缺失IFN-γ受体基因的天坛株减毒重组痘苗病毒载体的构建

目的 构建缺失WN-7受体基因的天坛株重组痘苗病毒载体，初步研究其毒力的改变及B8R缺失区插入外源基因表达的稳定性。为研制表达多价抗原重组痘苗病毒载体、提高痘苗病毒载体安全性进行探索。方法 采用PCR技术、多步克隆构建带有天坛株痘苗病毒B8R基因外左右侧同源臂、痘苗病毒启动子序列pE/L、p7．5及下游LacZ序列的转移质粒pSKB8R、pSKB8RLacZ。将痘苗病毒VTT与转移质粒pSKB8RLacZ共转染CEF细胞进行同源重组，经蓝白斑筛选、连续单斑纯化、鉴定获得B8R基因(IFN-7受体基因同源序列)缺失为LacZ所取代的重组病毒vIT△B8RLaeZ。结果经酶切、测序鉴定转移质粒构建正确，核酸水平、外源基因生物学活性检测表明VIT△B8RLacZ在CEF细胞连续培养传代中B8R基因的缺失和插入外源基因LacZ表达均很稳定。VTTΔB8RLacZ在细胞中的繁殖复制水平与VTT相当。兔皮内毒力实验表明B8R基因缺失显著降低VTT的毒力。结论 本研究表明B8R基因缺失可显著降低痘苗病毒天坛株的毒力并可作为外源基因的插入区，缺失B8R基因的重组痘苗病毒可能作为新一代的表达多价抗原痘苗病毒载体。     

痘苗病毒天坛株基因组病毒生长因子基因结构的研究

克隆了位于我国痘苗病毒天坛株基因组左端的病毒生长因子（ＶＧＦ）基因并对其编码多肽的结构特点进行了分析。结果表明，由天坛株ＶＧＦ基因所推导的氨基酸序列具有典型的上皮生长因子（ＥＧＦ）超家族成员的特征序列和结构特点，在核苷酸及氨基酸水平上天坛株ＶＧＦ与其他正痘病毒ＶＧＦ的同源性在８５％～９５％之间，氨基酸残基的缺失和插入等变异主要集中出现在多肽的信号肽和穿膜区，推测对功能的影响不大。此外，我们发现由天坛株基因组右末端的开放读码框架（ＯＲＦ）ＴＢ２２Ｌ推导的氨基酸序列与天坛株ＶＧＦ多肽第６７位至１４０位完全相同，提示ＯＲＦＴＢ２２Ｌ可能是天坛株基因组第二个ＶＧＦ基因的变异产物。     

狂犬病毒糖蛋白及核蛋白在非复制型痘苗病毒天坛株中的共同表达

目的　提高重组痘苗病毒狂犬疫苗的有效性和安全性。方法　利用TK区表达狂犬病毒糖蛋白 (RG)的重组痘苗病毒作为亲本株 ,通过两步同源重组 ,删除痘苗病毒基因组CK片段间与毒力和宿主范围相关的核酸片段 ,同时将狂犬病毒核蛋白 (RN)基因插入C K片段之间 ,获得了含有RG基因和RN基因的非复制型重组痘苗病毒VTKRGΔCKLacZRN。结果　经PCR鉴定 ,RN基因已插入CK区 ;Westernblot结果显示 ,该株病毒能同时表达RG和RN ,相对分子质量 (Mr)分别为 6 5× 10 3 和 5 0 5× 10 3。VTKRGΔCKLacZRN在人源细胞如TK 143细胞中不能正常繁殖 ,在鸡胚成纤维细胞 (CEF)中能正常复制。与非复制型重组病毒VTKRGΔCK相比 ,VTKRGΔCKLacZRN免疫小鼠后能更快地诱生较高滴度的中和抗体 ,效果相当于复制型重组病毒VTKRG免疫组 ;它们均能保护小鼠针对致死剂量狂犬病毒国际标准攻击毒株 (CVS)的攻击。结论　VTKRGΔCKLacZRN具有良好的免疫效果和安全性     

痘苗病毒天坛株编码Serpin Ⅱ 分子功能区抑制细胞调亡的研究

痘苗病毒天坛株编码ＳｅｒｐｉｎⅡ分子功能区抑制细胞调亡的研究候永浩金奇侯云德本研究受国家８６３高技术研究计划领域基金资助作者单位：１０００５２北京中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室１９９７年１１月３日收稿１２月１２日修回痘苗病毒...     

痘苗病毒A47L缺失对细胞免疫反应的影响

目的 以去除A47L表位的痘苗病毒为载体,导入外源基因OVA,研究去除A47L后对细胞免疫和免疫记忆效应的影响,以期通过去除痘苗病毒载体中对外源抗原的免疫性具有显著抑制作用的表位,提高疫苗的有效性.方法 将扩增的OVA基因导入pSC11穿梭质粒,在CV-1细胞中与去除A47L的痘苗病毒重组,通过多轮筛选纯化获得重组病毒...     

应用痘苗病毒载体表达的重组甲肝抗原特性的研究

目的 探讨以痘苗病毒载体表达的甲肝病毒培养合适的细胞系和重组病毒灭活以及甲肝病毒抗原保存条件.方法 将构建成功的表达甲肝抗原的重组痘苗病毒分别接种于K4、143、HEL、Hep-2和Vero等细胞,用ELISA测定重组甲肝抗原的表达产量和不同方法灭活重组病毒后的抗原活性.结果 在K4、143和HEL细胞表达重组甲肝抗原的产量略优于Hep-2和Vero细胞,重组病毒经β-丙内酯和甲醛灭活后,甲肝抗原活性不变,制备的重组甲肝抗原稳定性好.结论 痘苗病毒表达载体可以提高甲肝抗原表达效率,具有十分广阔的应用前景.     

应用痘苗病毒载体表达的重组甲肝抗原特性的研究

目的 探讨以痘苗病毒载体表达的甲肝病毒培养合适的细胞系和重组病毒灭活以及甲肝病毒抗原保存条件.方法 将构建成功的表达甲肝抗原的重组痘苗病毒分别接种于K4、143、HEL、Hep-2和Vero等细胞,用ELISA测定重组甲肝抗原的表达产量和不同方法灭活重组病毒后的抗原活性.结果 在K4、143和HEL细胞表达重组甲肝抗原的产量略优于Hep-2和Vero细胞,重组病毒经β-丙内酯和甲醛灭活后,甲肝抗原活性不变,制备的重组甲肝抗原稳定性好.结论 痘苗病毒表达载体可以提高甲肝抗原表达效率,具有十分广阔的应用前景.     

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶基因痘苗病毒表达载体的 …

应用反转录巢式ＰＣＲ扩增出丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶基因,并克隆到痘苗病毒表达载体ｐＳＣ６５中,载体上设计一测序引物,经序列测定证明,已将５４３个ｂｐ长的丝氨酸蛋白酶基因片段正确插入载体。此结果为丙型肝炎病毒ＮＳ３区丝氨酸蛋白酶基因在痘苗病毒中的表达,以及建立ＨＣＶ特异的ＣＴＬ靶细胞打下基础。     

构建以痘苗病毒为载体的人用狂犬病基因工程疫苗株的研究

构建了一个可以适于人用的表达狂犬病病毒糖蛋白的重组痘菌病毒疫苗株。构建的方法是：先构建一个表达β－半乳糖苷酶基因（简称ｌａｃ基因）的不经传代细胞的重组痘苗病毒，以此为亲本株，再与载体ＰＴｋ１１ｋＲＧ（狂犬病病毒糖蛋白基因插在胸苷激酶Ｔｋ区，并置于痘苗病毒１１ｋ启动子下游，Ｔｋ侧冀序列和启动子均来自痘苗病毒天坛株），在鸡胚细胞中同源重组，以蓝色空斑中挑白斑的方法筛选阳性重组病毒，用免疫荧光方法和ＡＰＡＡＰ免疫酶法证明，该病毒能较好地表达狂犬病病毒糖蛋白。动物实验表明，该病毒能较好地诱导小鼠和狗的抗狂犬病毒的中和抗体，并对狂犬病病毒ＣＶＳ株和ＳＲＶ（街毒）的攻击有保护作用。     

狂犬病毒糖蛋白重组痘苗病毒生物学特性的研究

用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和免疫荧光法检定狂犬病毒糖蛋白重组痘苗病毒（简称重组病毒），证实狂犬病毒糖蛋白在痘苗病毒中得以表达，分子量为６４０００道尔顿。实验表明，重组病毒增殖力比亲本株降低５－１０倍，致细胞病变过程减缓，但增殖曲线和亲本株呈平行趋势，３天达到增殖高峰；重组病毒绝大部分在细胞内，仅不足１％释放到培养液中；在制备鸡胚细胞的同时接种重组病毒，３天收获，用超声波处理后，可提高病毒收获量，在最适条件下可达５ｘｌ０ｌｔｐＦＵ／Ｌ。并探讨重组病毒及其亲本株的蚀斑形成单位（ＰＦＵ）和血凝效价（ＨＡ）之间的相关关系。     

人禽流感病毒H5N1多价重组痘苗病毒(天坛株)疫苗在小鼠中的免疫原性研究

Objective To develop an effective and broad immune protective H5N1 vaccine.Methods We first developed two recombinant vaccinia ( Tiantan strain) virus ( rTTV ) based H5N1 vaccines, which consisted of bicistron expressing the hemagglutinin(HA) and matrix protein 2(M2), or bicistron expressing the neuraminidase(NA) and matrix protein 1 (M1). The expression of H5N1 protein in rTTVs was confirmed. We immunized the BALB/c mice twice with two kind of dose ( 104 PFU, 107 PFU)using different combination. Subsequently, we assessed the humoral and cellular immune response in vaccinated mice. Results Our data showed that rTTV-based H5N1 vaccine induced rapidly robust HA- and NAspecific antibody level and IFN-γ secreting form cell(SFC) with either single dose of 107 PFU or twice dose of 104 PFU or 107 PFU. We also detected significant neutralizing antibody and matrix-specific immune response. In addition, we found that immunization with two kind of rTTV-based H5N1 vaccines induced much high level of M2-specific antibody than that with single of rTTV-based H5N1 vaccine. Conclusion rTTVbased H5N1 vaccines in this study elicited board array of immunity and our study offers a promising alternative H5N1 vaccine candidates with favorable potential to prevent various H5N1 pandemic.     

人禽流感病毒H5N1多价重组痘苗病毒(天坛株)疫苗在小鼠中的免疫原性研究

Objective To develop an effective and broad immune protective H5N1 vaccine.Methods We first developed two recombinant vaccinia ( Tiantan strain) virus ( rTTV ) based H5N1 vaccines, which consisted of bicistron expressing the hemagglutinin(HA) and matrix protein 2(M2), or bicistron expressing the neuraminidase(NA) and matrix protein 1 (M1). The expression of H5N1 protein in rTTVs was confirmed. We immunized the BALB/c mice twice with two kind of dose ( 104 PFU, 107 PFU)using different combination. Subsequently, we assessed the humoral and cellular immune response in vaccinated mice. Results Our data showed that rTTV-based H5N1 vaccine induced rapidly robust HA- and NAspecific antibody level and IFN-γ secreting form cell(SFC) with either single dose of 107 PFU or twice dose of 104 PFU or 107 PFU. We also detected significant neutralizing antibody and matrix-specific immune response. In addition, we found that immunization with two kind of rTTV-based H5N1 vaccines induced much high level of M2-specific antibody than that with single of rTTV-based H5N1 vaccine. Conclusion rTTVbased H5N1 vaccines in this study elicited board array of immunity and our study offers a promising alternative H5N1 vaccine candidates with favorable potential to prevent various H5N1 pandemic.     

人禽流感病毒H5N1多价重组痘苗病毒(天坛株)疫苗在小鼠中的免疫原性研究

目的 研发高效广谱的人高致病性禽流感病毒H5N1实验疫苗.方法 首先构建了含H5N1(安徽株)结构基因[血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白M1与M2]的两个双顺反子(HAop/M2,NAop/M1)重组痘苗病毒(rTTV天坛株)疫苗,采用不同剂量(104 PFU或107PFU)或组合(疫苗单独或联合)方式于0、4周二次免疫BALB/c小鼠,初步比较分析抗原特异的体液(HA血凝抑制抗体、NA特异性抗体、中和抗体)与细胞免疫应答(IFN-γ ELISPOT)特点.结果 重组痘苗病毒疫苗可有效表达H5N1靶抗原;高剂量组的重组痘苗病毒疫苗可快速激发较强的针对各个抗原的抗体与针对血凝素与神经氨酸酶蛋白的细胞免疫应答,含血凝素蛋白的重组痘苗病毒疫苗亦可诱导明显的中和抗体;但各组重组痘苗病毒疫苗所激发的针对基质蛋白(M1,M2)的细胞免疫应答均较弱;两个双顺反子(HAop/M2,NAop/M1)重组痘苗病毒疫苗联合应用所激发的针对基质蛋白2(M2)的体液免疫应答明显强于单双顺反子(HAop/M2)疫苗单独应用.结论 本研究中制备的各组重组痘苗病毒疫苗可诱导多个抗原特异的体液与细胞免疫应答,该研究为新型H5N1疫苗的研发及免疫方案的优化奠定了基础.     

表达人癌胚抗原重组痘苗病毒免疫原性的研究

表达人癌胚抗原重组痘苗病毒免疫原性的研究杨洁罗超权伍新尧杨英浩癌胚抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ，简称ＣＥＡ）是一重要的肿瘤相关抗原，对很多肿瘤细胞在体外有免疫反应。在体内免疫原性很弱。很多实验证明，痘苗病毒的免疫原性很强，可增...     

一株西尼罗病毒株的生物学特征研究

目的对引进的西尼罗病毒(WNV)毒株的形态学、致病性、细胞敏感性、免疫原性等生物学性状进行探讨，为进一步开展WNV的相关研究奠定基础。方法选择Vero-E6与C6／36细胞观察WNV的细胞病变效应(CPE)，并制作电镜负染标本和组织切片标本进行病毒形态学鉴定；通过乳鼠脑内接种WNV确认其致病性；以灭活的感染乳鼠脑悬液免疫BALB／c小鼠，以间接免疫荧光试验(IFA)测定其血清WNV IgG抗体；用RT-PCR检测病毒核酸，扩增的核苷酸序列通过BLAST作同源性比较。结果WNV所致Vero-E6与C6／36细胞的CPE分别以细胞圆缩和融合为主要特征；电镜下所见病毒体为有包膜、直径约30～50nm的球形颗粒；脑内接种WNV可致全部乳鼠死亡；灭活病毒可诱导小鼠产生WNV抗体；经RT-PCR扩增，在WNV培养液及感染乳鼠脑组织中均检测到目的基因片段，且仅与WNV有较高的同源性(94％～100％)。结论本研究使用的WNV毒株可供进一步开展WNV的相关研究。