腺病毒介导XAF1基因诱导胰腺癌细胞株SW1990凋亡的实验研究

背景：X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）相关因子1（XAF1）是～种潜在的肿瘤抑制基因,能拮抗XIAP的抗凋亡作用。目的：探讨Ad5／F35腺病毒介导XAF1基因诱导胰腺癌细胞株SW1990凋亡的作用及其可能机制。方法：构建重组腺病毒Ad5／F35-XAF1和对照病毒Ad5／F35一Null,感染胰腺癌细胞株SW1990。分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白质印迹法检测XAF1mRNA和蛋白表达,以Annexin V—FITC／PI双染法和原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡率,以蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP、Caspase．8、Caspase．9和细胞色素C的表达。结果：Ad5／F35．XAF1感染SW1990细胞后。XAF1mRNA和蛋白表达均显著增高,并能诱导细胞凋亡,同时伴有Caspase．3、PARP、Caspase．8和Caspase-9活化增强以及细胞色素C蛋白表达增加。结论：重组腺病毒Ad5／F35-XAF1感染胰腺癌细胞株SW1990后．能明显诱导细胞凋亡,其机制可能与XAFI激活了死亡受体途径和线粒体凋亡途径有关。     

XAF1基因诱导胰腺癌细胞株BxPC3凋亡的实验研究

目的 探讨Ad5/F35腺病毒介导的XAF1基因诱导胰腺癌细胞BxPC3凋亡及其可能的作用机制.方法 将前期构建的重组腺病毒Ad5/F35-XAF1感染胰腺癌细胞BxPc3.采用半定量RTPCR、蛋白质印迹检测法检测感染前后BxPC3细胞XAF1 mRNA和蛋白表达的变化;运用Annexin-V/PI和TUNEL法检测细胞的凋亡率;免疫蛋白印迹法检测细胞Caspase-3、PARP、Caspase-8和Bcl-2蛋白的表达.结果 Ad5/F35-XAF1感染后,BxPC3细胞的XAF1 mRNA和蛋白表达明显增高,与空白组和Ad5/F35-Null对照组比较,差异显著(P＜0.05);两种方法 检测的细胞凋亡率分别为(19.90±3.09)%、(9.29±2.13)%,较Ad5/F35-Null组的(6.72±0.76)%、(2.73±0.51)%和空白组的(7.22±1.53)%、(1.56±0.47)%均有显著差异(P＜0.01);Caspase-3、PARP、Caspase-8蛋白表达显著增强,Bcl-2表达降低.结论 Ad5F35-XAF1重组腺病毒感染胰腺癌细胞BxPC-3能明显诱导细胞的凋亡,其机制可能是激活死亡受体途径和线粒体途径.     

XAF1增强TRAIL诱导人结肠癌细胞株HCT116凋亡的实验研究

背景:肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)可特异性诱导肿瘤细胞凋亡。X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)相关因子1(XAF1)是新型抑癌基因,在肿瘤细胞中呈低表达。目的:研究XAF1联合TRAIL诱导人结肠癌细胞株HCT116凋亡的作用。方法:构建重组腺病毒AdS/F35-XAF1、对照病毒Ad5/F35-Null,分别以相同感染复数(MOI)感染人结肠癌细胞株HCT116,并设立空白对照组,感染4 h后加入重组人TRAIL(rhTRAIL)。以RT-PCR法检测XAF1 mRNA表达;以蛋白质印迹法检测XAF1、PARP、caspase-3、-8、-9蛋白表达;以Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;以MTT法检测细胞增殖抑制率。结果:Ad5/F35-XAF1组和TRAIL+Ad5/F35-XAF1组XAF1 mRNA和蛋白表达显著高于其余各组。TRAIL+Ad5/F35-XAF1组PARP、caspase-3、-8、-9蛋白可见明显凋亡裂解带,其余各组未见明显裂解带。AdS/F35-XAF1组、TRAIL组、TRAIL+Ad5/F35-Null组、TRAIL+Ad5/F35-XAF1组细胞凋亡率较空白对照组和Ad5/F35-Null组显著增加(P<0.05),以TRAIL+Ad5/F35-XAF1组增加最为显著。TRAIL+Ad5/F35-XAF1组HCT116细胞增殖抑制率显著高于TRAIL组和TRAIL+Ad5/F35-Null组(P<0.05),并呈浓度和时间依赖性。结论:XAF1可增强TRAIL诱导的HCT116细胞凋亡和抑制增殖的作用。     

腺病毒介导XAF1基因诱导人肝癌细胞株SMMC7721凋亡的实验研究

背景：X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）相关因子1（XAF1）是新近鉴定的肿瘤抑制基因,在许多人类恶性肿瘤中低表达甚至不表达。目的：研究Ad5/F35腺病毒介导XAF1基因诱导人肝癌细胞株SMMC7721凋亡的作用及其可能机制。方法：构建重组腺病毒Ad5/F35-XAF1、对照病毒Ad5/F35-Null和报告病毒Ad5/F35-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,分别按不同感染复数（MOI）在同一作用时间点感染人肝癌细胞株SMMC7721。以荧光显微镜和流式细胞仪检测Ad5/F35-EGFP的感染效率;分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹法检测XAF1mRNA和蛋白表达;以甲基噻唑基四唑（MTT）法检测细胞增殖率;以Annexin V-FITC/PI双染法和原位末端标记TUNEL法检测细胞凋亡率;以蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达。结果：Ad5/F35-EGFP感染48h,MOI为2.0时,92%以上的SMMC7721细胞表达绿色荧光蛋白。Ad5/F35-XAF1感染48h后,SMMC7721细胞中XAF1 mRNA和蛋白表达增高,细胞增殖受到抑制,细胞凋亡剂量依赖性地增多,并伴随凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8和caspase-9的裂解。结论：重组腺病毒Ad5/F35-XAF1在人肝癌细胞株SMMC7721中具有很强的感染效率,可促进XAF1基因表达,且能明显抑制人肝癌细胞增殖和诱导凋亡,此作用可能与XAF1激活了内、外源性凋亡通路有关。     

XAF1基因在肝癌细胞凋亡中的诱导作用

背景：X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）与凋亡抑制和肿瘤细胞耐药现象密切相关。目的：研究XIAP相关因子1（XAF1）基因抑制人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2增殖和诱导凋亡的作用。方法：以腺病毒Ad5／F35为载体,构建重组腺病毒Ad5／F35-XAF1、对照空病毒Ad5／F35-Null和报告病毒Ad5／F35-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,分别以相同感染复数（MOI）感染人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2,并设立空白组作为对照。作用48h后,以荧光显微镜检测Ad5／F35-EGFP的感染效率;分别以逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和蛋白质印迹法检测XAF1 mRNA和蛋白表达;以MTT法检测细胞活力;以Annexin V—FITC／PI双染法和原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡率。结果：Ad5／F35-EGFP感染48h后,几乎所有Bel-7404和HepG2细胞均表达EGFP。Ad5／F35-XAF1感染48h后,两种肝癌细胞中XAF1 mRNA和蛋白表达均明显增高．细胞活力呈剂量依赖性地降低,细胞凋亡率显著增加。结论：重组腺病毒Ad5／F35-XAF1在人肝癌细胞株Bel-7404和HepG2中的感染效率高,XAF1在不同的肝癌细胞株中恢复表达后,能显著抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡,有可能成为肝癌基因治疗的新靶点。     

XAF1增加TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡的敏感性

背景:肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)可特异性诱导肿瘤细胞凋亡,但部分肿瘤细胞对TRAIL不敏感甚至耐药。目的:探讨X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)相关因子1(XAF1)是否可增加TRAIL诱导的肝癌细胞株凋亡的敏感性。方法:重组人TRAIL(rhTRAIL)因子分别加入3株肝癌细胞株SMMC7721、HepG2和Bel-7404中培养,联合或不联合相同感染复数(MOI)的重组腺病毒Ad5/F35-XAF1和对照空病毒Ad5/F35-Null。作用48h后,以MTT法检测细胞活力,以Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率。结果:随着TRAIL浓度的增加,3株肝癌细胞株的细胞活力均不同程度降低。TRAIL与Ad5/F35-XAF1联合作用后,其细胞活力显著低于单独TRAIL组,而Ad5/F35-Null组细胞活力与单独TRAIL组无明显差异。与空白对照组和Ad5/F35-Null组相比,TRAIL组和Ad5/F35-XAF1组3株肝癌细胞株的凋亡率均显著增加。TRAIL与Ad5/F35-XAF1联合作用后,细胞凋亡率显著高于Ad5/F35-XAF1组或TRAIL组。结论:XAF1可明显增加TRAIL诱导的肝癌细胞凋亡的敏感性,两者联合应用对诱导不同肝癌细胞凋亡具有协同作用。     

XAF1基因重组腺病毒载体的构建及其在人肝癌细胞体内外的表达

目的利用携带35型腺病毒纤毛的嵌合型5型腺病毒载体系统Ad5/F35构建XAF1基因重组腺病毒,体内外感染人肝癌细胞SMMC7721并使XAF1基因有效表达。方法将真核表达质粒pcDNA3.1-XAF1和穿梭质粒pDC316用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、筛选、测序获得重组穿梭质粒pDC316-XAF1。将测序正确的pDC316-XAF1和骨架质粒pBHG-fiber5/F35用Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,进行细胞内同源重组,得到重组腺病毒Ad5/F35-XAF1。予终点稀释法测定重组腺病毒的感染滴度。用同样的方法得到携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报告病毒Ad5/F35-EGFP。建立人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠移植瘤模型,将Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-EGFP重组腺病毒分别感染人肝癌细胞株SMMC7721和瘤内注射;荧光显微镜观察EGFP在细胞和移植瘤冰冻切片中的表达;RT-PCR和Westrenblot法检测XAF1的mRNA和蛋白在细胞和移植瘤组织的表达。结果重组腺病毒Ad5/F35-EGFP感染肝癌细胞和瘤内注射后,予荧光显微镜均可见细胞和冰冻切片中呈现绿色荧光;Ad5/F35-XAF1感染肝癌细胞和瘤内注射后,XAF1mRNA和蛋白表达均显著高于对照组和报告病毒组。结论成功构建重组腺病毒Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-EGFP。该腺病毒载体可携带目的基因在人肝癌细胞株SMMC7721体内和体外进行有效表达。     

X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1抑制肝癌细胞增殖和诱导凋亡的实验研究

目的 研究X-染色体相关凋亡抑制蛋白（XIAP）相关因子1（XAF1）对肝癌细胞增殖和凋亡的影凋亡响。方法 构建正义pcDNA3-XAF1和反义pcDNA3-XAF1-AS质粒，通过脂质体转染技术将质粒DNA转入SMMC7721肝癌细胞株并建立稳定高表达XAF1的肝癌细胞克隆。应用MTT、流式细胞仪、TUNEL法检测肝癌细胞的增殖和凋亡；应用RT-PCR和Western印迹法检测基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果 XAF1在SMMC7721肝癌细胞株中有表达，但低于正常肝脏细胞水平。稳定高表达XAF1基因可抑制肝癌细胞的增殖和诱导，并能增加其对化疗药物5-氟尿嘧啶和羟基喜树碱的敏感性。结论 XAF1能抑制肝癌细胞增殖和诱导其凋亡。     

MMI-166对人胰腺癌SW1990细胞凋亡及其相关蛋白表达的影响

目的 观察MMI-166对人胰腺癌SW1990细胞及其移植瘤组织凋亡相关蛋白表达的影响,探讨其可能机制.方法 应用人胰腺癌细胞株SW1990建立裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型,按完全随机法将荷瘤裸鼠分为对照组和MMI-166组,分别给予口服生理盐水和MMI-166(200 mg·kg-1·d-1),持续28 d.采用TUNEL法和蛋白质印迹法检测移植瘤组织的细胞凋亡指数(AI)及p53、c-Myc、Bax、Bcl-2、Survivin、Caspase-1、Fas蛋白的表达.应用不同浓度(0、50、100 μg/ml) MMI-166作用于人胰腺癌SW1990细胞24 h,蛋白质印迹法检测c-Myc、Survivin的表达.结果 MMI-166组移植瘤组织的AI为81.1±7.9,显著高于对照组的21.3±2.2 (P =0.000);c-Myc、Survivin的表达量分别为7715±2229、4594±1240,显著低于对照组的16870±2446、15208±1903(P值均为0.000);p53、Bax、Bcl-2、Caspase-1、Fas的表达与对照组比较无显著变化.50、100 μg/ml的MMI-166处理后,人胰腺癌SW1990细胞的c-Myc表达量显著下调(0.098±0.003、0.073±0.008比0.169±0.007,F=189.361,P＜0.05);Survivin 的表达量无明显变化.结论 MMI-166可能通过下调c-Myc的表达诱导人胰腺癌SW1990细胞凋亡.     

生长因子受体结合蛋白2在人类真核翻译延长因子1A2促进胰腺癌发生发展中的作用

目的 明确生长因子受体结合蛋白2(GRB2)在人类真核翻译延长因子1A2(EEFlA2)促进胰腺癌发生发展中的作用.方法 用腺病毒质粒Ad5/F35-EEFl A2转染胰腺癌细胞株SW1990(EEFlA2低表达),应用小干扰RNA(siRNA)技术下调胰腺癌细胞BxPC-3 (EEF1A2高表达)中EEFlA2的表达水平,用RT-PCR及Western印迹方法检测SW1990和BxPC-3细胞株处理前后GRB2的表达.化学合成GRB2特异高效的siRNA干扰片段,干预胰腺癌细胞BxPC-3后通过MTT和Transwell实验观察BxPC-3细胞增殖和运动能力的变化.统计学处理采用单因素方差分析.结果 腺病毒Ad5/F35-EEF1A2转染人胰腺癌细胞株SW1990后,GRB2的mRNA和蛋白表达水平均明显升高(F=5.67和6.39,P均＜0.05).EEF1A2-siRNA抑制BxPC-3胰腺癌细胞EEF1A2表达后,GRB2的mRNA和蛋白表达水平均明显下调(F=-6.59和4.69,P均＜0.05).BxPC-3在被转染siRNA-GRB2后,MTT结果显示72 h时,siRNA-GRB2组吸光度值为1.22±0.14,与阴性对照组和空白对照组(1.42±0.15和1.39±0.15)相比,差异有统计学意义(F=6.63,P＜0.05).Transwell实验结果显示siRNA GRB2组细胞侵袭能力减弱,24 h后穿膜细胞数为(24.10±4.25)个,与阴性对照组[(54.72±5.24)个]及空白对照组[(51.26±6.23)个]相比,差异有统计学意义(F=55.00,P＜0.05).结论 GRB2是EEF1A2促进胰腺癌发生发展的关键分子.