肿瘤坏死因子α诱导胶质瘤细胞凋亡和p38丝裂素活化蛋白激酶表达

一、材料和方法1.材料 :胶质瘤细胞Ｃ6购自本校全军神经外科研究所。重组人肿瘤坏死因子α(ＲｈＴＮＦ α)购自Ｓｉｇｍａ公司 ,按照所需浓度以ＰＢＳ稀释。噻唑蓝 (ＭＴＴ)购自Ａｍｒｅｓｃｏ公司。二甲基亚砜 (ＤＭＳＯ)购自Ｆｌｕｋａ公司。ＲＰＭＩ 16 40培养液购自Ｓｉｇｍａ公司。小牛血清购自杭州四季青生物制品公司。ｐ38丝裂素活化蛋白激酶 (ｐ38ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ,ｐ38ＭＡＰＫ)抗体由新加坡国立大学林圣彩教授惠赠。免疫组织化学ＳＡＢＣ试剂盒购自武汉博士德公司。2 .方法 :(1)Ｍ…     

肝纤维化启动期大鼠血清对肝星形细胞TGF-β1表达的影响

目的　研究大鼠血清与肝星形细胞表达 TGF- β1的关系 ,为临床的早期诊断和中医药治疗肝纤维化提供新的思路。　方法　制备正常大鼠血清、免疫性肝纤维化大鼠血清和益气活血复方药物血清 ,培养肝星形细胞(HSC) ,激光共聚焦显微镜定量分析其 TGF- β1的表达。　结果　 (1)造模 3周时大鼠血清使培养的 HSC中 TGF- β1表达显著增强 ,正常鼠血清、造模 5周和 7周 (即纤维化形成后 )血清没有此作用 ;(2 )添加益气活血药物血清可使造模 3周鼠血清刺激 HSC高水平表达的 TGF- β1作用消失。　结论　 (1)造模 3周鼠血清中含有强烈的刺激 HSC激活的物质 ;(2 )活血化淤方剂的作用靶点是血液中的活性物质 ,通过拮抗血液中 HSC活化物质达到抗纤维化的作用     

神经病理性疼痛中星形胶质细胞被激活后的p38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路

目的:探索神经性病理痛中星形胶质细胞被激活后的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号转导通路.方法:SD大鼠分为坐骨神经慢性结扎模型组(CCI组)和假手术组(Sham组),并于术前ld和术后1、3、7、14d取第4～5腰段脊髓做石蜡切片,免疫荧光组织化学标记p38MAPK的表达,免疫荧光双标技术检测其与脊髓神经细胞之间的关系.结果:CCI组术后术侧脊髓背角p38MAPK免疫阳性细胞数量增多;p38MAPK平均荧光强度明显增高并在术后第7天显示为最高.p38MAPK和小胶质细胞在CCI组脊髓背角术侧的分布有较好的一致性.结论:在神经病理性疼痛巾,p38MAPK信号转导通路被激活但未参与星形胶质细胞的痛觉信号转导.     

实验性肝纤维化大鼠层粘连蛋白含量的变化

用四氯化碳诱导大鼠肝脏纤维化，采用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测大鼠血清和肝组织匀浆中层粘连蛋白（ＬＮ）含量，并分析ＬＮ与肝功能及肝组织学病理改变之间的关系。结果发现，血清ＬＮ在大鼠肝脏受损伤后早期即出现增加，并随肝组织损害程度的加重而递增，与肝功能改变及病理损伤有一定相关性。肝匀浆中ＬＮ含量在肝损伤晚期才升高，与肝功能指标没有相关性，提示，血清ＬＮ含量改变是反映肝脏损伤的敏感指标，可用于动态观     

四氯化碳诱导性肝纤维化大鼠肝组织骨形态发生蛋白-7的表达

目的 探讨四氯化碳(CCl4)诱导性肝纤维化大鼠的肝组织纤维化与骨形态发生蛋白-7(BMP-7)表达的相互关系.方法 将健康雄性 Wistar 大鼠随机分为对照组和肝纤维化组.对照组大鼠每周一、四背部皮下注射橄榄油(0.12ml/100g),肝纤维化组每周一、四背部皮下注射60% CCl4橄榄油(0.3ml/100g),连续注射6、10、16 和21周.实验结束时处死大鼠,取肝中叶,石蜡包埋、切片.行天狼猩红染色,观察肝组织胶原纤维的增生情况;行BMP-7免疫组织化学染色和 Western blotting 检测,观察肝组织.BMP-7的表达.结果 天狼猩红染色显示对照组大鼠仅在肝门静脉及门管区看到少量的胶原纤维,各肝纤维化组大鼠均可见肝组织呈明显的胶原纤维增生,且随着时间的延长,肝纤维化程度逐渐加重;免疫组织化学染色显示,对照组大鼠肝组织中可见极少量的BMP-7表达阳性的细胞,6周肝纤维化组大鼠可见较多的BMP-7阳性表达细胞,但随着实验时间的延长,BMP-7阳性细胞呈递减的趋势,至21周肝纤维化组大鼠肝组织中基本呈阴性表达;Western blotting 法检测大鼠肝组织BMP-7的表达结果与免疫组织化学的结果基本一致.结论 CC14诱导性肝纤维化大鼠肝组织BMP-7的表达与肝纤维化的程度呈负相关的趋势,推测BMP-7可能对肝纤维化具有一定的保护作用.     

脂肪特异性蛋白27对大鼠肝星状细胞活化的影响

 目的：探讨脂肪特异性蛋白27（Fsp27）对肝星状细胞（HSCs）增殖和活化的影响及其对纤维化相关蛋白的调节作用。方法：从SD大鼠肝脏提取HSCs并培养,采用实时荧光定量PCR、免疫荧光染色和Western blotting检测原代HSCs和活化HSCs中Fsp27 mRNA和蛋白的表达。构建携带Fsp27基因的慢病毒,转染活化的HSCs并继续培养72 h,通过CCK-8比色法检测Fsp27对HSCs增殖的影响;Western blotting检测HSCs中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,了解HSCs的活化状态;实时荧光定量PCR检测Fsp27对HSCs中纤维化相关蛋白［包括基质金属蛋白酶2（MMP-2）、金属蛋白酶组织抑制物1（TIMP-1）和转化生长因子β1（TGF-β1）］ mRNA表达的影响。结果：成功分离大鼠原代HSCs。Fsp27在原代HSCs和活化HSCs中的表达差异显著（P<0.01）;活化HSCs成功转染携带Fsp27基因的慢病毒后继续培养72 h,与对照组比较,HSCs的活化与增殖被明显抑制（P<0.05）;Fsp27促进MMP-2 mRNA的表达（P<0.05）,降低TIMP-1和TGF-β1 mRNA的表达（P<0.05）。结论：Fsp27可抑制HSCs的增殖和活化,并调节纤维化相关蛋白的表达。Fsp27的作用可能与其维持HSCs静息状态细胞表型有关。     

肝纤维化形成过程中肝星状细胞的活化机制

肝纤维化的形成是一个多因素、多细胞参与的复杂过程,肝星状细胞(HSC)的活化可能是其中的核心环节;活化后的HSC在形态和功能上都发生了显著变化.枯否细胞、pit细胞、炎症细胞和炎症反应的旁分泌作用,HSC活化后的自分泌作用,以及基因改变、活化HSC凋亡等均参与了HSC活化过程的调节.     

COX-2/sEH双抑制剂PTUPB抑制肝星型细胞活化减轻小鼠肝纤维化

目的 探讨花生四烯酸（ARA）经细胞色素P450(CYPs)及环氧合酶2(COX-2)代谢途径在非酒精性脂肪肝（NAFLD）相关肝纤维化中的作用,并从肝星形细胞（HSC）活化的角度探讨其机制。方法采用雄性C57BL/6J小鼠为研究对象,高糖高脂饲养（HFD）诱导小鼠NAFLD相关肝纤维化模型。给予小鼠每天皮下注射COX-2/可溶性环氧化物水解酶（sEH）双抑制剂PTUPB(5 mg/kg)。12周后观察COX-2/sEH双抑制对小鼠NAFLD相关肝纤维化的影响。记录小鼠体重变化;检测小鼠葡萄糖耐受性;HE染色观察小鼠肝组织病理损伤;油红O染色观察小鼠肝组织脂质堆积;Masson染色及Western blot法检测肝组织胶原含量;Real-time PCR法检测小鼠肝组织基质金属蛋白酶抑制因子相关基因表达;Western blot法检测PTUPB对棕榈酸（PA）诱导的肝星形细胞JS1活化的影响。结果 PTUPB可显著降低HFD小鼠的体重,提高小鼠葡萄糖耐受性,减轻肝组织病理损伤、脂质堆积和胶原沉积;PTUPB亦可降低HFD小鼠肝组织基质金属蛋白酶抑制因子Timp1及Timp2的基因表达;...     

肝纤维化大鼠部分肝切除后肝星状细胞活化和肝细胞生长因子的表达

目的：研究肝星状细胞在肝纤维化大鼠部分肝切除后的活化情况及其对肝细胞生长因子表达和肝再生的影响。方法：成年雄性SD大鼠，随机分成3组：正常组、肝纤维化组和肝纤维化大鼠部分肝切除组。其中肝纤维化大鼠部分肝切除组根据术后取材时间又分为6小组，分别于术后12h、1、3、5、7和14d取材。计算肝指数评价肝再生情况；用免疫组化、免疫荧光和免疫印迹方法检测各组大鼠肝组织中α平滑肌肌动蛋白和肝细胞生长因子的表达情况。结果：肝纤维化大鼠部分肝切除后肝指数逐渐增加，但递增速度缓慢；肝组织中α平滑肌肌动蛋白的表达呈现出先降低后升高的规律；肝细胞生长因子表达早期下降，而后升到一最高值后开始降低。结论：（1）肝纤维化大鼠部分肝切除后残肝可以再生；（2）活化肝星状细胞术后呈现出先减少后增多的规律性变化；（3）肝星状细胞可能是术后肝细胞生长因子表达和残肝再生的重要影响因素。     

白藜芦醇预处理对星形胶质细胞氧糖剥夺/再复氧损伤后活化及炎症反应的影响

目的 探讨白藜芦醇预处理对体外氧糖剥夺/再复氧(OGD/R) 损伤后星形胶质细胞活化及炎症反应的影响。方法 征集20只新生SD大鼠（生后24 h内）,将其原代分离培养的大脑皮层星形胶质细胞行氧糖剥夺150 min,再复氧培养24 h。实验分为正常组(Nor)、对照组(Ctrl) 和白藜芦醇预处理组(Res)。 CCK-8法检测细胞活力,5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（EdU）法检测细胞增殖,免疫荧光染色法检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、S100β蛋白表达,Western blotting 检测GFAP、S100β、波形蛋白(vimentin)、白细胞介素（IL）-10、β干扰素（IFN-β）、肿瘤坏死因子α(TNF-α）和 IL-1β蛋白表达,ELISA法检测IL-10、IFN-β、TNF-α和IL-1β蛋白含量。结果 CCK-8法检测结果显示,随着白藜芦醇浓度（5、20、40 μmol/L）的增高,细胞活力逐渐增高,且与对照组差异有显著性（P<0.01）,以40 μmol/L组细胞活力最强。之后随白藜芦醇浓度(80、100 μmol/L) 的增高,细胞活力显著降低,以100 μmol/L组细胞活力最弱 (P<0.05)。EdU检测显示,在OGD/R损伤后,对照组和白藜芦醇组显著高于正常组EdU阳性细胞比例(P<0.01),而白藜芦醇组显著低于对照组 (P<0.01)。免疫荧光染色、Western blotting和ELISA法显示,对照组和白藜芦醇组GFAP、S100β、vimentin、IL-10、IFN-β、TNF-α和IL-1β 蛋白表达或含量显著高于正常组(P<0.05),但白藜芦醇组除 IL-10 和IFN-β蛋白表达或含量较对照组增高外,其余均低于对照组(P<0.05)。结论 白藜芦醇预处理可抑制 OGD/R 后体外星形胶质细胞的活化,并减轻炎症反应。     

The predictive value of CD38 positive hepatic stellate cell count for assessing disease activity and fibrosis in patients with chronic hepatitis

The activation of hepatic stellate cells (HSCs) is a critical event in hepatic fibrosis. The objectives of this study were to find out if cluster of differentiation 38 (CD38) can be demonstrated immunohistochemically on HSCs in liver biopsies from patients with chronic liver disease and if CD38 immunopositive HSC count is correlated with METAVIR inflammatory and fibrosis scores. Immunohistochemical labelling for CD38 was performed on 100 liver biopsies from patients with chronic liver disease. The CD38 immunopositive HSCs were identified and counted. The CD38 immunopositive HSC count was found to be associated with both the METAVIR score and the fibrosis scores. The CD38 immunopositive HSC count was able to discriminate between no fibrosis and stages 2, 3 or 4 fibrosis, but could not discriminate between no fibrosis and stage 1 fibrosis. Using receiver operating characteristic (ROC) curves, a cut-off point of 10 HSCs per 10 high power field (hpf), or 25 per 100 hepatocytes, is 80% sensitive and 70% specific for predicting fibrosis. The specificity rose to 100% in patients with hepatitis C viral (HCV) infection. We conclude that CD38 positive HSCs can be demonstrated immunohistochemically and that the count is highly predictive of moderate to severe hepatic fibrosis.     

基于HSC的肝纤维化发病及治疗研究进展

肝纤维化主要是由肝星状细胞（HSC）的活化、细胞外基质（ECM）的合成与降解失衡导致ECM的过度增生和沉积所致。HSC的激活和增生是肝纤维化发生、发展的中心环节,抑制HSC的活化是防治肝纤维化形成的关键。抗肝纤维化的治疗措施包括抑制HSC增殖或诱导HSC凋亡,抑制胶原蛋白的产生或促进胶原蛋白的降解、细胞因子的调控以及间质干细胞的灌注等,因而早期肝纤维化的防治研究具有重要意义。     

肝星状细胞SCAP特异性敲除对小鼠肝纤维化的影响

目的:探讨固醇调节元件结合蛋白裂解活化蛋白(SCAP)在肝星状细胞中缺失能否延缓小鼠肝纤维化进程.方法:将SCAPloxP/loxP小鼠与Lrat-Cre工具鼠繁殖得到Lrat-Cre+/+SCAPfl/fl、Lrat-Cre+/?SCAPfl/fl和Lrat-Cre?/?SCAPfl/fl小鼠,并用PCR法对小鼠基因...     

辣椒素抑制大鼠肝纤维化的实验研究

 目的：探讨辣椒素（capsaicin）对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）活性的影响及其对实验性肝纤维化的治疗作用。方法：DCFH-DA法检测辣椒素对HSCs中活性氧的影响;CCK-8法检测辣椒素对HSCs增殖的影响;Western blotting检测HSCs α-平滑肌肌动蛋白的表达;RT-PCR检测辣椒素对HSCs纤维化相关基因表达的影响;流式细胞术检测辣椒素对HSCs凋亡的影响;通过腹腔注射四氯化碳建立鼠肝纤维化模型,经腹腔输注辣椒素,检测肝组织病理切片,观察肝纤维化指标的变化。结果：与对照组比较,辣椒素抑制了HSCs中活性氧的产生,明显抑制了HSCs的活化与增殖(P<0.05),促进了HSCs的凋亡(P<0.05),降低了金属蛋白酶组织抑制物1及转化生长因子β 1的表达(P<0.05),降低了肝羟脯氨酸含量及血清Ⅲ型胶原和透明质酸水平(P<005)。结论：辣椒素抑制HSCs增殖、活化并诱导其凋亡。辣椒素对实验性肝纤维化具有一定的抑制作用。     

MEF2A与肝星状细胞活化的关系研究

目的： 观察核转录因子-肌细胞增强因子2A (MEF2A)在肝星状细胞(HSC)活化过程中的动态变化及与HSC活化指标α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的关系,探讨MEF2A在HSC活化过程中可能作用。方法: 从SD大鼠肝脏分离HSC并培养在塑料细胞培养皿中,在体外培养过程中HSC逐步活化,分别收集新分离(0 d)和经培养(1、2、3、4、5、6、7、8 d)的HSC,采用实时荧光定量PCR检测各期细胞中MEF2A mRNA表达;Western blotting检测各期细胞中MEF2A和α-SMA的含量;凝胶阻滞实验(EMSA)方法检测MEF2A DNA结合活性。结果: 实时荧光定量PCR结果表明新分离的HSC内有少量MEF2A mRNA表达,随着HSC培养逐步活化,MEF2A mRNA表达逐步增加;Western blotting检测结果发现新分离的HSC内有少量MEF2A及α-SMA,随着HSC培养逐步活化,细胞内MEF2A及α-SMA逐步增加,二者呈正相关;EMSA结果表明MEF2A DNA结合活性逐步增高。结论: 随着HSC激活,MEF2A基因和蛋白表达量逐渐增加,且MEF2A DNA结合活性同步增高,MEF2A可能参与了HSC活化过程。     

Transmembrane protein 88 attenuates liver fibrosis by promoting apoptosis and reversion of activated hepatic stellate cells

Transmembrane protein 88 (Tmem88) is a crucial inhibitor for Wnt/β-catenin pathway in the development of myocardial cells. Due to the important role of β-catenin in the activation and proliferation of hepatic stellate cells (HSCs), it is necessary to investigate the function of Tmem88 in HSCs. In this study, we found that Tmem88 expression was decreased in the human liver fibrotic tissues, primary HSCs from fibrotic mice and activated HSC-T6 cells. Functionally, Tmem88 could inhibit HSCs activation and proliferation by blocking Wnt/β-catenin pathway, and promoted the apoptosis of activated HSCs by initiating Bcl-2/Bax/Caspase3 pathway. Moreover, the level of DNA metyltransferase 3a (Dnmt3a) was upregulated in activated HSCs, and siRNA-mediated Dnmt3a silencing led to Tmem88 restoration. These results indicated that Tmem88 played an important role in HSCs activation, proliferation and apoptosis, and Tmem88 expression might be modulated by Dnmt3a.     

NK细胞与肝纤维化关系的研究进展

以活化的肝星状细胞为中心的局部免疫微环境在肝纤维化的发展中起着关键作用。而近年来一些研究表明NK细胞可通过产生具有抗纤维化作用的IFN-γ并且直接杀死活化HSCs,起到明显的抗肝纤维化作用。因此,刺激NK细胞活化极可能成为治疗肝纤维化的新途径。     

Effect of cholinergic denervation on hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats

Various factors involved in the development of liver fibrosis, including hepatic stellate cells (HSCs), cholinergic nervous activity and fibrogenetic cytokines. The present study aims to investigate the role of cholinergic regulation in the promoting of liver fibrogenesis relating to bone morphogenetic protein-6 (BMP-6) and/or transforming growth factor-beta1 (TGFbeta1). We treated carbon tetrachloride (CCl(4)) into rats for eight weeks to induce liver fibrosis and arranged these rats for cholinergic denervation, hepatic branch vagotomy or atropine administration. Acetylcholinesterase (AChE) staining showed the distribution of cholinergic nerve around fibrosis scaring septa. The immunohistochemical staining for alpha smooth muscle actin (alphaSMA) indicated the less HSCs in CCl(4) treated rat liver with cholinergic denervation as compared to the sham-operated CCl(4) treated rats. It seems that cholinergic nerve not only innervates around the fibrosis area but also promotes HSCs. We also detected TGFbeta1 and BMP-6 expressions using RT-PCR and immunohistochemistry. The obtained results show that cholinergic denerveration decreases BMP-6 and TGF-beta1 expressions in CCl(4) induced liver fibrosis of rats. In conclusion, cholinergic nerve may influence HSCs in addition to the lowering of BMP-6 and TGF-beta1 gene expressions to modify liver fibrosis.     

大鼠原代肝星状细胞活化后组蛋白修饰水平的观察

目的:观察体外培养大鼠肝星状细胞(HSCs)活化过程中组蛋白修饰的改变以及与HSCs活化指标α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的关系,探讨组蛋白修饰在HSCs活化过程中可能的作用。方法:体外分离、鉴定、培养大鼠HSCs,光镜观察HSCs活化过程中的形态变化,细胞免疫荧光染色和Western blotting检测desmin和α-SMA的表达,比较静止型HSCs和激活型HSCs中H4K12乙酰化、H3K9乙酰化、H3K4二甲基化和H3K9二甲基化的变化。结果:(1)细胞形态学观察结果表明HSCs在培养过程中形态由静息状态向高度分化的肌成纤维细胞转化。细胞免疫荧光染色及Western blotting检测结果显示,分离培养24 h的HSCs有desmin表达,但几乎不表达α-SMA;随着培养时间延长,HSCs内α-SMA和desmin表达逐步增加,至15 d时达到最大。(2)根据HSCs细胞形态变化及HSCs活化标志蛋白检测结果,确定培养24 h的HSCs为静止型HSCs,培养15 d的HSCs为激活型HSCs,分别检测其组蛋白修饰变化。结果显示,与静止型HSCs比较,激活型HSCs中H4K12乙酰化、H3K9乙酰化和H3K9二甲基化修饰水平明显降低(P0.01),而H3K4二甲基化修饰水平明显增加(P0.01),且H3K4二甲基化修饰水平变化与α-SMA表达变化一致。结论:在体外培养HSCs活化过程中,组蛋白修饰发生明显异常,提示组蛋白修饰改变有可能参与了HSCs活化以及肝纤维化的发生。