一株新的鼠抗人2IgB7-H3功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

研制功能性鼠抗人2IgB7-H3单克隆抗体。以人2IgB7-H3基因转染细胞L929/2IgB7-H3为免疫原,常规免疫6~8周龄的雌性BALB/c小鼠;利用B淋巴杂交瘤技术,将免疫小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞株SP2/0融合,L929/2IgB7-H3细胞为抗原筛选阳性细胞;经间接免疫荧光标记法对杂交瘤细胞进行反复筛选和多次克隆化培养;采用快速定性试纸法鉴定单抗Ig亚类;利用竞争抑制性实验分析该单抗识别的抗原表位;采用MTT法分析该单抗在体外阻断DC对T细胞的促增殖效应。结果:获得了1株持续稳定分泌鼠抗人2IgB7-H3单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为7D7),该单抗可特异识别L929/2IgB7-H3分子和介导有效的共刺激信号。该单抗的成功获得和其生物学特性的初步鉴定,为进一步研究B7-H3两个异构体在DC细胞及肿瘤细胞上的作用机制奠定了物质基础。     

人B7-H3基因转染及其生物学功能的研究

B7 H3是新近发现的B7家族新成员。为探讨其体外生物学功能及单克隆抗体的研制构建了B7 H3基因转染细胞。利用PCR的方法扩增出B7 H3基因 ,继而插入逆转录病毒载体pGEZ Term ,重组逆转录病毒载体与两个辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,经用含有完整病毒颗粒的 2 93T细胞的培养上清感染L92 9细胞 ,Zeocin筛选获得B7 H3的基因转染细胞。RT PCR、Westernblot和流式细胞仪表型分析等方法鉴定表明 ,B7 H3/L92 9基因转染细胞能稳定表达人B7 H3蛋白。继而基因转染细胞对T细胞体外培养试验显示该基因转染细胞与T细胞共培养可抑制其体外增殖。ELISA法分析表明该基因转染细胞抑制活化T细胞IFN γ及IL 10的分泌。CD2 8信号可以逆转B7 H3对活化T细胞的抑制效应。综上结果证实 ,B7 H3对体外活化的T细胞具有负性调控作用。     

小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的表达及其生物学活性的研究

目的:制备B7-H3-Fc融合蛋白,研究其对T细胞的共刺激作用。方法:首先采用PCR技术分别从pMD19-T/小鼠B7-H3和pMD19-T/hIgG1(Fc)重组载体中扩增出小鼠B7-H3胞外段基因和人IgG1重链Fc恒定区基因。通过重叠PCR技术将2段基因连接成B7-H3-Fc,经EcoR I和BglII双酶切后插入真核表达载体pIRES2-EGFP构建成pIRES2-EG-FP/B7-H3-Fc重组载体。脂质体法转染CHO细胞,经G418加压筛选能稳定分泌表达小鼠B7-H3-Fc融合蛋白的基因转染细胞,并经Western blot鉴定。该转基因细胞无血清培养后,收集细胞上清、超滤浓缩后行经Protein G柱纯化,获得纯品B7-H3-Fc融合蛋白。通过CCK-8以及ELISA方法检测小鼠B7-H3-Fc融合蛋白对T细胞体外增殖及细胞因子分泌的影响。结果:成功地构建了能稳定表达B7-H3-Fc融合蛋白基因的CHO转基因细胞株,该融合蛋白能够剂量依赖性地促进T细胞体外增殖及IL-2和IFN-γ等细胞因子分泌。结论:本研究提示B7-H3作为重要的共刺激分子,在调节T细胞免疫应答中发挥了正性共刺激作用。     

转染人4IgB7-H3细胞株的构建及其对T细胞共刺激作用的研究

作为新发现的共刺激分子,B7-H3的生物学功能还存在着争议。B7-H3在小鼠中仅有单个的IgV-IgC样区称为2IgB7-H3,在人类中除了2IgB7-H3,还存在具有两个IgV-IgC样区的4Igg7-H3。mRNA的结果显示4IgB7-H3在人类细胞株和组织中比2IgB7-H3有着更广泛的表达,在单核细胞来源的DC(未成熟和成熟)上主要的表达形式也可能是4IgB7-H3。为此推测4IgB7-H3的生物学功能可能较2IgB7-H3重要。B7-H3两种异构体在生物学功能上是否存在差异及     

B7-H4基因对SKOV3细胞生长功能的影响

目的： 初步探讨B7-H4基因对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞生长和致瘤性的影响。方法：RT-PCR法扩增编码基因, 构建真核表达载体PEGFP-N1/B7-H4,以脂质体为载体将重组质粒PEGFP-N1和PEGFP-N1/B7-H4分别导入SKOV3细胞中,筛选建立高表达的细胞株。MTT法绘制体外培养细胞生长曲线,将转染前后的肿瘤细胞分别接种于SCID小鼠的腹部皮下观察其致瘤性。结果：成功构建了人B7-H4真核表达载体,SKOV3/B7-H4细胞高表达B7-H4,转染后肿瘤细胞体外生长速度明显增快。SKOV3/B7-H4细胞在小鼠体内的致瘤性较SKOV3/neo细胞和野生型SKOV3细胞明显升高。结论： B7-H4基因导入细胞后在体外和体内具有明显加快肿瘤生长的作用,可作为肿瘤基因治疗的靶向基因。     

B7-H3：一种新的共刺激分子

B7-H3是B7家族的最新成员，B7-H3 mRNA广泛存在于非淋巴组织，其受体在活化的T细胞表面可被诱导表达，且此受体不同于CTLA-4、ICOS和PD-1。在抗人CD3单克隆抗体存在的情况下，B7-H3可增加CD4^ 和CD8^ 细胞的生成，且是剂量依赖性的，并可选择性的增加IFN-γ的生成，参与T、B细胞的活化和机体免疫，在肿瘤治疗、器官移植和自身免疫病的治疗方面具有重要的作用。     

卵巢上皮-间质肿瘤中B7-H3、B7-H4的表达及临床病理意义

目的探讨B7-H3、B7-H4在卵巢上皮-间质肿瘤中的表达及其临床病理意义。方法用RT-PCR技术及免疫组化PV9000两步法研究86例卵巢恶性上皮-间质肿瘤(恶性组),40例卵巢交界性上皮-间质肿瘤(交界组)和40例卵巢良性上皮-间质肿瘤(良性组)B7-H3与B7-H4mRNA及蛋白表达情况,并结合临床病理参数进行分析。结果 B7-H3、B7-H4mRNA在3组卵巢肿瘤组织中均有表达,且各自的3组卵巢肿瘤组织的mRNA光密度值差异均有统计学意义(P<0.05);B7-H3与B7-H4蛋白在恶性组中均呈细胞质和(或)细胞膜表达,其中B7-H3阳性率为81.4%(70/86),明显高于交界组22.5%(9/40)和良性组5.0%(2/40)的表达,差异有统计学意义(P<0.05);B7-H4阳性率为77.9%(67/86),明显高于交界组35.0%(14/40)和良性组5.0%(2/40)的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。恶性组的卵巢癌组织中B7-H3蛋白在非黏液性卵巢癌中较黏液性卵巢癌高表达,差异有显著性(P<0.01),与临床分期、病理分级、患者年龄、腹水细胞学和淋巴结转移差异均无统计学意义(P>0.05)。B7-H4蛋白表达与组织病理学类型、临床分期、病理分级、患者年龄、腹水细胞学和淋巴结转移差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 B7-H3与B7-H4在卵巢恶性上皮-间质肿瘤表达提示其可能与肿瘤的发生、发展有关,可为卵巢恶性肿瘤的诊断及治疗提供新的依据。     

B7-H3:一种新的共刺激分子

B7 H3是B7家族的最新成员 ,B7 H3mRNA广泛存在于非淋巴组织 ,其受体在活化的T细胞表面可被诱导表达 ,且此受体不同于CTLA 4、ICOS和PD 1。在抗人CD3单克隆抗体存在的情况下 ,B7 H3可增加CD4 + 和CD8+ 细胞的生成 ,且是剂量依赖性的 ,并可选择性的增加IFN γ的生成 ,参与T、B细胞的活化和机体免疫 ,在肿瘤治疗、器官移植和自身免疫病的治疗方面具有重要的作用     

鼠抗人B7-H4单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的:研制鼠抗人B7-H4分子的单克隆抗体(mAb)并鉴定其生物学特性。方法:以高表达人B7-H4分子的转基因细胞L929/B7-H4为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴瘤杂交技术,经免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选、多次克隆化培养,获得两株可特异分泌鼠抗人B7-H4分子mAb的杂交瘤细胞株。采用快速定性试纸分析法鉴定mAb所属的Ig亚类。用Dot-blot、Western blot鉴定mAb的特异性,竞争结合抑制实验鉴定mAb所识别的抗原结合位点,T细胞增殖抑制阻断实验对mAb的生物学功能进行初步的鉴定。结果:获得两株持续、稳定地分泌抗B7-H4 mAb的杂交瘤细胞,分别命名为1F10和2B2。Dot-blot的结果显示,两株mAb均能特异性识别B7-H4分子。Westernblot检测显示,mAb 2B2可以特异性识别B7-H4分子,而mAb 1F10则不能识别。位点竞争实验表明,两株mAb之间,mAb 1F10与商品化的mAb H74之间识别位点不同,mAb 2B2与商品化mAb识别位点相近。T细胞增殖抑制阻断试验显示,这两株mAb均能一定程度地阻断B7-H4对T细胞的抑制作用。结论:成功地获得两株抗人B7-H4分子的mAb,为进一步研究B7-H4分子的生物学功能提供了有效的工具。     

B7-H4在人胶质瘤组织中的表达及其临床意义

 目的： 探讨B7-H4在人胶质瘤组织中的表达及其临床意义。方法： HE染色分析了150例胶质瘤标本病理级别。免疫组化方法检测B7-H4在胶质瘤中的表达, 并分析其与临床病理参数及生存时间的关系。结果： HE染色检测150例胶质瘤标本病理级别,结果为I级12 例,II级50 例,III级39 例,IV级49 例。150例胶质瘤标本中97例B7-H4高表达,高表达率为64.7％,居于病理级别III～IV级;43例B7-H4低表达,低表达率为28.7%,居于病理级别I～II级。统计学分析提示组织标本中B7-H4的表达与年龄(P<0.01)和病理级别(P<0.01)存在明显相关,与肿瘤的部位没有显著相关性（P>0.05）。B7-H4阳性患者生存期更短（P<0.01）,多因素Cox 回归分析显示B7-H4、年龄、性别及病理级别均是胶质瘤患者的独立预后因素。结论： B7-H4在多数胶质瘤组织中表达较高,可作为脑胶质瘤患者的独立预后分子标志物和新的治疗靶点。     

Characterization and application of two novel monoclonal antibodies against 2IgB7-H3: expression analysis of 2IgB7-H3 on dendritic cells and tumor cells

2IgB7-H3 has recently been identified as a new member of the B7 family. Its expression at the protein level remains largely unknown due to the lack of the specific monoclonal antibody (mAb). To characterize the expression of 2IgB7-H3, we newly generated two mouse antihuman 2IgB7-H3 mAbs (4H7 and 21D4). We found the constitutive expression of 2IgB7-H3 on a series of tumor cell lines. Furthermore, the expression was examined on monocyte-derived dendritic cells (Mo-DCs) and DCs from CD34(+) hematopoietic progenitor cells (HPC) by means of mAb staining. The results showed that 2IgB7-H3 was expressed on Mo-DCs at a high and stable level during differentiation in vitro. With the maturation of DCs from CD34(+) HPCs, the expression of the molecule was upregulated. However, the 2IgB7-H3 was not expressed on fresh isolated T and B lymphocytes, monocytes, or CD34(+) HPCs. These results suggested that 2IgB7-H3 may be a valuable surface antigen for the detection of DCs.     

原发性胆汁性肝硬化患者共刺激分子B7-H4的检测及临床意义

目的 探讨原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者共刺激因子B7-1t4的表达及其与疾病发病机制的关系.方法 分别采用荧光实时定量PCR法(real-time PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及流式细胞术(FCM)检测65名PBC患者外周血单个核细胞(PBMC)B7-H4mRNA表达水平、血清IL-2水平以及CD4+、CD8+ T细胞亚群和T细胞表面B7-H4表达百分率,同时监测抗线粒体抗体(anti-mitochondrial antibody,AMA)及临床各项生化指标的关系.结果 (1)PBC患者PBMC B7-144 mRNA水平及T细胞表面B7-H4表达百分率显著低于非PBC肝硬化组及健康对照组(P<0.01).(2)活化72 h后各实验组及对照组IL-2含量及CD4+、CD8+、CD4+ CD8+T淋巴细胞表达水平均低于活化前,以非PBC肝硬化组与健康对照组降低显著(P<0.05);PBC组IL-2含量及CD4+、CD4+ CD8+ T淋巴细胞表达水平高于非PBC肝硬化组与健康对照组(P<0.01).(3)AMA-M2阳性患者血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)及γ-谷氨酰转肽酶(GGT)水平升高,其中ALP及GGT升高显著(P<0.05);AMA-M2阳性患者与阴性患者T细胞表面B7-H4表达百分率差异无统计学意义(P>0.05).结论 共刺激因子B7-H4对PBC患者体内T细胞活化增殖及细胞因子分泌的抑制作用减弱,为研究PBC的发生发展和阐明PBC的发病机制提供了试验资料.     

B7-H4与肿瘤关系的研究进展

T细胞介导的免疫应答在肿瘤免疫中起到重要作用,而T细胞的活化过程又依赖于双信号和细胞因子,其中活化的第二信号来自协同刺激分子,协同刺激分子中B7/CD28家族成员在肿瘤免疫中发挥着重要作用.B7家族新成员B7-H4是T淋巴细胞免疫应答的负性调控因子,可抑制T细胞的增殖和细胞因子的产生,其与肿瘤的发生发展有着重要的关系,可作为肿瘤诊断和治疗的新靶点.     

负性协同刺激分子B7-H4在小鼠树突状细胞上的表达及其生物学意义

目的 探讨B7-H4分子在小鼠树突状细胞分化发育过程中的表达及其在T细胞活化中的作用.方法 采用GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导小鼠髓系树突状细胞(DCs);采用流式细胞术检测未成熟DCs、成熟DCs以及IL-10诱导的DCs表面B7-H4分子的表达;采用3H-TdR掺入试验和抗B7-H4单抗(McAb)阻断试验分析DCs表达的B7-H4分子对T淋巴细胞的共刺激效应.结果 经GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导的未成熟DCs较高水平表达B7-H4,在IL-10作用下B7-H4表达进一步上调,经TNF-α刺激成熟后,B7-H4的表达显著下调,不同功能状态下DCs表面B7-H4分子均可抑制T细胞的增殖,但以未成熟DCs、IL-10诱导的DCs表面B7-H4分子的抑制作用更为显著.结论 不同功能状态下的DCs均有B7-H4分子的表达,处于抑制状态下的DCs通过高表达B7-H4介导免疫不应答效应.