小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性和相关基因的表达

目的:观察小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性并检测其相关基因的表达。方法:实验于2005-02/06在暨南大学医学院中心实验室进行。①取妊娠13.5d昆明小鼠分离胚胎大脑中的神经干细胞,用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行体外培养,取培养3d的神经球接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶,用含血清的培养基诱导分化。②免疫细胞化学检测细胞表面抗原。③四甲基偶氮唑盐法绘制生长曲线。④流式细胞术检测细胞周期。⑤反转录-聚合酶链反应和免疫细胞化学技术对神经干细胞进行鉴定。结果:①胚胎神经干细胞及其分化细胞的抗原表达:血清诱导8h,分化细胞中(8.9±5.6)%细胞呈Tubulin阳性,(87.5±7.4)%细胞胞浆呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达。未诱导细胞近100%呈巢蛋白阳性,仅有极少数细胞Tubulin阳性或胶质纤维酸性蛋白阳性。②胚胎神经干细胞的细胞周期:从小鼠胚胎大脑获取的神经干细胞3d左右进入指数生长期;原代培养细胞83.8%处于静止期/DNA合成前期。③原代与传代细胞均表达巢蛋白mRNA,聚集形成的神经球巢蛋白阳性。血清诱导4h胚胎神经干细胞开始转录神经元相关基因Tau和胶质细胞相关基因胶质纤维酸性蛋白。结论:从小鼠胚胎大脑可成功分离获得大量胚胎神经干细胞,并在含碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基中迅速增殖,血清诱导下分化生成神经元和星型胶质细胞。     

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的：比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性，为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法：实验于2004-11／2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养，每3天换液1／2，每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中，补足神经干细胞分化培养基，继续培养7d，进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定，以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力，并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果：①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果：胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞，并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果：原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应，结合悬浮培养有神经球形成的现象，证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数，阳性率的比较：两组培养1，3，7，11，14，28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异（t=2．41～92．7l，P〈0．01或0．05）。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定：胚胎鼠及新生鼠的MAB阳性细胞分别为（32．6&;#177;5．6）％，（30．7&;#177;6．7）％，抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为（47．5&;#177;9．4）％，（50．3&;#177;8．9）％，P均〉0．05。结论：从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞，表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin，并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强，更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

单细胞反转录酶聚合链式反应技术对胰岛干细胞标记物胰岛素促进因子的鉴别

目的：利用干细胞分化获得胰岛细胞后目前还没有较理想的鉴别方法，实验通过单细胞反转录酶聚合链式反应技术鉴别胰岛干细胞标记物胰岛素促进因子，以建立一种检测胰岛干细胞的有效方法。方法：实验于2001-10／2005-08在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成。①将收集培养2～4周的单个胰岛干细胞用于实验。②胰岛活性测定实验中，选择1&;#215;10^6分化的胰腺干细胞，用低浓度和高浓度葡萄糖分别刺激1～4h，检测12，14，24d培养液中胰岛素的浓度。③单细胞反转录酶聚合链式反应检测胰岛素促进因子基因实验中，选择12个单个胰腺干细胞进行检测，另取12个单个未分化的干细胞作为对照。聚合链式反应体系为20μL。聚合链式反应扩增反应条件为94℃预变性4min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸2min条件下循环35次。聚合链式反应产物以质量浓度为20g/L的琼脂糖凝胶电泳。结果：①分化的胰腺干细胞培养液中胰岛素浓度的检测：培养12，14，24d时培养液中胰岛素的浓度分别为42．6，68．2，73．5IU／L，随着时间的延长，呈逐渐升高的趋势。②单个胰岛干细胞胰岛素促进因子反转录酶聚合链式反应检测结果：12个单个胰岛干细胞中有7个胰岛素促进因子表达呈阳性，而作为对照的12个未分化干细胞均未检出，两者差异显著（P〈0．001）。结论：采用单细胞反转录酶聚合链式反应检测方法为胰腺干细胞的鉴定和纯化提供了技术保障，证明单细胞反转录酶聚合链式反应是一种检测胰腺干细胞标记物的有效方法。     

生长相关蛋白在脊髓源性神经干细胞向神经主细胞分化过程中的表达

目的：探讨脊髓源性神经干细胞向神经元诱导分化过程中生长相关蛋白43的表达，分析其对脊髓损伤修复的主导作用。方法：实验于2003-03／09在中国医科大学实验动物中心完成。取15只孕14d的胎鼠，自胎鼠的脊髓区提取神经干细胞，经培养及神经巢蛋白免疫细胞化学鉴定，观察在神经干细胞定向诱导分化为神经元过程中，生长相关蛋白43于不同时间点的形态学表达。培养液为添加B27(2％)、碱性成纤维细胞生长因子(20mg／L)、表皮细胞生长因子(20mg／L)的无血清培养基DMEM／F12。置于37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱中悬浮培养，观察其生长情况，每3天换液1次，共培养5次。分别于分化1，2，4，8d取出载玻片，对生长相关蛋白的表达进行免疫组化检测。总细胞和阳性细胞在显微镜下计数。结果：15只胎鼠的脊髓源性神经干细胞全部进入结果分析。①神经干细胞的培养情况：培养24h后，可见神经球；第2天时，神经球数目增多，呈桑椹状，折光性强，死细胞无光泽，仅有轮廓。②神经干细胞的鉴定结果：免疫细胞化学染色可见神经球内圆形细胞呈神经巢蛋白抗原强阳性，核未着色。神经干细胞定向分化后，细胞逐渐贴壁，到第4，8天时，细胞逐渐变大，突起变长，偶见多个突起。神经元特异性烯醇化酶阳性的神经元，胞浆及核膜出现棕色阳性反应，细胞核大而圆，无着色。细胞连续计数共712个，其中神经元特异性烯醇化酶阳性细胞296个，比例为41．57％。⑧神经干细胞分化过程中生长相关蛋白表达的测定：神经干细胞分化第1天，胞质内出现生长相关蛋白，第4天表达增强，于核周及突起中明显，逐渐向胞膜转移，并且长的突起与其他细胞的突起之间形成连接，至分化第8天时这种突起生长停止，神经干细胞分化为成熟的神经元细胞，生长相关蛋白反应减弱并消失。细胞连续计数共736个，其中生长相关蛋白阳性细胞246个，比例为33．42％。结论：在神经干细胞分化为神经元的过程中，生长相关蛋白基因呈一过性表达，参与引导突起的生长并发挥促进作用。     

体外分离培养兔脂肪干细胞的生物学特性

目的：建立兔脂肪干细胞的体外分离培养方法，鉴定并分析其生物学特性。方法：实验于2005—06／2006—03在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成。选用雌性新西兰大白兔，兔龄4个月，无菌取出雌兔双侧腹股沟脂肪垫，贴壁法及Ⅰ型胶原酶法分离出兔脂肪干细胞，并进行体外培养，取5代以后的兔脂肪干细胞观察其形态特征，并绘制细胞生长曲线及倍增时间，同时进行细胞过氧化物酶、苏丹黑B、碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原化学染色；用流式细胞仪检测其细胞表面标志并进行细胞周期分析。结果：①兔脂肪干细胞原代及传代细胞形态：原代及传代的兔脂肪干细胞均呈长梭形或多边形贴壁生长，生长分化活跃。②兔脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间：传代的兔脂肪干细胞生长曲线呈“S”形，群体倍增时间为22h。③兔脂肪干细胞的化学染色特点：兔脂肪干细胞的过氧化物酶、苏丹黑B染色呈阴性，而碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原染色呈阳性。④兔脂肪干细胞表面标志及细胞周期：流式细胞仪检测结果显示兔脂肪干细胞的表面标志物CD29，CD44，CD90，CD15，CD166表达阳性，而CD31，CD34，CD45和CD106表达阴性。细胞周期分析显示，G0／G1期占80．25％，G2/M期占6．03％，S期占13．72％。结论：本次实验所分离出来的兔脂肪干细胞在体外具有生长稳定，增殖较快的特点。     

胚胎干细胞体外定向诱导分化为胰岛细胞的相关研究

目的:了解胚胎干细胞作为种子细胞治疗糖尿病的应用前景以及诱导分化为胰岛细胞的相关研究概况。资料来源:应用计算机检索NCBI Pubmed数据库1980-01/2006-04关于胚胎干细胞诱导分化为胰岛细胞研究的文章,检索词为"embryonic stem cells,beta cells,insulin secreting cells",并限定文章语言种类为English。同时计算机检索CNKI数据库1980-01/2006-04关于胚胎干细胞定向诱导分化的文章,检索词为"胚胎干细胞,胰岛细胞,胰岛素分泌细胞",并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:!论据可靠的实验文章。#观点明确、条理清晰、信息量好的综述性文章。$文献主题与本课题相关的文章。排除标准:论据不充分、设计不合理、结论不可靠的实验性文章,观点模糊的综述性文章。资料提炼:共检索到40篇相关文献,30篇文献符合纳入标准,排除的10篇为内容陈旧或重复。符合纳入标准的30篇文献中,分别涉及胚胎干细胞治疗糖尿病的应用前景、胰腺发育过程相关调控机制、应用各种诱导因子和基因方法对胚胎干细胞进行调控的实验方法、对诱导分化的胰岛细胞进行功能检测等内容。资料综合:糖尿病是严重威胁人类健康的疾病之一,胰岛细胞移植是治愈糖尿病的可能方法,但由于胰岛细胞数量有限,不能满足临床需要,人们开始寻找胰岛细胞的可替代资源。胚胎干细胞具有广泛的功能,可以被诱导分化为各种组织细胞,用于各种疾病的治疗,因此胚胎干细胞成为人们研究的首选种子细胞。首先对胚胎干细胞进行培养鉴定,然后通过各种方法对其进行诱导分化,主要有两种分化方案:①可以通过加入各种诱导因子,使其朝人们所期望的方向分化。②利用基因工程技术,将胰腺发育过程中调控其发育的各种基因转入细胞,可将胚胎干细胞定向诱导分化为胰岛细胞,提高了诱导分化的可调控性。除胰岛细胞外人们还对其他细胞进行了相关研究,以期能得到更多的可供利用的资源。结论:胚胎干细胞具有全能性,理论上可以发育为各种组织细胞,人们已经通过各种诱导因子和基因调控方法将其诱导为胰岛细胞,并且证明这种诱导的细胞可以维持糖尿病鼠血糖及体重的稳定,但由于微环境因素影响,要将起大量诱导分化为胰岛细胞仍需要更多的实验研究。     

脂肪干细胞体外分化为内皮细胞的可行性

目的：以内皮前体细胞为对照，探讨具有多向分化性能的脂肪干细胞的体外培养和分化为内皮细胞的可能性。方法：①实验于2003-10／2004-02在解放军总医院心内科实验室完成。选用雄性壮年和老年新西兰白兔各3只。②抽取兔髂骨骨髓，Percoll密度梯度离心后取单个核细胞，采用贴壁法以内皮细胞专用培养基（添加体积分数0．2胎牛血清，内皮细胞基本培养基2和辅助因子碱性成纤维细胞生长因子，氢化可的松，血管内皮生长因子，表皮生长因子，胰岛素样生长因子1，抗坏血酸，庆大霉素等）培养扩增内皮前体细胞。③取兔腹部皮下脂肪组织，胰蛋白酶消化提取脂肪干细胞，Iseove改良的Dulbecco培养基培养扩增，将第2代脂肪干细胞传代后，分为2份，分别用内皮细胞专用培养基和Iscove改良的Dulbecco培养基培养2～4周，观察细胞的变化。用乙酰化低密度脂蛋白，Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体鉴定，观察脂肪干细胞是否分化为内皮细胞。结果：①原代内皮前体细胞接种后48h才能贴壁，生长非常缓慢，呈集落状生长，一般需要10d左右才能形成较大的集落，达到传代的目的，传代细胞生长迅速。内皮前体细胞必须使用含有多种刺激因子的培养基才能生长。②脂肪干细胞培养无需刺激因子，原代细胞接种12h后即开始贴壁，继而迅速进入对数生长期，无集落形成，原代和传代细胞均生长迅速。将脂肪干细胞采用内皮细胞专用培养基培养2周后，细胞形态未见明显变化，但与内皮前体细胞一样，大部分细胞采用乙酰化低密度脂蛋白，Ⅰ型荆豆凝集素和鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体检测均为阳性；培养3周后细胞的贴壁习性改变，几乎所用细胞均为阳性．而采用Iscove改良的Dulbecco培养基培养的脂肪干细胞采用上述检测均为阴性。③壮年兔骨髓中内皮前体细胞含量较高，培养后能保持旺盛的分裂能力；老年兔骨髓中内皮前体细胞含量明显减少，有的老年动物骨髓甚至难以培养出内皮前体细胞，而且培养时细胞容易老化，表现为细胞体积增大，形态呈扁平状或不规则，细胞浆增多而核变小。壮年兔和老年兔脂肪干细胞在生长速度和细胞形态方面没有明显差别。结论：①脂肪干细胞培养远比内皮前体细胞简单，它不需要多种细胞因子刺激即可生长。②脂肪干细胞在使用内皮细胞专用培养基诱导后可快速分化为内皮细胞。③脂肪组织中有大量的脂肪干细胞，其体外增长和分化能力受年龄影响较小，而骨髓中内皮前体细胞含量和扩增性能受年龄影响较大。     

人胚胎神经干细胞分离、培养、纯化及增殖潜能的特点

目的：探讨获取和培养人胚胎神经干细胞的方法。方法：实验于2003-09／2004—12在重庆医科大学基础研究所完成。人胚胎来源为7-12周人工药物流产胎儿，由重庆医科大学附属第二医院及重庆市妇幼保健院提供，征得产妇本人同意。①从人胚胎大脑皮质中分离、培养、纯化原代神经干细胞，经体外反复传代培养以获得能在体外长期生存的神经干细胞。②免疫细胞化学鉴定神经干细胞特异性表达抗原。⑧观察不同种植细胞密度对神经干细胞增殖的影响，分析其生长特点并绘制生长曲线。④采用悬浮细胞培养法扩增细胞，冷冻复苏后观察细胞的生物学特性。结果：①人胚胎神经干细胞体外生长特点：从7～12周流产胎儿大脑皮质中获得了能在体外长期生存的神经干细胞。经体外传至15代，神经干细胞细胞数量扩增至200倍。②神经干细胞接种密度对增生的影响：当种植细胞的密度为1&;#215;10^5L^-1,1&;#215;10^7L^-1时，体外培养30d后仍呈单细胞贴壁状态。以1&;#215;10^9L^-1细胞密度接种时，12h后即见多个单细胞聚成的小球，悬浮生长。③神经干细胞自我更新能力的检测结果：多数单个细胞在培养后24～48h分裂为2-4个细胞的小克隆，7～10d均发展为上百个细胞的较大的克隆。④nestin抗原的表达：培养的神经干细胞神经球nestin免疫细胞染色均呈阳性。⑤神经干细胞多向分化能力检测：NSE和GFAP免疫细胞化学染色显示，被测细胞胞浆有棕黄色颗粒沉着，呈阳性表达。⑥神经干细胞复苏后的存活率：冻存1，4，8，12周的神经干细胞存活率基本相似[（80．2&;#177;1．8）％，（80．1&;#177;1．2）％，（79．9&;#177;0．8）％，（80．1&;#177;2．1）％，P〉0．05]。结论：成功地从人胚胎大脑皮质中分离得到了神经干细胞。经体外培养证明：人胚胎神经干细胞具有自我更新增殖能力和向神经元样细胞、星形胶质样细胞分化的潜能。     

胚胎和新生大鼠神经干细胞培养与分化的特性比较

目的:比较胚胎和新生大鼠神经干细胞的体外培养与诱导分化特性,为脊髓损伤、神经再生等疾病的治疗提供参考依据。方法:实验于2004-11/2005-05在安徽医科大学微生物学实验室完成。选取清洁级孕12d的SD大鼠和新生1d的SD大鼠各1只。①分别将胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质体外分离培养,每3天换液1/2,每7d传代1次。②选取第3代神经干细胞克隆球吹打成单细胞悬液接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片的12孔培养板中,补足神经干细胞分化培养基,继续培养7d,进行神经干细胞的诱导分化。③通过形态学观察和Nestin免疫细胞化学鉴定,以及5-溴脱氧尿核苷法检测神经干细胞的增殖能力,并检测分化成熟的神经细胞标志抗原MAP2、胶质纤维酸性蛋白抗原的阳性细胞数及细胞总数。结果:①胚胎鼠与新生鼠原代、传代、分化培养的细胞形态学观察结果:胚胎鼠形成的神经球数量和每个神经球所含细胞数均多于新生鼠。胚胎鼠与新生鼠培养的球形克隆均可连续传代获得大量亚克隆细胞,并诱导分化成3种主要形态的神经细胞。②神经干细胞的鉴定结果:原代和传代的细胞均呈神经干细胞标志性蛋白-Nestin阳性反应,结合悬浮培养有神经球形成的现象,证明所观察细胞为神经干细胞。③胚胎鼠与新生鼠不同时间段单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数、阳性率的比较:两组培养1,3,7,11,14,28d后单位面积Nestin与5-溴脱氧尿核苷阳性细胞数、细胞总数及阳性率均有显著差异(t=2.41～92.71,P<0.01或0.05)。④胚胎鼠与新生鼠神经干细胞分化指标的测定:胚胎鼠及新生鼠的MAP2阳性细胞分别为(32.6±5.6)%,(30.7±6.7)%,抗原胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分别为(47.5±9.4)%,(50.3±8.9)%,P均>0.05。结论:从胚胎鼠和新生鼠的大脑皮质均能够成功分离培养出神经干细胞,表达神经干细胞特异性标志蛋白Nestin,并具有自我更新及体外扩增传代能力。胚胎鼠神经干细胞数量多且增殖能力强,更适合用于神经再生与修复的临床治疗。     

大鼠胚胎神经干细胞体外分化时间的特异性

背景：目前对于神经干细胞体外培养过程中神经干细胞自身分化特性的变化研究的较少。目的：观察大鼠胚胎神经干细胞体外分化的时间特异性。方法：利用无血清悬浮培养的方法分离培养大鼠胚胎皮质神经干细胞,取不同培养时间的神经干细胞进行诱导分化,检测其分化特性的改变。结果与结论：体外培养的神经干细胞早期分化以神经元为主,随着培养时间的增加,分化成神经元的比例下降,神经胶质细胞的比例增加,而神经干细胞分化成少突胶质细胞的潜能与培养时间无明显相关。提示体外培养的神经干细胞其分化成神经元的潜能随着培养时间的增加而降低,而分化成神经胶质细胞的潜能随培养时间的增加而增加,神经干细胞分化为少突胶质细胞的潜能无时间相关性。     

人胚胎脑皮质神经干细胞的体外分离及扩增特征

目的:观察从10￣12周胎龄人流产胚胎脑皮质分离、培养的神经干细胞的生长特性。方法:实验于2005-02/12在新桥医院神经外科实验室完成。实验对象为孕10￣12周流产的人胚胎脑皮质细胞,细胞的获取严格遵守医学伦理道德并得到医院许可。取胎龄10￣12周的流产胚胎皮质,吸管反复吹打机械分离制成单细胞悬液,使用DMEM/F12(1∶1)加B27的无血清培养基培养,同时加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子(均为20μg/L)以及白血病抑制因子(10μg/L)。连续传代培养,用有限稀释法观察神经干细胞的单细胞克隆情况。将部分经单细胞克隆扩增的细胞克隆种植于预先置有多聚赖氨酸涂布盖玻片的24孔培养板内,并加入新鲜培养基(体积分数为0.05的胎牛血清 DMEM/F12),采用免疫荧光细胞化学技术检测Nestin抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达情况。结果:①从人胚胎脑皮质分离得到的纯化的单个细胞可以增殖形成细胞克隆,即使在培养基中使用各种细胞因子而不使用胎牛血清,部分细胞团块也会贴壁。②经单细胞克隆方式扩增而来的细胞克隆在胎牛血清诱导分化及多聚赖氨酸辅助贴壁作用数小时后观察细胞已贴壁。③从皮质分离的细胞群保持着未分化状态,能够自我更新以及具有多向分化潜能,其生长需多种细胞因子的联合刺激。结论:从10￣12周胎龄人流产胚胎脑皮质分离的中枢神经系统的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,证实是神经干细胞。不论刺激因子及血清的有无,神经干细胞一旦贴壁就会启动其分化程序,而不再保持其干细胞特征,因此悬浮生长状态是神经干细胞体外培养生长的一种特性。     

鼠胚胎神经干细胞的体外培养及诱导分化

背景:随着神经干细胞培养技术条件的成熟,为颅脑损伤后神经系统功能重建、神经再生和神经系统疾病治疗提供了新的思路和途径.但移植所用的细胞来源及移植后的神经干细胞能否分化为神经细胞是急需解决的重要问题.目的:拟将体外分离培养的鼠胚胎神经干细胞稳定增殖传代,并诱导分化出神经系统的3种基本细胞.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-06/2008-06在新疆维吾尔自治区人民医院完成.材料:14～16d孕龄Wistar大鼠胚胎,由新疆自治区实验动物研究所和新疆医科大学实验动物中心提供.方法:取胎鼠额叶大脑皮质,组织块消化法体外分离培养神经干细胞,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖.原代培养7 d后,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导14 d.主要观察指标:倒置显微镜下观察神经干细胞的生长形态,并行巢蛋白免疫荧光染色鉴定.应用免疫组化染色检测诱导后神经干细胞的分化情况.结果:原代培养一两天细胞散在分布,胞体较小,呈圆形,折光性较好,3 d后逐渐形成由数个细胞组成的细胞球;传代后贴壁细胞多数分化为长梭形或扁平形的胶质细胞,10 d时可见大量由数十至数百个细胞组成的较大细胞球,其生长速度基本与原代培养相同,但成球速度明显加快;免疫荧光染色呈巢蛋白阳性反应.以含体积分数为10%胎牛血清的培养液诱导后,免疫化学染色示神经干细胞球呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白阳性表达.结论:实验成功从鼠胚胎脑皮质分离培养出神经干细胞,并诱导分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞.     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离与培养

背景：对于神经千细胞的分离培养,目前多采用胰蛋白酶对组织细胞予以消化,但消化时间较难把握。 目的：采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养,并进行初步的免疫组织化学检测。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2006～10/2007—09在广西医科大学基础医学实验室完成。材料：孕14-16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供。 方法：分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织,经胰酶消化加机械吹打后,在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清DMEMIF12培养基中培养。主要观察指标：用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。结果：培养24h后,细胞以悬浮方式生长,聚集成团：48h后形成由数十个细胞组成的细胞球,形态规则,体积大小不等,细胞无突起,形成典型的神经球,可传代扩增。免疫细胞化学染色结果示细胞巢蛋白呈阳性表达。 结论：在含有表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的无血清B27培养基条件下,有利于小鼠胚胎神经干细胞的体外培养和传代增殖。     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离及培养

目的:在神经干细胞的分离培养过程中,国内外的报道多数是用胰蛋白酶对组织细胞进行消化,但是消化时间比较难把握.采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养和初步的免疫组织化学检测,为相关研究建立实验条件.方法:实验于2006-10/2007-09在广西医科大学基础医学实验室完成.实验室为广西重点实验室、基础医学博士后工作站. ①实验材料:孕14～16 d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织,经胰酶消化加机械吹打后,在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清培养基中培养.③实验评估:用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞.结果:在无血清DMEM/F12培养液中,加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子及B27的条件下,培养24 h后可见细胞以悬浮方式生长,三五聚集成团块,48 h后形成由十数个至数十个细胞组成的,大小不等的细胞球,形态规则,细胞无突起,形成典型的神经球,可传代.免疫细胞化学法检测显示,细胞表达神经巢蛋白.结论:①来自昆明种小鼠胎脑的神经干细胞能在体外培养、增殖并具有增殖传代能力.②无血清B27培养基添加表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子有利于神经干细胞的体外培养和促进其增殖.     

昆明种小鼠胚胎神经干细胞的分离及培养

目的：在神经干细胞的分离培养过程中，国内外的报道多数是用胰蛋白酶对组织细胞进行消化，但是消化时间比较难把握。采用胰酶消化与机械分离法相结合的方式对昆明种小鼠胚胎脑神经干细胞进行分离、培养和初步的免疫组织化学检测，为相关研究建立实验条件。 方法：实验于2006—10／2007-09在广西医科大学基础医学实验室完成。实验室为广西重点实验室、基础医学博士后工作站。①实验材料：孕14-16d的昆明种小鼠由广西医科大学实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：分离昆明种小鼠胎鼠的脑组织，经胰酶消化加机械吹打后，在加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子的B27无血清培养基中培养。③实验评估：用免疫细胞化学方法鉴定分离的神经干细胞。 结果：在无血清DMEM／F12培养液中，加入碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子及B27的条件下，培养24h后可见细胞以悬浮方式生长，三五聚集成团块，48h后形成由十数个至数十个细胞组成的，大小不等的细胞球，形态规则，细胞无突起，形成典型的神经球，可传代。免疫细胞化学法检测显示，细胞表达神经巢蛋白。 结论：①来自昆明种小鼠胎脑的神经干细胞能在体外培养、增殖并具有增殖传代能力。②无血清B27培养基添加表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子有利于神经干细胞的体外培养和促进其增殖。     

无血清培养大鼠胚胎向神经干细胞的分化

背景:体外培养扩增获取大量、高纯度的神经干细胞是其移植应用的前提,无血清培养主要目的是去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长因子等干扰因素.目的:在无血清条件下体外分离培养大鼠胚胎神经干细胞,并观察其生物学特性.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-03/2006-03在河北医科大学第三医院中心实验室完成.材料:14～16 d龄SD胎鼠2只,由河北医科大学实验动物中心提供.方法:无菌条件下取胎鼠大脑皮质,剪碎后机械分离法制作单细胞悬液,加入含B27神经营养添加剂的无血清MEM/F12培养基进行培养,1周后传代.主要观察指标:免疫荧光染色鉴定神经干细胞巢蛋白的表达及传代能力,加入含血清的MEM/F12培养基诱导分化1周后免疫组化检测细胞分化情况.结果:培养48～72h细胞聚集悬浮生长,形成典犁的神经球,呈神经干细胞特异性抗原巢蛋白阳性表达.传代的神经干细胞置于BrdU培养液中5～7d形成次代神经球,呈BrdU阳性,表明次代神经球中绝大部分细胞为传代后细胞分裂而来,具有传代能力,传代后加入含血清的培养基后可以分化为微管相关蛋白2阳性细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞.结论:利用无血清培养技术可成功从胎鼠脑皮质中分离培养出具有分裂增殖能力及多向分化潜能的神经干细胞.     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的：观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。 方法：实验于2004-10／2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞（家属知情同意），采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成：DMEM／F12（1：1），表皮生长因子20μg／L，碱性成纤维细胞生长因子20μg／L，重组人白血病抑制因子10μg／L，N2添加剂（终浓度为10mL/L）。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。 结果：①人胚脊髓神经干细胞形态学观察：原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球，形态较规则，呈圆形，细胞边界清楚，折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后，细胞团生长速度明显加快；传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果：神经干细胞球，巢蛋白染色阳性；可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 结论：人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征，可进一步用于基础及临床研究。     

人胚胎脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化特征

目的:观察人胚脊髓神经干细胞的体外培养条件及分化情况。方法:实验于2004-10/2005-04在西安交通大学医学院神经生物教研室完成。①从7～10周胚龄流产人胚胎脊髓分离脊髓神经干细胞(家属知情同意),采用无血清培养技术进行原代和传代培养。培养液组成:DMEM/F12(1∶1),表皮生长因子20μg/L,碱性成纤维细胞生长因子20μg/L,重组人白血病抑制因子10μg/L,N2添加剂(终浓度为10mL/L)。②并采用免疫荧光法检测细胞的分化情况。结果:①人胚脊髓神经干细胞形态学观察:原代细胞培养得到大量悬浮生长的神经干细胞球,形态较规则,呈圆形,细胞边界清楚,折光性强。部分细胞贴壁生长继而分化。传代培养后,细胞团生长速度明显加快;传3代以后脊髓神经干细胞易贴壁。②人胚脊髓神经干细胞的鉴定和分化结果:神经干细胞球,巢蛋白染色阳性;可诱导分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论:人胚胎脊髓分离培养得到的细胞具有脊髓神经干细胞的基本特征,可进一步用于基础及临床研究。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景:神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。目的:观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。方法:从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。结果与结论:从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。