小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性和相关基因的表达

目的:观察小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性并检测其相关基因的表达。方法:实验于2005-02/06在暨南大学医学院中心实验室进行。①取妊娠13.5d昆明小鼠分离胚胎大脑中的神经干细胞,用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行体外培养,取培养3d的神经球接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶,用含血清的培养基诱导分化。②免疫细胞化学检测细胞表面抗原。③四甲基偶氮唑盐法绘制生长曲线。④流式细胞术检测细胞周期。⑤反转录-聚合酶链反应和免疫细胞化学技术对神经干细胞进行鉴定。结果:①胚胎神经干细胞及其分化细胞的抗原表达:血清诱导8h,分化细胞中(8.9±5.6)%细胞呈Tubulin阳性,(87.5±7.4)%细胞胞浆呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达。未诱导细胞近100%呈巢蛋白阳性,仅有极少数细胞Tubulin阳性或胶质纤维酸性蛋白阳性。②胚胎神经干细胞的细胞周期:从小鼠胚胎大脑获取的神经干细胞3d左右进入指数生长期;原代培养细胞83.8%处于静止期/DNA合成前期。③原代与传代细胞均表达巢蛋白mRNA,聚集形成的神经球巢蛋白阳性。血清诱导4h胚胎神经干细胞开始转录神经元相关基因Tau和胶质细胞相关基因胶质纤维酸性蛋白。结论:从小鼠胚胎大脑可成功分离获得大量胚胎神经干细胞,并在含碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基中迅速增殖,血清诱导下分化生成神经元和星型胶质细胞。     

联合神经生长因子诱导小鼠胎肝间充质干细胞向神经外胚层分化

目的：观察小鼠胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子的作用下向神经细胞分化的能力。方法：实验于2004-03／09在暨南大学血液病研究所完成。健康BABL／c小鼠按雌雄2：1的比例合笼过夜，第2天分开并检查。以见到阴栓为怀孕的标准，计为孕0．5d。分离孕13．5d BABL／C胎鼠肝脏，贴壁法收获胎肝间充质干细胞。用以下方案进行诱导：碱性成纤维生长因子（10μg/L 4d；碱性成纤维生长因子（10μg/L和成纤维生长因子8（10μg/L）4d；碱性成纤维生长因子（10μg/L、脑源性神经营养因子（10μg/L以及2％的B27 4d。观察诱导细胞的形态学变化。于诱导0,4，12d收获细胞，反转录聚合酶链反应检测神经特异性基因表达；免疫细胞染色检测神经特异性蛋白的表达。以上实验均重复3次。结果：①形态学变化：经贴壁法分离的胎肝间充质干细胞呈均质梭形。碱性成纤维生长因子诱导3d，胎肝间充质干细胞开始变圆并聚集，呈神经干细胞样形态。经成纤维生长因子8和脑源性神经营养因子的进一步诱导后，大部分细胞呈现典型的神经元样细胞形态，极少数细胞呈星形胶质细胞样形态。②胎肝间充质干细胞经过神经生长因子的顺序诱导后，表达神经特异性基因：未诱导的胎肝问充质干细胞巢蛋白（nestin神经干细胞特异性）、低分子量神经丝蛋白（神经元特异性）、胶质纤维酸性蛋白基因（星形胶质细胞特异性）表达与看家基因（甘油醛-3磷酸脱氢酶）的比值分别为（0.06&;#177;0.02）,0,0；诱导4d分别为（0．59&;#177;0．11），（0．46&;#177;0．23），（0．20&;#177;0．96）；诱导12d分别为（0．21&;#177;0．07），（0．85&;#177;0．31），（0．13&;#177;0．10）。每种基因在不同诱导时间的表达具有统计学差异（P〈0．01）。③经过神经生长因子的顺序诱导，胎肝问充质干细胞表达神经特异性蛋白：未诱导的细胞不表达巢蛋白（神经干细胞特异性）、微管蛋白Tubulin（神经元特异性）以及胶质纤维酸性蛋白（星形胶质细胞特异性）；诱导4d，圆形细胞及细胞团nestin染色阳性，Tubulin阳性细胞为（62．3&;#177;3．5）%，仅有（6．0&;#177;1．6）％的细胞显示胶质纤维酸性蛋白阳性；诱导12d，巢蛋白阳性细胞开始减少，Tubulin阳性细胞达（90．3&;#177;1．5）％；胶质纤维酸性蛋白阳性细胞为（4．7&;#177;1．5）%。诱导12d的细胞微管蛋白Tubulin阳性表达率与诱导4d的细胞相比有统计学差异；而诱导12d的细胞胶质纤维酸性蛋白阳性表达率与诱导4d的细胞相比没有统计学差异。结论：胎肝间充质干细胞在联合神经生长因子提供的信号作用下可以分化为神经元样细胞，诱导结束后，细胞表现为典型的神经元形态并表达神经元特异性蛋白Tubulin。     

地黄多糖诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的效应

目的：探讨地黄多糖对骨髓问充质干细胞分化为神经细胞的诱导效应。方法：实验于2004-03／06在湖南省中医学院内科实验室进行，取1月龄SD大鼠1只，取股骨和胫骨，利用贴壁法分离纯化骨髓问充质干细胞。将骨髓间充质干细胞分为3组：地黄多糖组用地黄多糖诱导其向神经细胞分化，β-巯基乙醇组β-巯基乙醇诱导，对照组不做任何处理。光镜下观察细胞形态，采用免疫细胞化学方法鉴定神经细胞特异性抗原标志神经丝蛋白和神经胶质细胞特异性抗原胶质纤维酸性蛋白的表达。结果：地黄多糖组经地黄多糖诱导培养24h后细胞显示为典型的神经细胞样形态，神经丝蛋白阳性为(82．3&;#177;6．1)％，胶质纤维酸性蛋白阳性细胞为(10．5&;#177;2．1)％。β-巯基乙醇组的细胞神经丝蛋白及胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数较少，分别为(22．3&;#177;4．7)％，(42．3&;#177;5．3)％。对照组神经丝蛋白及胶质纤维酸性蛋白染色均为阴性：结论：地黄多糖具有诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的作用，其机制需探讨。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景:神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。目的:观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。方法:从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。结果与结论:从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的：比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性，为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法：实验于2004-11／2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养，每3天换液1／2，每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中，补足神经干细胞分化培养基，继续培养7d，进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定，以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力，并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果：①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果：胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞，并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果：原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应，结合悬浮培养有神经球形成的现象，证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数，阳性率的比较：两组培养1，3，7，11，14，28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异（t=2．41～92．7l，P〈0．01或0．05）。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定：胚胎鼠及新生鼠的MAB阳性细胞分别为（32．6&;#177;5．6）％，（30．7&;#177;6．7）％，抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为（47．5&;#177;9．4）％，（50．3&;#177;8．9）％，P均〉0．05。结论：从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞，表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin，并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强，更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

大鼠脑室膜管下区神经干细胞的贴壁培养及其分化特征

目的：探索大鼠脑室管膜下区神经干细胞的贴壁培养方法及其体外分化特性。方法：实验于2004—10／12在华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科实验室进行。取出生24h内的SD大鼠，分离其室管膜下区神经干细胞，应用无血清Neurobasal培养基（含20g／L B27，20μg/L碱性成纤维生长因子、20μg／L表皮生长因子）进行贴壁培养。采用巢蛋白抗体鉴定培养细胞，以5-溴脱氧尿嘧啶核苷掺入法检测细胞增殖能力。体积分数为0．05胎牛血清诱导神经干细胞分化后，用神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞标志物微管相关蛋白、胶质纤维酸性蛋白和2，3-环核苷酸磷酸二酯酶相应抗体检测神经干细胞分化情况。结果：①在细胞培养第4，5天即可见培养基中出现大量的由几十个细胞构成的结构紧密、大小不等的悬浮细胞球，即神经球。②神经球贴壁培养24-48h后形成片状细胞克隆，细胞呈梭形或多角形。③细胞一般七八天传代一次，经七八次传代，培养2个月左右，细胞进入生长停滞状态。④贴壁培养的细胞巢蛋白染色及5-溴脱氧尿嘧啶核苷染色均为阳性。在培养基中加入血清后，免疫细胞化学检测分化后细胞包括微管相关蛋白阳性、胶质纤维酸性蛋白阳性和2，3-环核苷酸磷酸二酯酶阳性细胞，巢蛋白表达均为阴性。结论：贴壁培养的神经干细胞在体外经多次传代培养后仍可保持较强的增殖能力，仍保持了其本身的特性，同时具有多分化潜能的特性，因此可以认为贴壁培养法可作为一种理想的神经干细胞的培养方法。     

体外培养诱导成人骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的实验

目的：以含有碱性成纤维细胞生长因子和二甲基亚砜的培养液对原代培养的成人骨骼肌干细胞进行诱导，探讨其转化为神经细胞的可行性。 方法：实验于2004-06／12在军事医学科学院基础医学研究所完成。实验所用3例成人正常颞肌标本取白于开颅手术患者，由北京协和医院神经外科提供，患者知情同意。机械分离加混合消化液处理分离单细胞，体外培养及克隆纯化，培养至第3代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子二甲基亚砜的培养液诱导分化，进行反转录-聚合酶链反应分析和免疫荧光细胞化学染色．观察诱导后细胞形态变化，同时结合普通光线在100倍下随机计数6个视野（大于100个细胞），计算阳性细胞的百分比。 结果：①骨骼肌干细胞培养24h后见少量细胞贴壁呈短的梭形或棒状。培养第3天红细胞开始裂解成细胞碎屑并聚集、悬浮在培养基中．这些碎屑随着换液而逐渐消失。克隆培养的细胞大约于接种后两三周才能铺满孔底，胞体呈梭形．排列规整。②荧光显微镜下胞核蓝染，每个细胞都呈Desmin染色阳性，证明成人骨骼肌干细胞能够在体外进行克隆培养。③在含有碱性成纤维细胞生长因子和二甲基亚砜的培养液诱导下，骨骼肌干细胞可分化为形态上类似于神经元和星形胶质细胞的细胞。④反转录-聚合酶链反应分析证实诱导后的骨骼肌干细胞有神经丝蛋白和胶质纤维酸性蛋白基因表达。⑤免疫荧光细胞化学检测到诱导后的骨骼肌干细胞呈神经丝蛋白和胶质纤维酸性蛋白免疫反应阳性。⑥诱导后骨骼肌干细胞分化为神经丝蛋白阳性细胞的比例为（35．9&;#177;6．3）％，分化为胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的比例为（43．7&;#177;5．3）％。 结论：成人骨骼肌干细胞在体外经诱导分化后形态类似于神经元和星形胶质细胞，并且表达神经元标志物神经丝蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白，认为成人骨骼肌干细胞在体外可诱导分化为神经元和星形胶质细胞。     

胎鼠纹状体神经干细胞分离培养方法的改进

目的：利用有血清和多聚赖氨酸培养液中加入SD14d胚胎大鼠纹状体区神经干细胞，探讨其分离、纯化神经干细胞操作技术的改进。方法：实验于2003—03／2004-11在广州第一军医大学珠江医院神经外科实验室完成。①选用SD大鼠20只，取孕13～14d的SD大鼠胚胎纹状体，吸管吹打（不超过10次）后，用组织剪剪成1mm，块状，以1．25mL／L的胰酶，在37℃下消化20min，以S—Dulbeeeo改良的Eagle培养基-F12中止消化，采用1000r／min离心10min，显微镜下细胞记数，以1&;#215;10^4／cm^2接种到改良的有血清和多聚赖氨酸铺被的12孔培养板上，培养液为Dulbeeeo改良的Eagle培养基-F12加上B27，加入血清和20μg／L表皮生长因子。7d后用吸管吸取漂浮的细胞球，机械吹打成单细胞悬液，按每培养孔1&;#215;10^4/cm^2细胞行传代再培养，此后5～7d再传代，方法同前。②利用神经干细胞与星形胶质细胞、神经细胞以及成纤维细胞贴壁之间的差异，使细胞分为贴壁和漂浮的两层细胞．分离去掉贴壁的神经细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞以及部分的神经干细胞，得到漂浮的细胞球。③机械吹打后制成单细胞悬液，再传代培养，细胞重新增殖成细胞球，应用免疫细胞化学技术特异性抗原巢蛋白检测最初的细胞球、吹打后的单细胞和重新增殖的细胞球巢蛋白抗原的表达和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。巢蛋白为神经干细胞特异性标记物，其阳性表达表明神经干细胞的存在。结果：①原代培养的纹状体细胞第2天叮见贴壁生长的神经细胞、星形胶质细胞和增殖的细胞球（约10-16个细胞大小），漂浮的细胞开始出芽并增殖；第3天贴壁的细胞球继续增殖（约50个细胞大小），漂浮的细胞则增殖成4-8个大小的细胞球；第4-7天贴壁的细胞球开始分化，漂浮的细胞则继续增殖成约30个细胞大小的细胞球，巢蛋白染色阳性。②漂浮的细胞，吹打后行传代培养，加入表皮生长因子、血清和多聚赖氨酸，细胞仍漂浮生长，1周后增殖成约70-80个细胞大小的细胞球，吸管吹打继续再培养，细胞仍漂浮增殖成细胞球，巢蛋白抗原表现阳性。③免疫细胞化学染色显示原代培养中贴壁的细胞球、吹打后的单细胞、漂浮的细胞球巢蛋白染色阳性，吹打后的细胞若不加入表皮生长因子，则细胞染色显示胶质纤维酸性蛋白和神经丝蛋白阳性。分离纯化后的细胞具有自我更新能力和多分化潜能，有很强的增殖能力。结论：利用有血清和多聚赖氨酸加入的方法分离培养的原代细胞球巢蛋白表达阳性，具有纯化度高，存活时间长的特点。     

新生小鼠脊髓神经干细胞体外增殖及其多潜能分化特性

目的：观察新生小鼠脊髓神经干细胞的体外增殖及其分化特性。 方法：实验于2005—11／2006-02在安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室完成。①在无菌条件下，利用显微解剖分离新生小鼠（出生后2d内）脊髓，采用原代机械吹打使其成为单细胞悬液，离心，弃去上清液，加入于细胞培养液（含20μg／L碱性成纤维细胞生长因子，20μg／L表皮生长因子，B27辅助培养液），以1&;#215;10^8L^-1。密度接种于25mL培养瓶中，进行原代培养。②将原代培养7d左右的细胞再次离心。弃去上清，加入干细胞培养液，机械吹打成单细胞悬液，以5&;#215;10^7L^-1密度进行传代培养海六七天传代1次。③机械吹打制成的单细胞悬液．经过传代培养。重新增殖为神经球，采用巢蛋白抗体鉴定培养细胞，用体积分数为0．1的胎牛血清诱导神经干细胞分化后，用神经元和星型胶质细胞标志物微管相关蛋白，胶质纤维酸性蛋白相应抗体检测神经干细胞分化情况。 结果：①脊髓源性神经千细胞形态学观察：在细胞培养第3,4天即可见培养基中出现由几个或十几个细胞组成的结构紧密、大小不等的悬浮细胞团块，称之为“神经细胞球”；随着培养时间的延长和多次传代换液，细胞增殖迅速，神经细胞球数目明显增多。②脊髓神经干细胞的分化与鉴定：将神经球转入含体积分数为0．1的胎牛血清的培养液中。数小时内迅速贴壁并开始分化，5d后分化的细胞呈现出3种典型的神经细胞形态；免疫细胞化学检测神经细胞球巢蛋白染色阳性及其分化的神经元和星型胶质细胞微管相关蛋白、胶质纤维酸性蛋白分别染色阳性。 结论：新生小鼠脊髓存在具有多分化潜能的神经干细胞。它们可以在体外大量增殖，经过诱导可朝神经元和胶质细胞的方向分化。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

Determination of loss of quality of life

Physiatrists are a valuable resource in legal settings, where assessment of functional capacity to perform work and of future medical needs must be determined. Physiatrists help determine what future medical care is needed to restore and maintain an individual at the maximum level of life function. This article focuses on the use of a quality of life (QOL) rehabilitation model, rather than a medical model, for enhancing functional performance, modifying environments, and facilitating patient coping. We discuss use of the QOL model to describe and influence a patient's physical, psychological, cognitive, vocational/economic, and social/leisure domains.     

血液透析患者家庭护理提供者的生活质量调查

目的:了解江汉油田血液透析(血液透析)患者家庭护理提供者(护理者)的生活质量。方法:对60例血液透析患者的家庭护理提供者进行一般情况和生活质量综合评定问卷(QOLI-74)调查,并进行相关性和多因素回归分析。结果:家庭护理提供者各维度的主观生活满意度与其客观指标相关,但也与其需求、年龄、文化程度、与患者的关系有关。结论:客观状态是影响主观生活满意度的重要因素,同时应考虑护理者的需求、年龄、文化程度、与患者的关系对护理者主观生活满意度的影响。     

星状神经节阻滞治疗失眠疗效观察

失眠症又称不寐，指入睡困难，或维持睡眠障碍（易醒、早醒和再入睡困难）导致睡眠时间减少或睡眠质量下降，不能满足身体生理需要，明显影响日间社会功能和生活质量。现将星状神经节阻滞治疗失眠疗效观察总结如下。