促炎症因子基因表达与长期水砷暴露小鼠肝损伤的关系

目的 探讨促炎症因子在慢性水砷暴露小鼠肝损伤中的作用.方法 60只雄性小鼠按体质量随机分成对照组、亚砷酸钠组(iAs3+组,300 mg/L)、砷酸钠组(iAs5+组,300 mg/L).10个月后处死小鼠,肝功能检查血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、球蛋白(GLB);部分肝组织做HE染色;Trizol-酚-氯仿一步法提取肝组织总RNA,紫外分光光度法测定总RNA及纯度,实时荧光定量PCR法测定肝组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、环氧化酶2(COX-2)mRNA的表达,以18S基因作为质控.结果 ALT、AST、GLB在对照组[(38.0±5.6)U/L、(118.3±9.1)U/L、(20.9±0.6)g/L]、iAs3+组[(61.5±5.5)U/L、(530.9±39.0)U/L、(27.2±4.1)g/L]和iAs5+组[(48.3±2.6)U/L、(243.9±13.6)U/L、(23.2±2.1)g/L]组间比较,差异均有统计学意义(F值分别为45.653、164.326、9.639,P＜0.05);AIJT、AST组问两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05),GLB仅在iAs3+组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).肝组织病理检查示有明显的炎症细胞浸润和肝细胞坏死,TNF-α、IL-6、COX-2 mRNA的表达在对照组(11.84±3.21、41.08±22.98、26.60±5.84)、iAs3+组(48.59±19.65、218.87±70.05、207.86±155.39)、iAs5+组(35.56±10.84、84.15±28.38、18.88±6.34)组间比较,差异均有统计学意义(F值分别为24.317、49.611、8.499,P＜0.05).结论 长期砷暴露可导致肝脏的炎症反应、慢性肝损伤.TNF-α、IL-6、COX-2在iAs3+所导致的肝脏损伤中均起作用,其中TNF-α、IL-6炎症因子基因在iAs3+组肝组织的表达较iAs5+组更明显.COX-2在iAs5+组所导致的肝脏损伤中可能无明显作用.     

基质金属蛋白抑制因子-1 mRNA在饮水砷暴露肝损伤小鼠肝组织中的表达

目的 探讨基质金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)mRNA在饮水砷暴露肝损伤小鼠肝组织中的表达及意义.方法 50只雄性小鼠被随机分成对照组、亚砷酸钠组(iAs3+组,300 mg/L)、砷酸钠组(iAs5+组,300 mg/L).10个月后处死小鼠,肝功能检查血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、球蛋白(GLB);部分肝组织进行HE染色;Trizol-酚-氯仿一步法提取小鼠肝组织总RNA,紫外分光光度法测定总RNA及纯度,实时荧光定量PCR法测定肝组织中TIMP-1 mRNA的表达,以18S基因作为质控.结果 ALT在对照组(36.67±3.51)、iAs3+组(61.46±13.85)和iAs5+组(43.31±4.21)组间比较差异有统计学意义(F=6.559,P＜0.05);iAs3+组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),iAs5+组与对照组、iAs3+组比较差异无统计学意义(P＞0.05);AST在对照组(135.00±20.42)、iAs3+组(510.86±59.01)和iAs5+组(258.93±22.40)组间比较差异有统计学意义(F=83.327,P＜0.05);GLB在对照组(20.86±0.61)、iAs3+组(26.94±3.73)和iAs5+组(24.59±5.27)组间比较差异无统计学意义(F=2.800,P＞0.05).肝组织病理检查显示,肝组织中有明显的肝细胞坏死和再生,TIMP-1 mRNA表达组间比较差异有统计学意义(F=17.337,P＜0.05).结论 TIMP-1基因在水砷暴露肝损伤小鼠肝组织损伤、肝纤维化形成过程中可能起重要作用.     

血小板衍生生长因子和Ⅰ型胶原在饮水砷暴露小鼠肝组织中的表达

目的 探讨血小板衍生生长因子(PDGF)和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)在饮水砷暴露小鼠肝组织中的表达及其意义.方法 50只昆明种雄性小鼠被分成对照组、iAs3+组、iAs5+组.分别饮用自来水,亚砷酸钠溶液(NaAsO2,含砷离子300 mg/L),砷酸钠溶液(Na2HAsO4·7H2O,含砷离子300 mg/L).10个月后处死小鼠,使用全自动生化分析仪检查肝功能,包括血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氧酶(AST)、球蛋白(GLB);Masson染色肝组织,检测单位视场内的纤维面积;免疫组化(SABC)法检测肝组织中PDGF和Col-Ⅰ的表达.结果 ①对照组、iAs3+组、iAs5+组,血清ALT水平分别为(36.67±3.51)、(61.46±13.85)、(43.31±4.21)U/L,组间比较差异有统计学意义(F=6.56,P<0.05),iAs3+组明显高于对照组(P<0.05);血清AST水平分别为(135.00±20.42)、(510.86±59.01)、(258.93±22.40)U/L,组间比较差异有统计学意义(F=83.33,P<0.05),iAs3+、iAs5+组均明显高于对照组(P<0.05),iA3+组明显高于iAs5+组(P<0.05);血清GLB水平分别为(20.86±0.61)、(26.94±3.73)、(24.59±5.27)g/L,组间比较差异无统计学意义(F=2.80,P>0.05).②光镜下染砷组小鼠肝组织出现明显的细胞变性、坏死、再生,汇管区炎细胞浸润,纤维增生.对照组(0.069±0.013)、iAs3+组(0.192±0.108)和iAs5+组(0.143±0.122)单位视场内的纤维面积组间比较,差异有统计学意义(F=1.91,P<0.05),iAs3+组明显高于对照组(P<0.05).③对照组、iAs3+组、iAs5+组PDGF、Col-Ⅰ光密度值分别为202.788±7.462、174.382±7.706、177.644±7.811,200.11±7.46、176.47±10.20、177.38±7.95,组间比较差异均有统计学意义(F值分别为102.91、78.51,P均<0.05),与对照组比较,iAg3+、iAs5+组PDGF、Col-Ⅰ光密度值明显降低(P<0.05).表明肝组织内PDGF、Col-Ⅰ表达明显增多.且PDGF在汇管区、间隔细胞、窦旁细胞内均有表达,而Col-Ⅰ表达广泛分布于血管及胆管周围,并自门管区向肝实质内延伸形成纤维间隔.结论 长期饮水砷暴露,可导致慢性肝脏损伤、肝纤维化形成.PDGF、Col-Ⅰ在砷敛小鼠肝纤维化形成中起重要作用.     

亚砷酸钠和砷酸钠染毒大鼠尿液砷形态分析

目的 分析亚砷酸钠和砷酸钠染毒大鼠尿液中砷形态代谢产物水平,寻找不同价态砷代谢的差异,为进一步探讨砷代谢产物与砷毒性作用机制间的关系提供基础数据.方法 Wistar大鼠70只,体质量80～120 g,按体质量随机分为7组,即对照组、亚砷酸钠高、中、低剂量组和砷酸钠高、中、低剂量组,每组10只.各组大鼠染毒1个月后,收集12 h尿液,采用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱法(HPLC-HGAFS)测定尿液中砷形态代谢产物水平,并通过二甲基砷酸(DMA)加标回收率测定来评价结果准确度.结果 亚砷酸钠中剂量组尿液中各种代谢物[3价无机砷(iAs~(3+))、5价无机砷(iAs~(5+))、DMA]水平[(121.66±1.26)、(10.26±2.68)、(204.91±0.56)μg/L]高于高剂量组[(113.20±0.75)、(5.16±1.32)、(147.70±0.77)μg/L,P均<0.05]和低剂量组[(79.35±2.12)、(5.13±2.25)、(56.35±1.23)μg/L,P均<0.05];砷酸钠中剂量组尿液中iAs~(3+)和DMA水平[(315.81±1.69)、(245.12±1.18)μg/L]高于高剂量组[(85.03±0.56)、(110.34±1.04)μg/L,P均<0.05]和低剂量组[(22.97±2.67)、(15.75±2.15)μg/L,P均<0.05].亚砷酸钠高、低剂量组尿液中iAs~(3+)和DMA水平高于砷酸钠组(P均<0.05);而亚砷酸钠中剂量组尿液中iAs~(3+)和DMA水平低于砷酸钠组(P均<0.05).亚砷酸钠高、中、低剂量组DMA的平均加标回收率为94.80%～102.70%,砷酸钠高、中、低剂量组DMA的平均加标回收率为95.33%～108.40%.结论 染砷价态及外暴露剂量不同,大鼠体内砷代谢物的形态和水平就不同;不同价态无机砷在大鼠体内的代谢径路不完全相同.     

亚慢性砷暴露小鼠血和肝中砷形态及谷胱甘肽水平检测分析

目的 探讨亚慢性饮水砷暴露小鼠血和肝中砷形态的分布,评价砷对血和肝中还原型谷胱甘肽(GSH)水平的影响.方法 小鼠以自由饮水方式饮用含砷量为0(对照)、25、50、100mg/L的水溶液,连续染砷6周.采用氢化物发生-超低温捕集-原子吸收分光光度法,检测小鼠血和肝中无机砷(iAs)、一甲基砷酸(MMA)和二甲基砷酸(DMA)的水平,计算甲基化率.采用二硫双硝基苯甲酸(DTNB)法测定全血和肝组织中GSH的水平.结果 小鼠血和肝中iAs、MMA和DMA水平随染砷剂量的增加而升高.各染砷组小鼠血和肝中的砷一甲基化率(PMI)和二甲基化率(SMI)与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),其中50 mg/L染砷组小鼠肝中SMI[(50.45±2.94)%]明显高于25 mg/L组[(41.68±7.09)%]和100 mg/L组[(41.19±8.87)%],组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).各染砷组小鼠血和肝中砷形态的构成比(iAs:MMA:DMA)分别为2:3:5和4:3:3.有机砷(MMA+DMA)的水平分别约占总砷的80%和60%.各染砷组小鼠血和肝中GSH水平随染砷剂量的增加而下降,与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),但各染砷组之间的小鼠血和肝中GSH水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 当砷暴露水平达到一定程度后,肝脏对iAs的甲基化代谢能力可达到饱和.血中砷形态变化不同于肝组织,提示机体内的其他组织器官也可能具有砷甲基化代谢能力.血和肝中GSH水平是反映砷毒性的较好指标.     

不同剂量亚砷酸钠染毒大鼠唾液砷水平及其与血砷、尿砷间关系研究

目的 探讨不同剂量砷暴露大鼠唾液中含砷量变化及其与血砷、尿砷间的关系.方法 将32只雄性SD大鼠按体质量随机分为4组,分别为对照组(生理盐水)及低(0.2 mg/kg)、中(2.0 mg/kg)、高(20.0mg/kg)剂量亚砷酸钠染毒组,每组8只.采用经口灌胃染毒方法,隔日1次,连续2周后收集唾液、血液、尿液及脏器,计算脏器系数,应用原子荧光分光光度计(AFS-230)检测血砷、尿砷,应用电感耦合-等离子体质谱(ICP-MS)检测唾液砷.结果 亚砷酸钠染毒组大鼠体质量增长值均低于对照组,其中高剂量组[(76.13±17.19)g]与对照组[(103.00±12.31)g]比较,差异有统计学意义(P＜0.05).高剂量组大鼠肝脏及肾脏脏器系数[(3.92±0.54)％、(0.96±0.15)％]与对照组[(3.27±0.35)％、(0.76±0.05)％]比较,差异有统计学意义(P＜0.05或＜0.01).低、中、高染毒组大鼠唾液砷[(0.044±0.019)、(0.211±0.071)、(1.128±0.380)mg/L]、血砷[(11.832±1.887)、(45.032±7.216)、(121.839±17.323)mg/L]及尿砷[(0.138±0.085)、(0.874±0.328)、(8.843±1.754)mg/L]与对照组[(0.018±0.014)、(2.267±0.370)、(0.025±0.011)mg/L]比较,差异有统计学意义(P均＜ 0.05),且各染毒组之间比较差异有统计学意义(P均＜0.05).大鼠唾液砷与血砷、尿砷之间存在显著正相关,相关系数分别为0.934、0.960(P均＜0.01).结论 高砷暴露可抑制大鼠体质量增长,并对肝脏及肾脏有较强毒性.砷在唾液中存在良好的剂量-反应关系,且唾液砷与血砷、尿砷间存在明显的正相关关系,提示唾液砷也是一种良好的砷暴露标志物.     

不同剂量亚砷酸钠染毒大鼠多药耐药相关蛋白2表达水平的变化

目的观察不同剂量亚砷酸钠染毒大鼠肝细胞膜转运蛋白——多药耐药相关蛋白2(multidrugresistance-associatedprotein2,MRP2)表达水平的变化及与砷代谢的关系。方法24只健康雄性Wistar大鼠随机分为4组:第1组为对照组,给予生理盐水;第2～4组为染砷组,分别给予4、10和20mg/kg体质量的亚砷酸钠溶液,隔天灌胃染毒1次,2周后将大鼠处死。原子吸收分光光度法测定胆汁、全血和肝组织中的总砷含量。蛋白印记法测定肝细胞膜上MRP2的改变。结果经方差分析检验,胆汁和肝脏中含砷量随着染砷剂量的增加而逐渐增加(P<0.05)。两两比较发现,3个染毒组的血砷与对照组之间差异有统计学意义,而3个染毒组间差异无统计学意义。随着染砷剂量增加,MRP2表达有增加的趋势,且MRP2表达量与胆汁含砷量呈正相关(r=0.986,P<0.05)。结论亚砷酸钠可以诱导MRP2的表达,随染砷剂量增加,MRP2表达量增加。MRP2在砷及其代谢产物的胆汁排泄过程中发挥了重要作用。     

氟、砷及其联合染毒对大鼠海马和大脑皮质组织Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

目的 探讨氟、砷及其联合染毒对大鼠海马和大脑皮质组织Bcl-2和Bax凋亡蛋白表达的影响.方法 将初断乳SPF级雄性SD大鼠按体质量随机分为对照组、氟处理组、砷处理组和氟砷联合组,每组10只.氟处理组大鼠饮用120 mg/L氟化钠(NaF)水溶液,砷处理组大鼠饮用70 mg/L亚砷酸钠(NaAsO2)水溶液,氟砷联合组大鼠饮用含120mg/L NaF和70 mg/L NaAsO2的水溶液,对照组大鼠饮用蒸馏水.3个月后采用免疫组织化学和Western blot法检测大鼠海马和大脑皮质组织Bcl-2和Bax凋亡蛋白的表达.结果 ①免疫组织化学法检测结果:大鼠海马和大脑皮质组织细胞质中Bcl-2和Bax凋亡蛋白呈现为棕黄色颗粒物;与对照组和氟、砷处理组比较,氟砷联合组大鼠海马和大脑皮质Bcl-2阳性神经元细胞数较少;与对照组比较,氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠海马和大脑皮质Bax阳性神经元细胞数较多,尤其以氟砷联合组的阳性细胞数最多.②Western blot法检测结果:对照组、氟处理组、砷处理组、氟砷联合组大鼠海马组织Bcl-2、Bax蛋白表达分别为0.84±0.22、0.76±0.10、0.75±0.24、0.28±0.05和0.44±0.19、0.81±0.14、1.22±0.45、1.45±0.26,其中氟砷联合组Bcl-2表达明显低于其他3组(P均＜0.05),而氟、砷处理组和氟砷联合组Bax表达均明显高于对照组(P均＜ 0.05),且砷处理组和氟砷联合组Bax表达高于氟处理组;上述4组大鼠大脑皮质Bcl-2、Bax蛋白表达分别为0.51±0.18、0.50±0.12、0.49±0.19、0.33±0.19和0.39±0.18、0.79±0.30、0.79±0.35、0.80±0.18,其中氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠Bax蛋白表达明显高于对照组(P均＜0.05).氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠海马和大脑皮质组织Bcl-2/Bax表达比值(0.96±0.28、0.72±0.45、0.33±0.05和0.69±0.37、0.57±0.10、0.37±0.18)均明显低于对照组(1.91±1.32、1.44±0.29,P均＜0.05),尤以氟砷联合组最明显.结论 在一定染毒剂量下,氟和砷均促进大鼠海马及大脑皮质组织Bax蛋白的表达,降低海马及大脑皮质组织的Bcl-2/Bax表达比值.氟和砷对大鼠海马组织Bcl-2蛋白表达和大脑皮质组织Bcl-2/Bax蛋白表达比值的影响存在协同作用.     

长期染砷致家兔肝脏蛋白巯基水平及巯基代谢相关酶活力下降

目的 探讨长期砷暴露对家兔肝脏蛋白巯基水平及与巯基代谢相关酶活力的影响及机制。方法 家兔以自由饮水方式慢性暴露于无机3价砷（iAs^Ⅲ）及5价砷（iAs^Ⅴ），18周后，测定肝脏组织中蛋白巯基、非蛋白巯基、硫氧还蛋白（TRX）水平，以及硫氧还蛋白还原酶（TR）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性，同时检测血、尿及毛发中无机砷及其代谢产物甲基砷（MMAs）和二甲基砷（DMAs）。结果 经过18周的砷暴露，两个染毒组血和尿中iAs、MMAs、DMAs以及毛发中iAs、DMAs均显著高于对照组；iAs^Ⅴ组血中iAs、MMAs及尿中MMAs水平显著低于iAs^Ⅲ组，而尿及毛发中iAs水平显著高于iAs^Ⅲ组。iAs^Ⅴ组总巯基及蛋白巯基水平显著低于对照组。iAs^Ⅵ组TRX水平、TR及GR活力以及iAs^Ⅲ组TR活力与对照组相比亦显著下降。结论 家兔长期砷暴露导致肝脏中蛋白巯基水平及与巯基代谢密切相关的TR、GR活力显著下降，提示慢性无机砷暴露会引起肝脏内氧化及抗氧化失衡从而引发组织氧化损伤。     

吸烟与饮酒对不同浓度饮水型砷暴露人群尿砷代谢模式的影响

目的 探讨吸烟、饮酒对砷暴露人群尿砷代谢的影响.方法 2008年选择山西省高砷地区不同饮水砷浓度暴露的年龄≥18岁的成年人作为调查对象,根据饮水砷浓度将调查对象分为3组:高砷暴露组(饮水砷浓度≥0.05 mg/L),低砷暴露组(0.01 mg/L≤饮水砷浓度＜0.05 mg/L),对照组(饮水砷浓度＜0.01mg/L).排除近期食用过海产品以及有慢性饮水型砷中毒症状的人群,通过问卷调查方式确定吸烟、饮酒的情况,同时采集居民家水样,以及调查对象的即时尿样.采用氢化物发生原子吸收分光光度法检测尿中无机砷(iAs)、一甲基砷(MMA)和二甲基砷(DMA)含量.以iAs、MMA及DMA的总和表示总砷(tAs)水平;以iAs/tAs、MMA/tAs和DMA/tAs分别计算iAs％、MMA％、DMA％;以(MMA+ DMA)/tAs及DMA/(MMA+ DMA)分别计算一甲基化率(FMR)和二甲基化率(SMR)水平.结果 共调查395人,高砷暴露组中烟酒嗜好者MMA％(16.24％)高于无烟酒嗜好者(12.16％),烟酒嗜好者的SMR水平(82.19％)低于无烟酒嗜好者(86.13％),差异有统计学意义(P均＜ 0.05),吸烟者、饮酒者与无烟酒嗜好者相比,各评价指标差异无统计学意义(P＞0.05);在低砷暴露组中吸烟者、烟酒嗜好者的MMA％( 13.86％、13.99％)均高于无烟酒嗜好者(11.83％),吸烟者、烟酒嗜好者的DMA％(72.87％、77.76％)和SMR水平(83.48％、83.90％)均低于无烟酒嗜好者(80.35％、86.54％),差异有统计学意义(P均＜0.05),饮酒者与无烟酒嗜好者相比,各评价指标差异无统计学意义(P＞0.05).对照组人群中吸烟者、烟酒嗜好者的MMA％( 17.27％、17.06％)均高于无烟酒嗜好者(11.52％),吸烟者、烟酒嗜好者的DMA％(73.89％、72.29％)和SMR水平(81.48％、82.58％)均低于无烟酒嗜好者(79.68％、87.19％),差异有统计学意义(P均＜ 0.05),饮酒者与无烟酒嗜好者相比,各评价指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 在不同浓度砷暴露的情况下,吸烟饮酒人群对砷的甲基化能力低于非吸烟饮酒人群.