脑膜瘤端粒酶活性检测及其RNA和hTERT的表达

目的研究脑膜瘤的端粒酶活性及其RNA和人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达,为临床诊断和治疗开拓新思路.方法改良TRAP法及RT-PCR检测40例脑膜瘤的端粒酶活性及其RNA和hTERT表达.结果脑膜瘤端粒酶阳性率为42.5%,hTERT阳性率52.5%,两者都随肿瘤恶性度增加而升高;人端粒酶RNA(hTR)广泛存在于脑膜瘤和正常脑组织中.结论端粒酶活性及hTERT和脑膜瘤恶性程度有关,有助于临床诊断,可能成为新治疗靶点;hTERT是端粒酶活性调节的关键.     

hTERT反义cDNA对人脑胶质瘤细胞的抑制作用

目的探讨人端粒酶催化亚基(hTERT)反义cDNA(pAdeasy-hTERT)在体外对胶质瘤细胞生长的抑制作用。方法将腺病毒介导的pAdeasy-hTERT作用于人胶质瘤细胞系U251,用MTT法检测细胞存活率、端粒酶重复序列扩增法测定端粒酶活性、Westem杂交鉴定hTERT蛋白的表达、RT-PCR法检测hTERT cDNA水平、PCNA观察肿瘤细胞的凋亡情况以及用流式细胞仪对转染后肿瘤细胞的周期进行分析。结果pAdeasy-hTERT在体外明显抑制肿瘤细胞生长,降低端粒酶活性,抑制hTERT表达。结论pAdeasy-hTERT显著抑制人胶质瘤细胞生长,可成为恶性胶质瘤基因治疗的靶基因。     

脑胶质瘤端粒酶活性的表达及端粒长度的分析

目的　研究分析在不同级别脑胶质瘤细胞端粒酶活性的表达及端粒长度的变化。方法　采集 40例脑胶质瘤手术切除标本、 4例正常脑组织 ,通过半定量端粒重复序列扩增 (telomererepeatamplificationprotocol,TRAP) 银染方法检测端粒酶活性水平 ,应用人的端粒序列特异性探针32 P (CCC TAA) 3 进行Southern杂交检测脑胶质瘤细胞的端粒长度。结果　在 40例胶质瘤标本中的 33例(82 5 % )中均检出端粒酶活性 ,而在正常脑组织中无端粒酶活性的表达 ,不同级别胶质瘤之间端粒酶活性水平有明显差异 ;恶性胶质瘤细胞中端粒的长度明显比正常胶质细胞缩短 ,端粒的长度与端粒酶活性的水平有着显著的的负相关。结论　端粒酶活性可以作为脑胶质瘤的恶性标记之一 ,端粒的缩短可能是脑胶质瘤进展的重要因素 ,端粒的修复机制对于维持端粒的稳定性和肿瘤细胞的增殖潜能具有十分重要的意义     

脑胶质瘤中P33ING1的表达及临床意义

目的 检测脑胶质瘤中P33ING1的基因和蛋白表达,探讨其在胶质瘤发生、发展中的作用及临床意义.方法 选取行脑胶质瘤手术切除的新鲜胶质瘤标本50例,分别应用RT-PCR方法和S-P免疫组织化学方法检测P33ING1在瘤组织及正常脑组织中的表达.实验数据用SPSS11.5软件包进行统计.结果 50例胶质瘤中P33ING1 mRNA和蛋白的阳性表达率均为90%(45/50),正常脑组织中全部表达阳性(100%).P33ING1蛋白表达的LI值与P33ING1mRNA表达的RI值呈显著正相关(r=0.8841,P＜0.01).随着肿瘤级别的升高基因与蛋白水平的表达均随之减少(P＜0.01).结论 抑癌基因P33ING1异常表达与其恶性程度密切相关.检测其表达水平的变化对胶质瘤的早期诊断、基因介导治疗及判断预后方面均有重要指导意义.     

脑胶质瘤端粒酶活笥的表达及端粒长度的分析

目的 研究分析在不同级别脑胶质瘤细胞端粒酶活性的表达及端粒长度的变化。方法 采集４０例脑胶质瘤手术切除标本、４例正常脑组织,通过半定量端粒重复序列扩增（ｔｅｌｏｍｅｒｅ ｒｅｐｅａｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ,ＴＲＡＰ）－银染方法检测端粒酶活性水平,应用人的端粒序列特异性探针＾３２Ｐ－（ＣＣＣ－ＴＡＡ）３进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测脑胶质瘤细胞的端粒长度。结果 在４０例胶质瘤标     

腺病毒介导的p16基因对TJ899细胞系活性的影响

目的研究五型腺病毒载体(Ad5)携带p16基因对恶性脑胶质瘤细胞系TJ899生长状态的影响.方法免疫组化(SP法)测定p16蛋白表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和克隆形成实验测定恶性脑胶质瘤细胞系生长状态.结果重组体腺病毒能介导p16外源基因在恶性脑胶质瘤细胞系TJ899细胞中阳性表达,6 d时肿瘤细胞生长抑制率为93%,并且能显著地抑制肿瘤细胞的克隆形成能力.结论腺病毒介导p16基因能在肿瘤细胞中表达,并能明显抑制肿瘤细胞生长的状态.     

三氧化二砷对人胶质瘤U251细胞生长及端粒酶活性的影响

目的探讨三氧化二砷（As2O3）对人胶质瘤U251细胞的生长及端粒酶活性的影响。方法采用倒置显微镜和透射电镜观察As2O3处理后U251细胞形态变化;四甲基偶氮唑蓝比色法观察As2O3对U251细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;端粒重序列扩增酶联免疫吸附实验（TRAP-ELISA）结合聚丙烯酰胺凝胶电泳（TRAP-PAGE）银染法检测As2O3处理后U251细胞端粒酶活性变化。结果倒置显微镜下观察到：As2O3处理后的U251细胞逐渐变圆、脱壁,细胞间接触变松,细胞质中颗粒增多,增殖变慢,细胞周围碎片增多;透射电镜下见较多典型凋亡细胞。1～8μmol/LAs2O3明显抑制U251细胞增殖,诱导其凋亡;并使端粒酶活性逐渐下降,该作用呈浓度和时间依赖性。结论 As2O3对人胶质瘤U251细胞株生长具有显著抑制作用,其机制可能与As2O3能够抑制U251细胞的端粒酶活性密切相关。     

HIF-1α和hTERT shRNA双基因抑制脑胶质瘤生长的实验研究

目的 研究靶向缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)的短发夹RNA(shRNA),对裸鼠皮下人脑胶质瘤中HIF-1α、hTERT基因表达的抑制作用,及其对肿瘤增殖和细胞凋亡的影响.方法 体外培养人脑胶质瘤U251细胞;建立人脑胶质瘤裸鼠皮下接种模型;将HIF-1α shRNA、hTERT shRNA质粒转染入移植瘤中,观察肿瘤生长情况;HE染色法观察肿瘤组织的病理改变;Western blot检测HIF-1α、hTERT蛋白表达;Annexin V+PI双染流式细胞仪检测凋亡情况.结果 成功建立稳定的裸鼠U251皮下移植瘤模型;治疗5周后HIF-1α shRNA、hTERT shRNA组双基因干扰组肿瘤体积较单基因干扰组及对照组明显减小,抑瘤率为84.2%;病理结果显示双基因干扰组肿瘤生长受到抑制,微血管散在稀疏,大量肿瘤细胞坏死及凋亡;Western blot显示治疗组相应蛋白表达受抑制,双基因干扰组影响二者表达;流式细胞仪检测双基因干扰组肿瘤细胞凋亡率明显高于其他组(P＜0.01).结论 HIF-1α shRNA和hTERT shRNA均可在裸鼠移植瘤体内抑制相应蛋白表达及胶质瘤增殖生长,促进细胞凋亡,而双基因干扰作用更强.     

逆转录酶抑制剂AZT对胶质瘤干细胞端粒酶活性和细胞增殖的影响

目的 探讨逆转录酶抑制剂3-叠氮-3-脱氧胸腺核苷(AZT)对脑胶质瘤干细胞增殖的影响及相关机制.方法 原代分离培养脑胶质瘤干细胞和脑胶质瘤细胞并鉴定,两种细胞同时设立为实验组(0.125 mot/L、0.250 mol/L、0.500 mol/L AZT)和对照组.MTT法检测AZT对两种细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的改变;端粒重复序列扩增技术-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性的变化.结果 AZT对两组细胞的生长抑制呈浓度-时间依赖性(均P<0.05),在同一浓度和时间点,AZT对脑胶质瘤干细胞的生长抑制作用弱于脑胶质瘤细胞(均P<0.05).0.250 mol/L、0.500 mol/L AZT作用72 h后,脑胶质瘤干细胞的凋亡率分别为(4.21±1.53)%、(10.60±0.38)%,而脑胶质瘤细胞的凋亡率分别为(6.75±1.25)%,(14.30±2,59)%,明显高于胶质瘤干细胞(均P<0.05).AZT对两组细胞端粒酶活性的抑制呈浓度-时间依赖性(均P<0.05),且在同一浓度和时间点对脑胶质瘤细胞的作用明显强于脑胶质瘤干细胞(均P<0.05).结论 逆转录酶抑制剂AZT对脑胶质瘤干细胞和脑胶质瘤细胞均有明显的生长抑制作用,可能机制是通过抑制端粒酶活性、调控细胞周期和诱导细胞凋亡实现.脑胶质瘤干细胞的耐药性强于胶质瘤细胞,其机制有待进一步研究.     

端粒酶基因hTERT在脑胶质瘤的表达及与肿瘤增殖相关性的研究

目的研究人类端粒酶催化亚单位(hTERT)mRNA在胶质瘤的表达情况,探讨hTERT基因表达与胶质瘤增殖的关系.方法应用原位杂交方法检测45例胶质瘤标本、8例正常脑组织标本中hTERTmRNA的表达,采用免疫组织化学法测定增殖指数(PCNA LI).结果hTERTmRNA总的阳性表达率为60.0%(27/45例),低度恶性组为31.3%(5/16例),高度恶性组为75.9%(22/29例);8例正常脑组织均为阴性.高度恶性组与低度恶性组、正常组间相比较均有显著性差异(P＜0.05)hTERT阴性组PCNA LI均低于hTERT阳性组,胶质瘤hTERT mRNA表达率与肿瘤增殖指数呈正相关(r=0.727,P＜0.05).结论端粒酶hTERT在正常脑组织中未见表达,而在胶质瘤标本呈不同程度的表达,阳性表达率与肿瘤病理分级呈正相关,与肿瘤增殖程度一致.表明端粒酶hTERT的激活可能发生在胶质瘤的癌变过程中,并起关键性作用,有可能成为靶向基因治疗的候选基因.     

人脑胶质瘤WAF1／CIP1表达的研究

目的检测抑癌基因ＷＡＦ１／ＣＩＰ１在人脑胶质瘤中的表达。方法取４６例胶质瘤组织及１２例脑外伤组织，提取其ｍＲＮＡ，用ＷＡＦ１／ＣＩＰ１作为模板进行逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）。结果４６例胶质瘤中有１４例有ＷＡＦ１／ＣＩＰ１蛋白表达（１４／４６），表达率为３０．４％，１２例脑外伤标本全部表达（１２／１２），表达率为１００％，两组比较有显著差异（Ｐ＜０．０１）。结论ＷＡＦ１／ＣＩＰ１的缺失是脑胶质瘤发生及进展的原因之一。     

Mdm2反义脱氧寡核苷酸抗胶质瘤的机理研究

目的探讨Mdm2反义寡核苷酸(ASODNs)对U251人胶质瘤细胞株的抗肿瘤作用。方法以Lipofectamine介导的Mdm2 ASODNs转染U251细胞,用RT-PCR检测Mdm2 mRNA的改变,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot检测野生型p53(wild type p53,wtp53)的表达,研究其抗肿瘤作用。结果Mdm2 ASODNs以不同浓度转染U251细胞后,Mdm2表达减少,细胞增殖抑制程度升高,细胞周期分析显示S期细胞下降,TUNEL法染色观察到明显的凋亡细胞。Western blot检测野生型p53的表达增加。结论Mdm2 ASODNs可提高野生型p53的表达,从而抑制U251细胞增殖,引起细胞周期停滞和诱导凋亡,该作用具有浓度依赖性。     

胶质瘤组织miR-3653的表达及miR-3653对胶质瘤TG905细胞侵袭、迁移的影响

目的 探讨胶质瘤组织miR-3653表达变化及miR-3653对人胶质瘤TG905细胞侵袭和迁移的影响及其分子机制.方法 收集2017年1月至2019年3月手术切除胶质瘤组织和瘤旁脑组织各25例.体外培养TG905细胞,过表达组转染MiR-3653 mimic质粒,过表达对照组转染NC-MiR-3653 mimic质粒...     

ICAM-1、MMP-9在人脑胶质瘤的表达及相关性研究

目的 探讨细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在人脑胶质瘤的表达及相关性研究。方法 采用免疫组织化学法检测82例胶质瘤组织中ICAM-1、MMP-9的表达水平。结果 ICAM-1在82例人脑胶质瘤蜡块组织中全部呈阳性表达，72例MMP-9呈阳性表达，阳性率87，80％，实验对照为脑外伤手术减压的脑组织11例未见ICAM-1、MMP-9表达。ICAM-1、MMP-9阳性表达水平在胶质瘤高度恶性组高于低度恶性组，差别有显著性意义（P＜0．01）。ICAM-1和MMP-9在人脑胶质瘤的表达存在相关性（r=0．436）。结论 ICAM-1和MMP-9在胶质瘤存在协同作用，共同参与胶质瘤的发生、发展和恶性演变，并由此推测ICAM-1与MMP-9联合检测会更好地对脑胶质瘤的恶性生物学行为进行评价和判断。     

表达VASH1基因的人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物敏感性的变化

目的 探讨表达人血管生成抑制因子１（VASH1）的人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物的敏感性变化。方法 构建针对VASH1的慢病毒载体pGCL-GFP-VASH1,经测序鉴定后转染293T细胞,筛选出适合浓度的慢病毒转染人脑胶质瘤U-87MG细胞,荧光显微镜下检测转染效率;通过RT-PCR和Western blot分析U-87MG细胞VASH1 mRNA和蛋白表达水平;用CCK-8法检测U-87MG细胞在化疗药物顺铂和替莫唑胺作用下的存活率。流式细胞仪检测U-87MG细胞凋亡。结果 成功构建pGCL-GFP-VASH1慢病毒载体,并成功转染U-87MG细胞,转染率达70％以上;RT-PCR和Western blot结果证实转染VASH1慢病毒载体的U-87MG细胞表达VASH1 mRNA和蛋白。在顺铂或替莫唑胺作用下,表达VASH1的U-87MG细胞存活率均较未表达VASH1的U-87MG细胞明显降低（P<0.01）,而且U-87MG细胞凋亡率明显增加（P<0.01）。结论 VASH1慢病毒载体转染U-87MG细胞可使其稳定表达VASH1,并提高人脑胶质瘤U-87MG细胞对化疗药物敏感性、增加细胞凋亡率。     

Activation-dependent surface expression of gC1qR/p33 on human blood platelets

GC1qR/p33 (gC1qR) is expressed by a variety of somatic and cultured cells, including blood platelets. It interacts with several cellular, viral, bacterial, and plasma proteins, suggesting a potential role in thrombosis, inflammation, and infection. Considerable controversy has surrounded the surface membrane localization of gC1qR, however, since its cDNA sequence does not predict a traditional membrane-anchoring domain, and bears a typical mitochondrial targeting sequence. The present study examined gC1qR expression on resting and activated human blood platelets using flow cytometry and confocal microscopy with two monoclonal antibodies, 74.5.2 and 60.11, directed against gC1qR C-terminal amino acids 204-218, and N-terminal amino acids 76-93, respectively. Unstimulated platelets reacted minimally with either antibody. In contrast, platelet activation with TRAP, epinephrine, or ADP produced markedly increased gC1qR expression as reflected by 74.5.2 binding but not 60.11 binding. Platelet activation was verified using PAC-1 and anti CD 62 antibodies. Whereas PAC-1 binding to activated platelets could be reversed following platelet incubation with PGE1, 74.5.2 binding remained unchanged, suggesting the sustained expression of gC1qR following platelet stimulation. The data further demonstrate that detection of cell surface gC1qR may be dependent on antibody specificity. The ability of gC1qR to bind proteins involved in complement, coagulation, and kinin systems, as well as viral and bacterial pathogens including S. aureus protein A, supports the hypothesis that gC1qR expressed on activated platelets may contribute directly to thrombosis, inflammation, and endovascular infections.     

hTERT正、反义表达载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究提高和阻断端粒酶活性对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及分化的影响。方法采用直接贴壁法分离、培养SD大鼠BMSCs,流式细胞仪检测BMSCs表面标记。阳离子脂质体介导hTERT正、反义表达载体转染BMSCs,RT-PCR和免疫组化方法检测TERT表达,并对转染前后BMSCs的生长增殖能力、神经细胞方向的分化能力和大鼠颅内移植存活情况进行研究。结果大鼠BMSCs表面CD29、CD44、CD90阳性,CD31、CD34、CD45阴性,转染正义hTERT后BMSCs增殖速度明显提高,而其向神经元和星形胶质细胞诱导分化及异体海马移植后的存活能力未受影响,转染反义hTERT后BMSCs增殖速度减慢,5￣6周内死亡。结论BMSCs存在端粒酶低表达,提高或阻断端粒酶活性对BMSCs的增殖分别起到促进或抑制作用。