鼠疫菌6 kb质粒核酸序列同源性比对分析

目的 分析云南省鼠疫菌6 kb(pYC)质粒核酸序列与GenBank中公开报道的多种细菌序列的同源性.方法 通过美国国立图书馆网站序列比对搜索工具(BLAST),对鼠疫菌pYC质粒全序列和开放式读码框架(ORFs)以及翻译蛋白进行核酸与核酸、蛋白与蛋白比对分析.结果 pYC质粒部分基因与宋内志贺菌质粒pKYM具有97.1%的同源性,与流感嗜血杆菌基因有92.1%的同源性,与伤寒沙门杆菌基因LT2和pIMVS1分别具有88.2%和87.2%的同源性,与大肠埃希菌0157:H7、K-12、ECOR31株局部基因分别具有81.4%、81.4%和84.7%的同源性.pYC质粒ORFs翻译蛋白ORF1与副鸡嗜血菌复制蛋白B具有47.2%的相似性,ORF4与大肠埃希菌推定蛋白具有52.7%的相似性,ORF5与假结核菌TriE蛋白具有48.3%的相似性,ORF6与大肠埃希菌PilxS/VirB5相似蛋白具有42.3%的相似性、与小肠结肠炎耶尔森菌TriD蛋白具有38.5%的相似性,ORFIO与伤寒沙门杆菌LT2细胞质蛋白具有83.1%的相似性.与大肠埃希菌0157:H7推定蛋白具有81.9%的相似性.ORF11与大肠埃希菌K12诱导损伤蛋白J具有81.4%的相似性.结论 pYC质粒DNA序列与肠杆菌科部分基因具有高度同源性,可能编码类似埃希菌属和耶尔森菌属推定蛋白、诱导损伤蛋白、TriD和TriE蛋白、Pilx5/VirB5相似蛋白.     

青藏铁路沿线鼠疫菌质粒的研究

目的 检测青藏铁路沿线鼠疫菌携带的质粒种类及相对分子质量.方法 采用碱裂解,酚一氯仿抽提法提取鼠疫菌质粒,经琼脂糖凝胶电泳进行检测并分析质粒的相对分子质量.结果 所检测的18株鼠疫菌具有6×106,45×106,52×106,65×106,92×106质粒,其中大质粒的变化范围在52×106～92×106.结论 青藏铁路沿线鼠疫菌除具有规范的质粒图谱外,鼠疫菌最大质粒的变化有一定的规律性,具有分类属性,对研究鼠疫自然疫源地空间结构和鼠疫菌的遗传学特性具有重要意义.     

应用标识基因检测鼠疫菌的研究

英国Sanger研究中心、美国Wisconsin大学和我国分别于2001,2002和2004年完成了鼠疫耶尔森氏菌CO92,KIM,91001的全基因组序列测定工作[1～3],这有助于研究鼠疫菌的进化过程,为寻找新的检测手段提供了便利研究条件.聚合酶链反应(PCR)自1985年发明至今,经过不断开发和改进,现已经广泛应用在诸多领域,是分子生物学、临床诊断、法医检验实验室的常规技术.我们采用我国91001菌株序列上YPO2088标识基因(编码甲基化转移酶)[4],对150份样本进行PCR扩增,现将结果报道如下.     

鼠疫耶尔森氏菌质粒提取方法的改进

大多数鼠疫耶尔林菌均含有三种质粒，分子量分别为６５，４５和６Ｍｄａｌ。其中两种属大质粒，分离提取较困难。本实验在参照Ｃａｓｓｅ法基础上对质粒提取中诸多影响因素逐一进行测试比较，选择出质粒提以的最适条件：细菌培养于２８℃，１８－２２小时，菌液浓度为２００ｍｇ／ｍｌ，溶菌液ＳＤＳ终浓度２％，每１０ｍｌ溶菌液加０．１ＮＮａＯＨ１．３５ｍｌ，４５℃温育３０－４０分钟。建立了一种简便，快速且重复性较高的提取     

鼠疫耶尔森菌特异基因扩增引物应用于鼠疫菌的鉴定研究

目的研究一种快速鉴定鼠疫菌的PCR方法。方法选用针对鼠疫菌特异序列的6对引物进行PCR扩增,以其它近缘的肠道致病菌做对照,并测序比较鉴定。结果鼠疫菌均能扩出预期产物,而其他近缘的肠道致病菌菌株均不能扩出预期产物。结论这些引物具有较高的特异性,可迅速、有效地鉴定鼠疫菌,并与其它近缘的肠道致病菌相鉴别。     

青海省三江源地区3种生态型鼠疫耶尔森菌的基因多态性比较

目的 对青海省三江源地区及其毗邻的四川省石渠县分离的34株3种生态型(青海田鼠型、祁连山型、青藏高原型)鼠疫耶尔森菌进行基因多态性分析,比较不同生态型鼠疫菌之间的关系.方法 用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术,对34株不同生态型鼠疫菌进行扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳检测.结果 扩增产物在凝胶电泳上显示的条带,除3株菌不同外,其余31株菌无差异.结论 三江源地区青海田鼠型、祁连山型、青藏高原型鼠疫菌在遗传学上属于同源.     

云南西南部的鼠疫流行及鼠疫菌质粒DNA特征

近两年,云南西南部鼠疫动物病几度复燃,流行迅猛并波及人间。从1990年至1993年7月,先后有8个县发生12起鼠疫流行。本文检查了分离自这些地区的全部鼠疫菌株的质粒DNA特征,并与西部德宏地区家鼠鼠疫菌株的质粒DNA进行比较,结合鼠疫流行史和近年流行情况,探讨了鼠疫菌质粒DNA特征在流行病学上的意义。     

鼠疫菌fra基因探针的研究

利用ＰＣＲ的方法，由鼠疫菌的ＤＮＡ中扩增获得了单一的，长２４９ｂｐ的基因片段。这一反应的特异性良好，可以作为鼠疫菌的一种鉴定标志。将这一片段地高辛标记制成探针，与国外已经试用过的，来自９．５ｋｂ质粒的９００ｂｐ探针相比较，表明该探针的特异性优良，可用于鼠疫的监测与对鼠疫菌分子生物学的进一步研究。     

鼠疫耶尔森菌基因组中IS100插入位点的特异性分析

目的 通过鼠疫耶尔森菌基因组中插入序列IS100位点的特异性研究,对我国鼠疫菌基因组的构成类型和特点进行分析.方法 以鼠疫菌东方变种CO92全长序列为参考,选择5个位置的IS100位点,在IS100基因相邻两外侧设计1对引物,在IS100基冈内设汁1对向外引物使其分别能够与两外侧引物扩增.对来自13个生态型的91株鼠疫菌和1株假结核耶尔森菌进行PCR扩增,产物进行克隆测序分析,同时把各菌株的IS100位点情况标记在我国鼠疫疫源地类型慨图上二进行分析.结果 实验所用91株鼠疫菌在所选定IS100位点出现含有和不含IS100的插入序列,基因片段组成相对CO92序列已发生改变,而且这些IS100基因型的组成在我国鼠疫自然疫源地中呈现区域性分布.结论 IS100基因型别分布与我国鼠疫菌疫源地分型分布基本一致,并直接反映了鼠疫菌基因组某特定位点的基因组成状况及其在进化过程中的高度流动性.     

我国鼠疫菌pYC质粒PCR检测分析

目的分析全国其他类型鼠疫菌是否存在pYC质粒。方法设计yd1和yd2两对引物通过PCR 进行检查。结果共检查全国11块疫源地18个生态型鼠疫菌802份DNA,其中云南6份、广西5份、贵州6 份扩增阳性,云南另外的163份和全国其他菌株扩增结果均为阴性。结论 yd1和yd2基因仅存在于贵州、广西的菌株和云南的部分菌株中,可作为具有pYC质粒鼠疫菌的PCR诊断和标识基因;全国其他类型鼠疫菌无 6×103(pYC)新质粒。     

荧光定量PCR快速检测鼠疫耶尔森氏菌的实验研究

目的　利用LightCycler建立一种简便、特异的荧光定量PCR检测方法 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速检测。 方法　采用SYBRGreenI随机掺入法 ,以Roche试剂盒为标准 ,比较两公司的DNA聚合酶 ,用鼠疫菌 310 0 4建立荧光PCR反应体系 ;针对鼠疫耶尔森氏菌特异的染色体标识序列和质粒上F1抗原基因设计引物 ,检测其灵敏度和特异性 ,以盲测试验进行验证 ;在此基础上鉴定 2 75株鼠疫耶尔森氏菌 ,并测试该法检测脏器污染模拟标本的灵敏度。结果　建立以一个公司试剂为主较低成本的PCR反应体系 ;EV76的检测灵敏度可达每反应体系 1.6个菌 ;检测我国 18个生态型共计 2 75株鼠疫耶尔森氏菌及 2 8株非鼠疫菌株的PCR扩增结果表明 ,鼠疫菌株均出现特异的扩增结果 ,2 8株对照菌株均为阴性 ;肝、脾、肺模拟标本检测灵敏度可达每反应体系 4 0 0 0个菌。结论　该方法对于检测鼠疫耶尔森氏菌具有简便、快捷、高敏感性和特异性的特点 ,适用于鼠疫紧急疫情时的快速诊断和疫源地监测     

宁夏鼠疫菌质粒生物学特征研究

目的 研究宁夏126株鼠疫菌的质粒、毒力决定因子与毒力的关系，预测动物鼠疫的流行。方法 质粒凝胶电泳、毒力因子测定和半数致死量(LD50)试验。结果 被试菌株多数含有6，13，45，65MD质粒，具有4种毒力因子；在流行末期分离的菌株毒力较弱。结论 质粒分析可用于鼠疫菌的鉴别诊断。     

几种鼠疫菌培养基的筛选试验

比较了鼠疫菌在胰酶消化液琼脂培养基、市售普通营养琼脂培养基和以胰蛋白Ｓｉ为主要万分自制的５种培养基上的生长情况。结果显示,鼠疫菌在上述７种培养基上均生长良好,可培养出具有鼠疫菌特点的典型菌落,其中营养琼脂培养基和胰蛋白Ｓｉ（２、３号）培养基操作简便、经济,便于基层使用和实验条件的质量控制。     

鼠疫菌6MD质粒在假结核菌中的表达及其对假结核菌毒力的影响

使用电穿孔转化技术,将鼠疫耶尔森氏菌所携带的6MD 质粒转移到假结核耶尔森氏菌中,获得了杂交菌株。该杂交菌株能够表达鼠疫菌素Ⅰ及凝固酶,但其毒力却仍与作为受体的假结核菌株类似,而没有向鼠疫菌的毒力水平接近。本文对这种现象的可能原因进行了分析。     

广西鼠疫耶尔森菌质粒图谱及分子流行病学意义

目的分析广西鼠疫耶尔森菌株质粒DNA种类,从分子水平探讨其流行病学意义。方法采用Kado改良法提取质粒,经琼脂糖凝胶电泳。结果从广西鼠疫自然疫源地分离到31株鼠疫耶尔森菌含有pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT1和尚未明确其类型的111.36×106(相对分子质量,Mr)5种质粒。其中有29株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT14种质粒组成,1株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、111.36×106(Mr)4种质粒组成,另一株由pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD13种质粒组成。结论广西鼠疫耶尔森菌株含有pYC、pPst/pPCP1、pYV/pCD1、pFra/pMT1和尚未定型的111.36×106(Mr)5种质粒,与云南省南部、东南部和贵州省鼠疫耶尔森菌株的质粒图谱相同。     

中国鼠疫菌随机引物扩增多态性指纹图谱

目的 对中国不同鼠疫自然疫源地鼠疫菌染色体的分析和比较发现其近缘关系进而从分子水平进行分型。方法 用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术。结果 第1条引物将中国的鼠疫菌分为11个类型，每个类型都有一定的条带规律和地理分布范围。第2条引物将我国的鼠疫菌分为5个类型。结论 随机扩增多态性DNA(RAPD)可以从分子水平用于我国鼠疫菌的分型。     

我国鼠疫菌抗链霉素基因的监测

目的了解全国鼠疫菌分离株是否存在抗链霉素基因。方法根据Guiyoule等人在EMBL公布的抗链霉素相关基因,设计2对引物,对271株代表性鼠疫菌进行PCR扩增。结果实验用271株代表性菌株中尚未发现有鼠疫菌抗链霉素基因。结论目前在所实验的271株菌株还未发现鼠疫菌耐链霉素菌株。     

中国鼠疫菌含有的最大—一类质粒的变异及地理分布

绝大多数鼠疫耶尔森菌都含有三种质粒,其分子量为6Mdal、45Mdal 和 65Mdal。鼠疫耶尔森菌含有的最大一类质粒的变异很大。多数学者报道鼠疫耶尔森菌所含大质粒的分子量为65Mdal;苏联学者(1983年)报道了苏联鼠疫自然疫源地的     

鼠疫诊断芯片的探针制备

目的 探索制备鼠疫诊断芯片特异性探针的新方法。方法 直接采用限制性核酸内切酶Sau3A Ⅰ消化鼠疫耶尔森菌3个致病性质粒，克隆在T载体上，再经巢式PCR扩增制备成打印芯片的探针。结果 该法收集到250条探针用于打印芯片。分别与鼠疫耶尔森菌，同属的假结核耶尔森菌和小肠结肠炎耶尔森菌杂交，可筛选出杂交信号强阳性的特异点阵。结论 该法简便可行，适于制备鼠疫诊断芯片的探针。