制备了具有高特异性的多克隆抗体,为进一步肿瘤疫苗的研制和肿瘤标志物快速诊断的研究奠定基础.     

人MAGE-3真核表达载体的构建与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异性抗原MAGE-3基因，构建真核表达载体，建立MAGE-3阳性细胞株，制备肿瘤核酸疫苗。方法 用RT—PCR方法扩增MAGE-3cDNA，以pcDNA3．1 为载体，构建重组表达质粒pcDNA3．1／MAGE-3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞，经RT—PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达。结果 正确构建了pcDNA3．1／MAGE-3重组质粒，并且在转化细胞中检测到了MAGE-3的表达。结论 成功构建了pcDNA3．1／MAGE-3真核表达质粒，建立了稳定表达人MAGE-3的鼠B16细胞株。     

肺癌转移抑制基因和多药耐药蛋白的表达及意义

目的 :研究肺癌转移抑制基因 (KAI1)和多药耐药蛋白 (MRP)的表达水平及内在联系。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)分别检测肺癌组织中MRP和KAI1。结果 :在肺癌组织中MRP阳性表达率为 4 5 8% (2 2 4 8) ,KAI1阳性表达率为 2 2 9% (11 4 8)。在Ⅰ、Ⅱ期患者中 ,KAI1基因为高表达 ;在Ⅲ期患者中 ,MRP基因为高表达。结论 :早期肺癌患者KAI1基因呈高表达 ,而在晚期患者MRP基因高表达 ,两者之间可能通过p5 3基因来调控