体外沉默异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶基因对舌鳞状细胞癌迁移和侵袭的影响

目的 通过构建异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶(ICMT)小分子干扰RNA(siRNA)沉默ICMT,研究沉默ICMT基因对舌鳞状细胞癌(TSCC)迁移和侵袭的影响.方法 通过脂质体转染的方法将siRNA转染至人TSCC CAL-27和SCC-4细胞(ICMT-siRNA组),并设阴性对照组(转染NC-siRNA)和空...     

体外沉默Rce1对舌鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移能力的影响

目的 通过RNA干扰技术沉默Rce1基因,探讨Rce1对舌癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法 体外培养舌鳞状细胞癌Cal-27和SCC-4细胞,设计合成Rce1基因的小干扰RNA（siRNA）,采用脂质体载体瞬时转染沉默Rce1基因。根据转染的siRNA不同,将实验组分为Rce1-siRNA-1组、Rce1-siRNA-2组、Rce1-siRNA-3组,脂质体载体分别转染相对应序列的siRNA。脂质体转染siCON作为阴性对照组,不转染siRNA作为空白对照组。采用实时定量聚合酶链反应检测各组Rce1、RhoA以及K-Ras基因的表达,蛋白质印迹法（Western blot）检测Rce1、RhoA、K-Ras、金属基质蛋白酶（MMP）-2及MMP-9的表达,采用体外侵袭实验检测Cal-27和SCC-4的侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 实时定量聚合酶链反应及Western blot检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组的Rce1基因及蛋白表达均下调（P<0.05）,RhoA、K-Ras基因及蛋白表达无统计学差异（P>0.05）,MMP-2、MMP-9表达下降（P<0.05）。体外侵袭实验表明,与对照组相比,实验组在聚碳酯膜上的细胞总数明显减少（P<0.05）。细胞划痕实验表明,实验组划痕处细胞闭合时间明显长于对照组（P<0.05）。结论 体外沉默Rce1可以有效下调其在舌癌细胞Cal-27和SCC-4中的表达水平,降低迁移和侵袭能力。     

RhoE在舌鳞状细胞癌中的表达及其对细胞迁移和侵袭的影响

目的初步探讨RhoE在舌鳞状细胞癌(TSCC)中的表达水平,及其对TSCC细胞迁移和侵袭的影响及相关机制。方法选取在青岛大学附属青岛市市立医院口腔医学中心颌面外科2017—2019年手术切除的TSCC原发灶48例,采用免疫组织化学法检测标本(TSCC组织、癌旁组织)中RhoE的表达水平,并提取标本的RhoE mRNA和蛋白进一步检测RhoE的表达水平。选取TSCC SCC-4和CAL-27细胞系进行体外实验,采用瞬时转染法过表达RhoE,并应用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)及蛋白质免疫印记法检测过表达效率;细胞划痕实验及Transwell细胞侵袭实验分别检测TSCC细胞的迁移和侵袭能力;蛋白质免疫印记法检测相关蛋白Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1 (ROCK1)、基质金属蛋白酶2 (MMP-2)、基质金属蛋白酶9 (MMP-9)的表达水平;采用GraphPad Prism 8.2.1软件对实验数据进行统计学分析。结果 TSCC组织中RhoE的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05);在体外实验中,与空白对照组和阴性对照组相比,过表达实验组TSCC细胞的迁移和侵袭能力显著...     

RhoA小干扰RNA对舌癌细胞Tca8113增殖、侵袭影响的体外实验

目的 体外实验研究Ras基因家族同源物A(ras homolog gene family,member A,RhoA)小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在舌癌转移中的作用.方法 登录Genebank确定人RhoA基因序列,利用RNA干扰技术针对RhoA的基因序列设计4条短链RNA,构建干扰表达载体,利用LipofectamineTM2000介导法将RhoA siRNA转染至舌癌细胞系Tca8113.转染细胞后48 h检测瞬时表达效率,经杀稻瘟菌素筛选及克隆化培养获得稳定抗性克隆转染株后,蛋白质印迹法检测RhoAsiRNA转染后的抑制效应,细胞计数绘制细胞生长曲线以观察RhoA siRNA转染前后细胞株的生长速度;划痕实验和Millicell小室实验检测转染细胞株的迁移力与侵袭力.结果 舌癌细胞转染RhoA siRNA后:RhoA蛋白表达下降;细胞倍增时间从38.0 h延长至45.7 h;细胞克隆形成率由35.2%降低至15.8%;细胞迁移能力减弱;细胞侵袭能力由100%降至58.9%,显著减弱.结论 RhoA siRNA能有效抑制舌癌Tca8113细胞中RhoA的表达,从而降低细胞增殖水平以及细胞侵袭力和迁移力,表明RhoA siRNA具有抑制舌癌细胞生物学特性的能力,提示RhoA在舌癌转移中可能发挥重要作用.     

体外沉默法尼基转移酶对舌鳞状细胞癌迁移和侵袭的影响

目的 通过RNA干扰沉默法尼基转移酶（FTase）,探讨沉默FTase对舌鳞状细胞癌迁移和侵袭的影响及其相关机制。方法 针对FTase设计并构建3条小干扰RNA（siRNA）,转染人舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-4细胞（实验组）,同时设置阴性对照组（转染NC-siRNA）和空白对照组（不转染siRNA）。应用实时荧光定量PCR检测各组细胞FTase、HRAS的mRNA表达,根据FTase mRNA的表达量,选取沉默效率最高的FTase-siRNA转染组作为进一步研究的实验组。蛋白质免疫印迹法检测各组细胞FTase、HRAS、p65、p-p65(S536)、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、低氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）的蛋白表达,Transwell侵袭实验和细胞划痕实验检测各组细胞的侵袭和迁移能力。结果 与阴性对照组和空白对照组相比,实验组FTase的mRNA和蛋白表达下降（P<0.05）,HRAS的mRNA和蛋白表达无明显变化（P>0.05）,p-p65(S536)、MMP-9、HIF-1α、VEGF蛋白表达下降（P<0.05）,p65蛋白表达无明显变化（P>0.05）;实验组的细胞侵袭和迁移能力降低（P<0.05）。结论 体外沉默舌鳞状细胞癌细胞FTase,可以抑制细胞体外迁移和侵袭能力,为FTase可能作为舌癌治疗的分子靶点提供了一定的理论和实验依据。     

体外沉默二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ对舌癌细胞迁移和侵袭的影响

目的 应用RNA干扰技术,体外沉默二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ(GGTase-Ⅰ),研究其在舌癌迁移、侵袭中的作用.方法 登录Genebank确定人GGTase-Ⅰ基因序列,针对GGTase-Ⅰ的基因序列设计并构建3条siRNA,分别将RNA干扰组(GGTase-ⅠsiRNA1、GGTase-ⅠsiRNA2、GGTase-ⅠsiRNA3)、阴性对照组(NC-siRNA)和空白对照组转染至舌癌细胞Cal-27,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞转染后GGTase-Ⅰ、RhoA基因的mRNA、蛋白表达;选取沉默效率最高的一组siRNA作为实验组,蛋白质印迹法检测各组细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的表达,GST-pull down实验检测GTP-RhoA蛋白的表达,划痕实验检测细胞迁移能力变化,Transwell小室检测细胞侵袭能力变化.结果干扰后细胞的GGTase-ⅠmRNA、蛋白表达明显下降(P<0.05),RhoA mRNA和蛋白表达无明显改变,MMP-2、MMP-9、GTP-RhoA的表达下降,迁移、侵袭能力明显下降(P<0.05).结论 抑制GGTase-Ⅰ表达,可降低舌癌细胞的迁移、侵袭能力,对GGTase-Ⅰ的深入研究可能为舌癌的治疗提供新的有效分子靶点.     

骨髓基质细胞中Von Hippel-Lindau基因的siRNA表达载体构建及其检测

目的:构建骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells BMSCs)中Von Hippel-Lindau(VHL)基因的siRNA表达载体并检测其对BMSCs细胞中VHL基因的干扰作用.方法:根据犬的VHL基因序列设计并合成4对siRNA oligo,然后用载体构建试剂盒进行重组克隆,将4对双链的siRNA oligo分别插人到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒(SR144-1,SR144-2,SR144-3,SR144-4).用载体通用引物进行菌落PCR筛选,筛选得到的阳性克隆进行测序,以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的oligo序列一致.干扰载体瞬时转染BMSCs,通过qPCR和Westerm印迹分别检测干扰载体对目的基因的沉默效果.为了提高转染效率及VHL基因的沉默效果,对SR144-4进行慢病毒干扰载体(pLenti-mi-VHL)构建.结果:通过对构建质粒克隆进行测序,证实重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列一致.转染BMSCs细胞24h和48h后分别用qPCR与Western印迹检测,显示SR144-4干扰效果最理想.通过测序结果比对,插入序列完全正确.pLenti-mi-VHL构建成功.结论:成功构建了BMSCS的siRNA-VHL表达载体,为进一步实验研究奠定了基础.     

舌鳞状细胞癌顺铂耐药细胞系细胞周期蛋白D1RNA干扰的体外研究

目的 用人工合成的耐药相关基因细胞周期蛋白D1（cyclin D1）的小分子干扰RNA（siRNA）处理人舌鳞癌顺铂耐药细胞系（Tca8113-CDDP），探讨对靶基因转录调控的作用效果以及剂量和时间效应关系，为耐药性逆转提供实验依据。方法 CY^3荧光素标记阳性对照基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）siRNA，分别于转染后4、24、48、72h在激光共聚焦显微镜下观察瞬时转染率，优化转染条件。用SYBR绿色荧光染料法、实时定量PCR技术分析目的基因mRNA的表达情况，同时采用蛋白印迹（Western blot）检测目的基因蛋白水平的表达。四甲基偶氮唑盐法检测cyclin D1 siRNA处理后细胞对顺铂敏感性的影响。结果 优化转染条件后，Tca8113-CDDP细胞中CY^3的GAPDH siRNA转染率达90％以上。转染cyclin D1 siRNA后24、48hmRNA表达的抑制率为81．6％、80．7％，72h最为明显，为94．3％。在低于100nmol／L浓度下，RNA干扰抑制与剂量大小有关；当剂量进一步加大时，抑制效应则维持在“平台期”。转染24、48和72h后，cyclin D1蛋白的表达也明显下降。siRNA干扰组和对照组细胞在顺铂作用后细胞生长抑制率分别为58．4％、34．8％。结论 化学合成的cyclin D1 siRNA在体外实验中，对Tca8113-CDDP细胞中目的基因的沉默提高了细胞对顺铂敏感性，并呈现剂量和时间依赖效应。     

小干扰RNA沉默Dicer酶对人舌鳞癌细胞Tca-8113的增殖和细胞周期的影响

目的研究沉默Dicer酶的表达对人舌鳞癌细胞Tea-8113的增殖和细胞周期的影响。方法实验组转染靶向Dicer酶的siRNA序列；时照组转染尤义序列siRNA；空白组细胞未做转染？采用RNA于扰技术沉默Tea-8113中Dicer酶的表达，通过荧光定量聚合酶链反应、蛋白质印迹法及免疫组织化学技术，检测Tea-8113转染小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）后Dicer酶的mRNA和蛋白质水平的表达情况；应用噻唑蓝比色法及流式细胞术榆测细胞增殖及细胞周期的变化。结果Tea-8113细胞转染siRNA24h后，实验组Dicer酶mRNA表达量是空白组的0．39倍．表达水平下降，实验组与空白组或对照组比较，表达水平都有所下降，差异有统计学意义（P〈0．05）、转染48h后实验组蛋白质表达较空白组下调53．67％。Dicer酶表达下凋后，Tca-8113细胞增殖加速，G1期细胞百分率减少，S期和G2期细胞百分率增多。结论沉默Dicer酶的表达可加快细胞周期从G1期向S期和G2期进展．促进Tea-8113细胞的生长。     

利用RNAi技术抑制人舌癌Tca－8113细胞增殖的实验

目的：通过转染可抑制Tca-8113细胞tankyrase1表达的siRNA,达到抑制Tca-8113细胞增殖的目的。方法：采用体外转录合成方法,合成针对tankyrase1的siRNA,并进行Cy-3荧光标记,用脂质体转染至Tea-8113细胞,荧光显微镜观察判断转染效果。应用噻唑蓝（MrIrr）法和流式细胞仪检测siRNA的作用效果;应用Westernblot方法鉴定siRNA抑制tankyrase1表达效果。结果：tankyrase1siRNA组与空白对照组、脂质体对照组相比．可诱导11ca-8113细胞tankyrase1表达下调,Westernblot结果分析显示,转染siRNA后可下调tankyrase1表达量的1／2,并抑制Tca-8113细胞的增殖（P〈0．05）,同时改变了细胞周期各时相的细胞分布。结论：tankyrase1siRNA在体外实验中可沉默目的基因以及抑制Tca-8113细胞增殖。     

沉默Icmt基因对舌鳞癌CAL-27和SCC-4细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的:探讨异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶(isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase,Icmt)对舌鳞癌CAL-27和SCC-4细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及其相关机制.方法:针对人Icmt基因序列设计并构建3条小干扰RNA(small interfering RNA,...     

has-miR-16�����۰��е�����ѧ���ܼ����ӻ����о�

??Objective    To study the role and molecular mechanism of has-miR-16 in the development of tongue squamous cell carcinoma ??TSCC??. Methods    The expression of has-miR-16 was detected in 36 cases of TSCC tissues and matched normal tissues by using Quantitative real time PCR. The expression of has-miR-16 in TSCC cells ??CAL-27 and SCC-9?? and the normal human oral mucosa fibroblast cells ??hOMF?? was also analyzed by Quantitative real time PCR. The cell proliferation and migration of CAL-27 and SCC-9 were analyzed by MTT and wound healing assays after being transfected with has-miR-16 mimics or mimics control. The target gene of has-miR-16 was predicted by bioinformatics and verified by dual luciferase reporter assay. Results    The expression of has-miR-16 in TSCC tissues was significantly lower than matched normal tissues ??P < 0.05??. The expression of has-miR-16 was also down-regulated in CAL-27 and SCC-9 cells compared with hOMF cells ??P < 0.05??. Over-expression of has-miR-16 inhibited cell proliferation and migration in CAL-27 and SCC-9 cells ??P < 0.05??. MYB ??Myeloblastosis oncogene?? was the target gene of has-miR-16 in TSCC. Conclusion    Has-miR-16 is down-regulated in TSCC tissue and cell lines??over-expression of has-miR-16 inhibites CAL-27 and SCC-9 cells proliferation and migration??has-miR-16 acts as tumor suppressor in TSCC??which may play its role via regulating MYB.     

双硫仑对口腔鳞癌细胞上皮-间充质转化的影响及机制探讨

目的 基于Smad4突变状态探讨双硫仑对口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)的影响。方法 将2017年6月—2018年6月在安徽医科大学附属口腔医院进行肿瘤切除术的46例OSCC患者手术切除的癌组织和癌旁组织切片纳入研究,同时购置人舌鳞状细胞癌细胞系SCC-25和CAL-27。采用免疫组织化学染色观察组织中Smad4的表达情况,Western免疫印迹测定细胞中Smad4的表达情况,分析双硫仑对TGF-β1诱导的细胞EMT迁移、侵袭、形态学以及p38、JNK和ERK表达的影响。采用SPSS 20.0软件包对数据进行统计分析。结果 癌组织中Smad4阳性表达率显著低于癌旁组织(P<0.05)。双硫仑浓度为5、10、20 μmol/L时,SCC-25和CAL-27细胞存活率与对照组相比无显著差异(P>0.05),双硫仑浓度≥30 μmol/L后,SCC-25和CAL-27细胞存活率显著小于对照组(P<0.05)。经TGF-β1处理后,SCC-25和CAL-27细胞形态由上皮样转变为间质样,上皮性钙黏附蛋白(E-cadherin)表达显著降低,波形蛋白(Vimentin)和神经性钙黏附蛋白(Snail)表达显著升高,迁移能力显著增强(P<0.05)。经双硫仑+TGF-β1处理后,随着双硫仑浓度上升,SCC-25和CAL-27细胞形态改变逐渐减小,E-cadherin蛋白表达逐渐升高,Vimentin和Snail蛋白表达逐渐降低,迁移能力逐渐减弱(P<0.05)。TGF-β1刺激后5 min后,SCC-25和CAL-27细胞中p-ERK水平逐渐上升,在15 min时达到最大值,随后逐渐降低(P<0.05)。经20 μmol/L双硫仑+TGF-β1处理后,SCC-25和CAL-27细胞中p-ERK水平随作用时间延长而逐渐下降(P<0.05)。结论 双硫仑可通过阻断MAPK信号通路中ERK磷酸化,达到抑制Smad4突变与Smad4非突变OSCC细胞EMT作用。     

亲环蛋白A在口腔鳞状细胞癌组织中的表达及对细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨亲环蛋白A (CyPA)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织中的表达,以及下调SCC-25细胞中CyPA基因对细胞增殖和侵袭的影响。方法选取OSCC患者77例,检测OSCC及癌旁组织中CyPA蛋白表达,培养SCC-25细胞并分为CyPA干扰序列组、阴性对照组和空白组,分别采用实时荧光定量聚合酶链反应技术和Western blot技术检测细胞中CyPA mRNA和蛋白表达,细胞增殖能力检测采用甲基噻唑基四唑(MTT)法和平板集落形成实验,细胞侵袭能力检测采用Transwell法。结果 OSCC组织中CyPA蛋白阳性表达率为76.62%,高于癌旁组织(P<0.05);CyPA蛋白在TNM分期T3+T4期、临床分期Ⅲ+Ⅳ期、中低分化和发生淋巴结转移组织中阳性表达率升高(P<0.05);与阴性对照组和空白组比较,CyPA干扰序列组细胞中CyPA mRNA和蛋白相对表达量降低(P<0.05),24、48、72和96 h细胞光密度值降低(P<0.05),细胞集落数和侵袭细胞数均降低(P<0.05)。结论 CyPA蛋白在OSCC组织中呈高表达,下调SCC-25细胞中...     

沉默信息调节因子3对舌癌细胞凋亡的影响

目的:探讨沉默信息调节因子3(sirtuin3,SIRT3)对舌癌细胞凋亡的影响。方法:采用小干扰RNA(small interfere RNA,siRNA)沉默舌癌细胞中的SIRT3。MTT法检测SIRT3沉默对舌癌细胞增殖活力的影响;TUNEL染色检测SIRT3沉默对舌癌细胞凋亡的影响;酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测SIRT3沉默对舌癌细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性的影响;蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测SIRT3沉默对舌癌细胞Caspase-3和多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)表达的影响。结果:SIRT3沉默有效,在SIRT3沉默后观察到舌癌细胞的增殖活力降低,细胞凋亡增加,Caspase-3活性增加,Caspase-3和PARP表达增加。沉默SIRT3前后,舌癌细胞的增殖活力、TUNEL阳性细胞比例、Caspase-3的活性值以及Caspase-3和PARP表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论:SIRT3沉默可促进舌癌细胞凋亡。     

干扰素诱导蛋白10对舌鳞癌细胞增殖、凋亡的影响

目的: 探讨干扰素诱导蛋白10（IP-10）对舌鳞癌细胞CAL-27增殖、凋亡的影响以及与CXCR3A、CXCR3B基因表达的关系。方法: 将CAL-27 细胞分为 3 个实验组和 1 个对照组,3 个实验组分别采用10、20、40 ng/mL 的IP-10刺激,对照组不予刺激。刺激12、24、48、72 h时,利用CCK-8法检测 4 组细胞的增殖活性;24 h 时,利用流式细胞仪检测细胞凋亡。采用Q-PCR检测10 ng/mL IP-10作用下,CAL-27细胞在12、24、48、72 h时CXCR3A、CXCR3B mRNA的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果: 12 h和24 h 时,3种浓度的IP-10 均能促进 CAL-27 细胞增殖（P<0.05）;在 48 h 时,只有40 ng/mL的 IP-10 能够促进 CAL-27 细胞增殖（P<0.01）; 而在72 h时,3种浓度的 IP-10对 CAL-27 细胞的增殖均无促进作用（P>0.05）。24 h后,3个实验组与对照组相比,CAL-27细胞的增殖率降低。24 h 时,3种实验组细胞凋亡率分别为（3.377±0.575）%、（6.867±2.848）%和（5.317±2.794）%,与对照组相比具有显著差异（P<0.05）,但各实验组间无显著差异（P>0.05)。12、24、48、72 h时,CXCR3A mRNA的表达量分别为0.0130±0.0007、0.0274±0.0005 、0.0204±0.0011和0.0174±0.0006,组间差异显著（P<0.05）;CXCR3B mRNA的表达量分别为0.0124±0.0015、0.0209±0.0016、0.0297±0.0013和0.0386±0.0010,组间差异显著（P<0.05）。结论: IP-10既能促进舌鳞癌细胞CAL-27增殖又能够诱导其凋亡,随着作用时间的推移,细胞增殖率降低;CXCR3A mRNA的表达先升高后降低,而CXCR3B mRNA的表达逐渐升高。CXCR3A、CXCR3B可能参与调控IP-10诱导下的舌鳞癌细胞的增殖和凋亡。     

核糖体蛋白L29在舌鳞状细胞癌中的表达及意义

目的:探讨核糖体蛋白L29(ribosomal protein L29,RPL29)在人舌鳞状细胞癌(简称鳞癌)中的表达及意义.方法:应用免疫组织化学SP法检测52例舌鳞癌患者癌组织和癌旁组织中RPL29蛋白的表达情况.利用RNA干扰技术,将RPL29-siRNA转染到舌鳞癌CAL-27细胞中,RT-PCR法检测RPL...