二倍体及四倍体菘蓝氨基酸含量的测定分析

目的:通过对二倍体菘蓝和四倍体菘蓝根和叶中的水解氨基酸和游离氨基酸含量进行测定分析,了解不同倍性菘蓝的氨基酸含量差异,为菘蓝的药用开发提供参考。方法:利用氨基酸自动分析仪,采用酸水解法进行测定。结果:四倍体与二倍体菘蓝相比,菘蓝根中四倍体游离氨基酸和水解氨基酸的含量均高于二倍体,分别比二倍体的含量高25.7%、40.7%,大多数氨基酸含量上升,少数氨基酸含量下降。菘蓝叶中四倍体总游离氨基酸比二倍体稍有下降(-0.24%),水解氨基酸稍有上升(1.88%),大多数氨基酸含量上升,少数氨基酸含量下降。二倍体和四倍体菘蓝根水解精氨酸和游离精氨酸含量均是叶的3倍以上。结论:四倍体菘蓝与原二倍体相比,氨基酸含量均有提高,尤其根中更为明显。精氨酸可能为菘蓝根中发挥药效的主要氨基酸。     

四倍体菘蓝毛状根的培养及其抗内毒素成分分析

 目的 从菘蓝的同源四倍体植物诱导出毛状根并探讨用毛状根培养来大规模生产有用的药用植物次生代谢物的可能性。方法 利用发根农杆菌A4菌株对四倍体菘蓝进行感染,采用高效毛细管电泳法同时测定诱导出的毛状根中具有抗内毒素作用的五种有机酸［邻氨基苯甲酸、水杨酸、丁香酸、苯甲酸、3-(2-苯甲酸)-4(3H)-喹唑酮］的含量。结果 A4菌株从四倍体菘蓝诱导出毛状根,且毛状根含有原植物中具有抗内毒素作用的五种有机酸。结论 发根农杆菌能诱导四倍体植物产生毛状根,我们有可能利用毛状根培养来生产有价值的植物次生代谢物。     

水分胁迫条件下不同栽培居群菘蓝中4种有机酸的变化

目的:检测北京、内蒙古、河北和陕西等4个栽培居群菘蓝叶片中草酸、苹果酸、柠檬酸和抗坏血酸等4种有机酸成分含量的差异及在淹水胁迫下的变化.方法:采用高效液相色谱法测定正常及水分胁迫下不同栽培居群的菘蓝叶片中4种有机酸的含量.结果:不同栽培居群叶片中有机酸含量不同,而在水分胁迫条件下,各栽培居群有机酸含量变化趋势相同,草酸、苹果酸和柠檬酸含量升高,抗坏血酸含量下降.结论:不同栽培居群的菘蓝所含各有机酸存在一定差异,在水淹等逆境条件下,其叶片中有机酸含量发生不同程度地变化,并与其逆境生理密切相关.     

菘蓝不同四倍体株系有效成分的比较研究

目的:为优良菘蓝四倍体株系选育提供参考。方法:HPLC法分析靛蓝和靛玉红的含量,采用苯酚-硫酸法测定多糖含量,利用氨基酸分析仪测定氨基酸含量。结果:菘蓝四倍体株系根中靛蓝、靛玉红含量大多数高于二倍体株系,而叶中靛蓝和靛玉红含量不高于二倍体;四倍体株系根中的多糖含量均低于二倍体,其中以四倍体株系DB1、DB10和DB15根中多糖含量较高,DB6、DB13和DB15叶中多糖含量最高;检测出17种氨基酸,其中必需氨基酸6种,而精氨酸和脯氨酸含量为最高。其中DB7、DB8根和叶中的精氨酸含量均高;DB1、DB7和DB12脯氨酸含量高;DB7、DB9和DB12叶中总氨基酸含量最高。结论:菘蓝不同四倍体株系有效成分表现不完全一致,生产上根据实际应用情况进行选用。     

菘蓝不同栽培类型植物性状与质量评价研究

目的:对不同产地的菘蓝种质资源进行植物性状比较与质量评价研究,以期为菘蓝优良品种选育工作奠定基础。方法:采用大田栽培,随机区组法,对不同产地引进的菘蓝叶、根、角果、种子等器官的植物性状进行比较,并测定其根中有效成分R,S-告依春和多糖的含量。结果:不同栽培类型菘蓝在叶、根、角果、种子形态方面存在显著差异,根中R,S-告依春和多糖含量也存在差异,其中白菜叶型菘蓝(云南)的R,S-告依春含量较高,质量分数为0.59%,四倍体的多糖含量较高,质量分数为8.68%。结论:根据菘蓝的植物性状可将其分为白菜叶型、甘蓝叶型、芥菜叶型,白菜叶型菘蓝(云南)的R,S-告依春含量较高,四倍体的多糖含量较高。     

四倍体菘蓝体外抗内毒素、抗病毒作用评价

目的 :对四倍体菘蓝的药理作用进行评价。方法 :以同源二倍体亲本为对照 ,以鲎试剂法、鸡胚法分别考察四倍体菘蓝的抗内毒素、抗病毒作用。结果 :四倍体菘蓝的抗内毒素及抗病毒作用显著强于二倍体亲本 ,相同倍性菘蓝的叶的体外药理作用强于根。结论 :四倍体菘蓝是优质高效的新品系 ,具有很大的开发利用价值。     

四倍体菘蓝基因组DNA甲基化的甲基化敏感扩增多态性分析

目的 分析四倍体菘蓝Isatis indigotica基因组DNA甲基化水平和模式.方法 采用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)方法,对四倍体菘蓝基因组DNA的甲基化水平和模式进行分析.结果 筛选36对MSAP选择性引物进行扩增,共得到1733条清晰的条带.二倍体菘蓝基因组胞嘧啶甲基化水平为24.05％,四倍体菘蓝基因组胞嘧啶甲基化水平为23.70％.检测到83个(4.86％) CCGG位点在四倍体菘蓝基因组中发生了DNA甲基化模式的改变,其中37个(2.13％)位点发生了超甲基化,36个(2.08％)位点发生了去甲基化.结论 二倍体和四倍体菘蓝在CCGG位点上存在胞嘧啶甲基化状态的改变.     

转双价抗虫基因Bt-CpTI提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性

目的 将外源苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因CrylA(c)和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因CpTI共同转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫小菜蛾抗性.方法 构建了以CaMV 35S为启动子,新霉素磷酸转移酶(Npt-Ⅱ)为选择标记,带有CrylA(c)基因和CpTI基因的植物表达载体pGBI121S4ABC并转入根癌农杆菌LBA4404.采用叶盘法遗传转化四倍体菘蓝.转基因再生植株经PCR和Southern杂交检测,并进行抗小菜蛾实验.结果 T0代转化四倍体菘蓝的双基因阳性转化率达到16.67%.Southern杂交检测结果表明外源CrylA(c)基因和CpTI基因均已经随机整合到转基因菘蓝的基因组中.与野生对照相比,转基因四倍体菘蓝对小菜蛾显示出明显抗性.结论 转双价抗虫基因Bt-CpTl是提高四倍体菘蓝对小菜蛾抗性的有效手段.     

菘蓝叶片叶绿素含量与SPAD值的相关性研究

目的:探究菘蓝叶片叶绿素含量与SPAD值之间的相关性。方法:通过SPAD-502叶绿素仪和紫外可见分光光度计测定大叶菘蓝、小叶菘蓝及四倍体菘蓝叶片的SPAD值和叶绿素含量,拟合回归方程,分析其相关性。结果:3种菘蓝叶绿素含量与SPAD值之间均具有相关性但不呈线性相关,引入比叶重或叶片厚度作为校正因子对SPAD值校正之后,叶绿素含量与SPAD校正值之间呈良好的线性关系。丙酮提取法测得的3种菘蓝总叶绿素含量与SPAD比叶重校正值之间线性相关程度最高,线性方程为y=0.0043x-5.8667,R~2=0.9959。结论:在引入校正因子的条件下,可以采用SPAD叶绿素仪快速比较菘蓝品种间,植株间叶绿素含量差异。     

抗除草剂基因导入四倍体菘蓝

以CaMV 35S为启动子，将带有抗除草剂基因(bar 基因)的pCAMBIA 3300植物双元表达载体，导入根癌农杆菌菌株EHA l05，作为基因工程菌转化四倍体菘蓝，选出5mg／L的草丁膦(ppt)为适宜的筛选压。筛选得到的抗性植株经PCR鉴定，结果表明bar基因已转移到四倍体菘蓝的基因组，从而建立了农杆菌介导的四倍体菘蓝的遗传转化系统，为利用基因工程进一步改良菘蓝品质奠定了基础。     

HPLC-MS2鉴定大青叶水提液中的5种化学成分

目的:鉴定大青叶水提液中的化学成分.方法:大青叶的水提液经HPLC分离后,收集各色谱峰的馏分进行二级质谱分析,并和胞苷、尿苷、鸟苷、黄嘌呤和次黄嘌呤对照品的水溶液进行比较.结果:大青叶水提液HPLC中的5个色谱峰分别与胞苷、尿苷、鸟苷、黄嘌呤和次黄嘌呤对照品的tR和UV光谱一致,并具有相同的二级质谱碎片离子.结论:大青叶中含有胞苷、次黄嘌呤、尿苷、黄嘌呤和鸟苷等5种成分.     

超临界CO2萃取-高速逆流色谱快速分离制备板蓝根中的表告依春

目的：建立从板蓝根中快速分离制备高纯度表告依春的方法。方法：板蓝根药材粉碎后采用超临界CO2萃取法提取表告依春粗提物,选择萃取温度、物料粒度、萃取时间和萃取压力为因素进行正交实验优选出超临界液CO2萃取的最佳工艺条件：即萃取压力20MPa,萃取温度为50℃,萃取时间为60 min,物料粒度40～60目。萃取得到的表告依春粗提物采用高速逆流色谱法进行分离制备,两相溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-水（9∶1∶2∶9,v/v）,进样量为400mg,得到纯度为99.6%的表告依春103.7mg。结论：该方法简便、快速、低能耗、回收率高,为板蓝根中表告依春单体的制备提供了新方法。     

激素对菘蓝器官分化及愈伤组织诱导的影响

目的研究激素对菘蓝器官分化及愈伤组织形成能力的影响。方法以菘蓝无菌苗的子叶和胚轴为外植体,采用含有不同植物激素配比的培养基培养菘蓝不同外植体,分析在不同激素配比的条件下诱导形成愈伤组织和分化不定根、不定芽的能力。结果在NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L(14d)、NAA 0.5mg/L+6-BA 1.0 mg/L(14d)、NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L(28d)三个条件下子叶的愈伤组织诱导率可达到100%;NAA(0 mg/L～0.1 mg/L)+6-BA1.0 mg/L的激素组合不定芽诱导率可达75%以上;生根培养以1/2MS培养基附加NAA 0.1 mg/L可使不定芽生根率可达100%。结论合适的激素组合,能促进菘蓝愈伤组织的形成和器官的分化。。     

异地栽培大青叶和原栽培品种的抗内毒素作用比较

比较异地栽培后的大青叶和其原栽培品种的抗内毒素作用,结果显示生态环境改变后,大青叶仍能保持其原栽培品种品质;不同居群大青叶在药理活性方面的差异也不因生态环境的趋同而丧失。表明大青叶是一类种质主导型的药材,环境因素对药材品质的形成不起主要作用。     

大青叶中靛玉红的提取工艺研究

目的:优选大青叶中靛玉红的最佳提取工艺条件。方法:以靛玉红含量为指标,采用正交实验设计法,考察超声法、回流法不同因素和水平对其提取条件的影响,优选最佳提取工艺。并比较超声法、回流法与传统工艺对靛玉红提取率的影响。结果:三种提取方法中,超声法提取率最高且方法简便。其最佳工艺条件为A1B1C2D3。即加10倍量60%的乙醇、超声提取3次,每次20 m in。结论:超声法具有时间短、收率高、耗能小、无需加热等优点,应用前景广阔。     

中药材产业现代化建设的GAP模式探讨

目的　探讨适合中药材 GAP的可行操作模式。方法　以板蓝根的 GAP种植为例 ,探讨了种植过程中不同操作管理模式对中药材质量的可能影响。结果　在 GAP种植过程中 ,以质量为核心、以产业化为目标、真正做到产、学、研的紧密结合、不断深入研究、防止品种退化的操作模式才能保证中药材 GAP产业化的形成和持续发展。结论　中药材产业的持续和稳定发展 ,尚需要系统和完善管理模式的支撑 ;板蓝根的 GAP种植 ,在较完善的 GAP操作模式下 ,正在朝产业化和现代化的方向推进     

板蓝根适宜采收期的研究

目的:确定板蓝根适宜的采收期.方法:通过HPLC法比较测定了板蓝根生长期内腺苷的含量,同时以常规方法比较了生长期内干物质积累动态以及醇溶性浸出物的含量.结果:在板蓝根的生长过程中,腺苷和醇溶性浸出物的含量一直呈增长趋势,在11月份前增长最快,其干物质积累在12月份达到最高.结论:综合考虑板蓝根中的腺苷含量、醇溶性浸出物的含量及其产量,板蓝根适宜的采收期为11月至12月.     

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅱ.转半夏凝集素基因菘蓝的分子生物学检测

目的 获得转基因菘蓝的分子生物学证据。方法 对经卡那霉素筛选的抗性再生菘蓝苗进行聚合酶链式反应(PCR)，Southern杂交和RT—PCR检测。结果 PCR和Southern杂交检测结果表明，外源半夏凝集素基因已经整合到转基因菘蓝的基因组中，RT—PCR结果表明其DNA可以正常转录成mRNA。结论 可以利用农杆菌介导的基因转化技术培育抗虫的菘蓝新品系。