积雪草甙治疗小儿增生性瘢痕的疗效观察

[目的]研究积雪草甙治疗小儿增生性瘢痕的临床疗效.[方法]42例小儿增生性瘢痕患者口服积雪草甙片剂3.6 mg/kg/d,分3次服,同时外用霜剂,每天3次;对照组仅使用皮炎平软膏.观察各组病人的症状和体征变化,并观察其它的毒性及副作用.[结果]治疗组42例患者中,显效46例(54.5%),有效28例(33.3%),无效10(12.2%).而对照组患者中显效7例(15.2%),有效12例(26.1%),无效27例(58.7%).两组比较统计学处理有明显差异.两组副作用发生率均比较低,未发现明显毒性与副作用.[结论]积雪草甙有较好的治疗瘢痕增生的作用,是比较有效、安全、易为患者接受的药物.     

积雪草甙对人成纤维细胞增殖的影响

目的研究羟基积雪草甙(madecassoside,Md)对人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast,HSFb)的增殖的影响。方法XTT法研究Md对HSFb增殖的影响。结果1)Md在浓度高达200μg/ml时仍未见任何细胞毒性。2)与空白对照组相比,Md对HSFb有明显促进增殖作用(P<0.05)。结论Md在刺激体外培养HSFb增殖有明显的生物活性。     

积雪草甙对体外培养的成纤维细胞的作用

目的 探讨积雪草甙治疗增生性瘢痕的作用机制。方法 采用光镜、电镜、∧3H－TdR、∧3H脯氨酸掺入及MTT比色等方法检测成纤维细胞核DNA合成和胶原蛋白的合成。结果 积雪草甙不仅能影响成纤维细胞的超微结构,布且能抑制成纤维细胞增殖及胶原蛋白的合成。结论 积雪草在预防和治疗增生性瘢痕中有重要作用,其机制可能与抑制成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成有关。     

P物质对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响

目的 观察P物质对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响，探讨P物质在增生性瘢痕发生发展中的作用机制。方法 采用细胞培养技术，建立成纤维细胞系，应用细胞计数、MTT法及电镜进行形态学对比研究人增生性瘢痕成纤维细胞对P物质的反应。结果 P物质促进人增生性瘢痕成纤维细胞的生长。结论 P物质在增生性瘢痕的发生发展中起着重要的促进作用.     

积雪草甙、羟基积雪草甙对体外培养人胚胎成纤维细胞的影响

目的研究积雪草甙（asiaticoside,Ad）和羟基积雪草甙（madecassoside,Md）对体外培养人胚胎成纤维细胞（Human embryonic skin fibroblasts,HESFb）增殖过程的影响。方法在不同浓度（0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml）Ad和Md的环境下对人胚胎细胞进行体外培养,用CCK-8试剂盒通过酶标仪检测不同培养时间（0、1、2、3、4、5d）HESFb的OD值,用SPSS13.0统计软件进行统计分析。结果在实验时间内Ad和Md在10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml浓度时均对人胚胎成纤维细胞的增殖有促进作用,200μg/ml浓度时最明显,且Ad比Md作用强。两组在400μg/ml浓度时均有抑制作用。结论在一定浓度和培养时间内一定剂量的Ad和Md对体外培养的HESFb增殖有促进作用,同剂量相比Ad比Md明显。而较高剂量的时候均可出现抑制作用。     

积雪草甙对实验大鼠乳腺增生的防治

目的：研究积雪草甙对实验大鼠乳腺增生症的预防和治疗作用。方法：应用苯甲酸雌二醇，黄体酮制备大鼠乳腺增生症模型。在制备模型同时或之后，灌服积雪草甙，于给予受试药后第32天测量左右两个乳房直径，高度和乳头直径；放射免疫测定血清雌二醇（E2）和孕酮（P）浓度；镜下观察乳腺增生的病理改变，计算乳腺增生率和增生程度。结果：积雪草甙能显著降低实验性大鼠乳腺增生症的发生率，抑制乳腺增生程度，调节血清E2和P浓度，改善E2／P比值，积雪草甙能降低乳腺增生程度，减少乳腺增生症的发生率，有望成为预防和治疗乳腺增生症的候选药物。     

积雪草苷配合针灸治疗增生性瘢痕的临床研究

目的观察积雪草苷配合针灸治疗增生性瘢痕的临床疗效。方法积雪草苷配合针灸治疗及单独应用积雪草苷治疗增生性瘢痕。结果 30例患者积雪草联合针灸治疗3个月,总有效率80%,30例患单独应用积雪草联治疗3个月,总有效率53.3%。结论 ＂应用积雪草配合针灸＂是一种安全有效地治疗增生性瘢痕的方法。     

积雪草甙对体外培养的成纤维细胞的作用

【目的】探讨积雪草甙治疗增生性瘢痕的作用机制。【方法】采用光镜、电镜、3H-TdR、3H脯氨酸掺入及MTT比色等方法检测成纤维细胞核DNA合成和胶原蛋白的合成。【结果】积雪草甙不仅能影响成纤维细胞的超微结构,而且能抑制成纤维细胞增殖及胶原蛋白的合成。【结论】积雪草在预防和治疗增生性瘢痕中有重要作用,其机制可能与抑制成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成有关。     

曲安奈德抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖的初步研究

目的:研究曲安奈德对体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞(HFB)增殖的影响, 并找出抑制瘢痕成纤维细胞增殖的有效药物浓度范围,为临床用药提供参考依据.方法:用不同浓度的曲安奈德处理HFB 24、48、72 h,采用不加药培养基为阴性对照, 用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测HFB增殖活性并计算细胞生长抑制率、IC50、IC95.结果:一定浓度的曲安奈德对体外培养的HFB增殖有明显抑制作用,其24 h的IC50为0.42 g/L,IC95为2.05 g/L.结论:曲安奈德对增生性瘢痕的治疗作用可能主要通过抑制HFB增殖来实现的.曲安奈德抑制体外培养的HFB增殖的有效浓度范围为0.42～2.05 g/L.此浓度范围可作为临床应用曲安奈德治疗增生性瘢痕提供重要参考.     

慢病毒介导Smad7基因对角膜基质细胞增殖与纤维增生的抑制作用

【摘要】 目的 探讨慢病毒介导的Smad7基因转导能否抑制角膜基质细胞的增殖和纤维增生反应。方法 培养SD大鼠的角膜基质细胞,慢病毒载体介导转染Smad7基因或空质粒基因,分别建立Smad7阳性细胞克隆及空质粒阳性细胞克隆。角膜基质细胞进行分组：①正常细胞组：正常基质细胞,不加TGFβ2;②TGFβ2对照组：正常基质细胞加TGFβ2共孵育;③空质粒组：感染空质粒慢病毒的阳性细胞,加TGFβ2共孵育;④Smad7组：感染Smad7慢病毒的阳性细胞,加TGFβ2共孵育。TGFβ2的终浓度为10ng/ml。在TGFβ2刺激2h后Western blot检测TGFβ/Smad信号传导因子Smad2蛋白的磷酸化蛋白（phosphorylated Smad2,p-Smad2）。TGFβ2刺激48h后Western blot和real-time PCR检测α-SMA（α-smooth muscle actin）、Ki67、Ⅲ型胶原蛋白（Type Ⅲ collagen, ColⅢ）mRNA和蛋白的表达。MTT法检测基质细胞生长活性。结果 Smad7基因转导抑制了Smad2蛋白的磷酸化,减少了Ki67、α-SMA和胶原III mRNA和蛋白的表达,角膜基质细胞的生长活性也下降。结论 Smad7基因转导可阻断大鼠角膜基质细胞TGFβ信号传导通路,减少Smad2的磷酸化,阻止基质细胞的活化增殖,阻断基质细胞向肌纤维母细胞的转化,并且减少胶原蛋白III的合成,从而抑制角膜基质细胞增殖和纤维增生。     

shRNA抑制Smad3基因的表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7表达的影响

目的 构建抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloidfibroblast,KFB)Smad3基因表达的shRNA真核表达载体.研究Smad3 shRNA对KFB Smad7表达的影响.方法 用前期实验筛选出的1对最有效siRNA重组构建Smad3 shRNA表达质粒.通过脂质体介导的方法,将Smad3 shRNA转染到KFB,用RT-PCR及Western blot的方法检测Smad3、Smad7在不同时间点(0～9 d)表达的变化.结果 ①RT-PCR和Western blot的结果证实Smad3 shRNA载体构建成功.②转染Smad3 shRNA后,随着时间的延长,KFB中Smad3的mRNA与蛋白表达都显著减低,到72 h作用最强.光密度分析与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).Smad7的mRNA与蛋白表达都明显升高(P＜0.05).结论 体外构建的shRNA-Smad3 RNAi真核表达载体能显著抑制KFB Smad3的表达.Smad3可能对Smad7起反向调节的作用.     

Smad7基因转染人胰腺癌细胞后uPA及PAI-1表达的变化

目的: 通过对人胰腺癌细胞BxPC3转染Smad7基因,观察转染阳性细胞克隆尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)表达的改变,进一步阐明Smad7在胰腺癌侵袭和转移中的作用.方法: 经脂质体介导将含有Smad7重组表达质粒转染BxPC3细胞,用G418筛选及RT-PCR、蛋白质印迹法鉴定;又分别采用RT-PCR与蛋白质印迹法检测转染阳性细胞克隆uPA及PAI-1的表达.结果: 成功建立高表达Smad7的阳性BxPC3克隆(F-16、F-21),并证实其uPA、PAI-1 mRNA及蛋白表达均显著增加.结论: Smad7可能通过增强胰腺癌组织内uPA及PAI-1的生成而起到促进胰腺癌进展的作用.     

microRNA-21对肺癌A549细胞增殖和Smad7表达的影响

目的 探讨微小RNA-21 ( miR-21 )对肺癌A549细胞中Smad7表达的调控和对肺癌A549 细胞增殖的影响. 方法 常规培养肺癌细胞系A549,经脂质体转染miR-21模拟物和抑制物及阴性对照片段48 h后,采用Western blot、qRT-PCR法检测 Smad7 基因及蛋白的表达水平, MTT 法检测A549细胞增殖情况. 结果 转染miR-21 模拟物后Smad7的mRNA和蛋白表达量降低( P<0. 05 ) ,而转染miR-21 抑制物后Smad7的mRNA和蛋白表达量升高( P<0. 05 );MTT结果显示转染 miR-21 模拟物后细胞的增殖能力明显增强(P<0. 05),而转染miR-21 抑制物后细胞增殖能力明显减弱( P<0. 05 ). 结论 通过下调 miR-21 可提高 Smad7 的mRNA和蛋白表达,进而抑制A549细胞的增殖.     

Smad7抑制肝星状细胞胶原蛋白表达

目的 探讨Smad7对TGF-β1刺激肝星状细胞系HSC-T6细胞的I型胶原蛋(Co1l I)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响.方法 以pTRE-Smad7-M2-flag和pTet-on共转染HSC-T6细胞,筛选出稳定表达标记蛋白(M2-flag)的细胞克隆,确定强力霉素诱导Smad7表达的最佳使用剂量.分组比较Smad7对TGF-131刺激的Col I和α-SMA蛋白表达的影响,以及Smad7对Smad2/3磷酸化的调节作用.结果 强力霉素诱导Smad7表达的最佳使用剂量为2 mg/L,强力霉素诱导过表达的Smad7可抑制TGF-β1刺激HSC-T6细胞的Col I和α-SMA蛋白的表达.与单纯使用TGF-β1刺激HSC-T6细胞组比较,Smad7表达可下调HSC-T6细胞的Smad2/3的磷酸化水平.结论 过表达的Smad7可下调TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的Smad2/3磷酸化,抑制TGF-β1刺激HSC-T6细胞的Col I和α-SMA蛋白的表达,达到抑制肝纤维化的形成.

Abstract：

Objective To investigate the effect of Smad7 on the expressions of collagen I and α-smooth muscle actin (α-SMA) in HSC-T6 cell line activated by transforming growth factor-pi (TGF-pi). Methods HSC-T6 cells stably expressing M2-flag protein were selected after co-infection of the cells with pTRE-Smad7-M2-flag and pTet-on. The optimal dose of doxycycline for inducing Smad7 was determined, and the effects of Smad7 over-expression on the expressions of collagen I and a-SMA in the cells activated by TGF-β1 and on Smad2/3 phosphorylation were evaluated using Western blotting. Results The optimal dose of doxycycline for inducing Srnad7 expression was 2 mg/L. Smad7 over-expression induced by doxycycline decreased the expressions of collagen I and α-SMA in HSC-T6 cells activated by TGF-β1, and down-regulated the level of Smad2/3 phosphorylation. Conclusion Smad7 over-expression inhibits Smad2/3 phosphorylation, and decreases the expression of collagen I and α-SMA in HSC-T6 cells induced by TGF-β1 to inhibit the progression of liver fibrosis.     

他莫昔芬对人肝癌HepG2细胞增殖和Smad7表达的影响

目的研究他莫昔芬（TAM）对人肝癌HepG2细胞增殖的影响,探讨其作用机制。方法将他莫昔芬配制为0、7.5、l5、30?μmol／L,与人肝癌HepG2细胞培养24、48、72?h,用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定人肝癌HepG2细胞的抑制率;免疫组化染色观察人肝癌HepG2细胞Smad7蛋白的阳性表达。结果人肝癌HepG2细胞增殖随他莫昔芬浓度增加和处理时间的延长,细胞抑制率明显增加,细胞浆内Smad7蛋白阳性表达率明显降低,与时间和浓度呈负相关。结论他莫昔芬可抑制肝癌细胞增殖,可能与下调Smad7蛋白的表达有关。     

Smad4及Smad7在胃癌组织中的表达研究

目的:研究Smad4及Smad7在不同胃组织中的表达及作用.方法:病理学证实的胃癌根治术切除的胃癌组织标本78例,胃癌旁组织78例,采用SP免疫组织化学染色技术,检测Smad4及Smad7在不同胃组织中的表达.结果:qDSmad4蛋白在胃癌旁组织中的阳性表达率为69.23%,在胃癌组织中的阳性表达率为44.87%(P<0.01);随着胃癌分化程度的降低其阳性表达率降低;有淋巴结转移者阳性表达率为23.25%,无淋巴结转移者的阳性表达率为71.43%,差别亦有统计学意义(P<0.01).②Smad7蛋白在胃癌旁组织中的阳性表达率为17.95%,在胃癌组织中的阳性表达率为89.74%(P<0.01);随着胃癌分化程度的降低其阳性表达率升高;有淋巴结转移者阳性表达率为97.67%,无淋巴结转移者的阳性表达率为80.00%,有淋巴结转移者阳性表达率高于无淋巴结转移者(p<0.05 .结论:①smad4蛋白在胃癌组织中低表达,与癌旁组织比较差异有统计学意义(P<0.01),其表达的阳性率与胃癌的分化程度及转移有关.②Smed7蛋白在胃癌组织中高表达,与癌旁组织比较差异有统计学意义(P〈0.01),其表达的阳性率与胃癌的分化程度及转移有关.     

Smad7和uPA基因共表达对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的观察Smad7和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)基因共表达对体外培养肝星状细胞(HSC)活化、分泌胶原特性的影响。方法采用胶原酶原位灌注、密度梯度离心法分离大鼠HSC,将AdSmad7/uPA或AdSmad7体外感染HSC后,Western blot-ting法检测细胞总蛋白中Smad7、抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α2链(ColⅠA2)的表达;ELISA法检测培养上清中uPA蛋白的分泌量;放射免疫法测定HSC培养上清中Ⅲ型前胶原(PⅢP)和层黏连蛋白(LN)的分泌量。结果AdSmad7/uPA感染体外培养HSC,3 d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,转染效率>90%,Smad7和uPA蛋白的表达量明显高于AdGFP对照;AdSmad7/uPA或AdSmad7转染HSC均可使α-SMA、ColⅠA2、PⅢP和LN水平较AdGFP对照组显著下降(P<0.05)。与转染AdSmad7相比,转染AdSmad7/uPA后的HSC中ColⅠA2、PⅢP和LN表达降低更明显,分别较前者降低44.5%、30.4%和28.4%(P<0.05)。结论Smad7和uPA基因共表达可协同抑制体外培养的大鼠HSC分泌细胞外基质成分。     

Smad7基因转染拮抗TGF-β1对培养肾小管细胞的影响

目的 探讨Smad7基因转染对TGF-β1诱导的小管细胞生长阻滞，细胞凋亡和FN分泌的影响。方法 采用Tfx-50脂质体将小鼠Smad7转染入原代培养的。肾小管细胞，用MTT法观测小管细胞的增殖、流式细胞仪观测其细胞周期的变化；ELISA法测定小管细胞FN的分泌。结果 培养基添加TGF-β1(10ng/ml)48h后，小管细胞增殖能力明显下降，停滞于G1期的细胞数增多，细胞分泌的FN量也明显增高，相反，Smad7基因转染后可明显拮抗TGF-β1对小管细胞的上述作用。结论 Smad7基因转染可明显拮抗TGF-β1对小管细胞的影响，此结果为今后体内Smad7基因治疗研究奠定了基础。     

Smad6、7蛋白表达与梗阻性肾病小管间质损伤关系的实验研究

目的 研究Smad6，7蛋白表达与梗阻性肾病小管间质损伤的关系。方法 32只Wistar大鼠随机分为单侧输尿管梗阻组和假手术组（对照组），于术后3、7、14、21d处死大鼠。采用逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）检测TGF－β1 mRNA表达水平；用免疫组化和Western杂交分别检测Smad6,Smad7蛋白的定位和表达；DNA处断末端标记原位检测肾小管细胞凋亡数；图像分析小管细胞和肾小球毛细血管球囊平均卡规直径的变化。判断纤维化程度通过测定肾组织羟脯氨酸含量。结果 与对照组相比，梗阻肾组织TGF－β1 mRNA表达显著增高，并伴有明显的肾小管和肾小球毛细血管球囊萎缩、小管细胞的凋亡，以及肾组织羟脯氨酸含量增高。Smad6、7蛋白主要在肾小球和皮质肾小管上皮细胞内表达。输尿管梗阻后，Smad6、7蛋白表达明显下降，该Anti-Smad蛋白下调与小管间质损伤呈明显相关。结论 TGF－β1信号通路参与了梗阻性肾病小管间质损伤的进程，Anti-Smad蛋白表达下降可能是该模型TGF－β1致伤作用加重的主要原因。     

大鼠Smad7基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建大鼠Smad7慢病毒载体。方法:提取大鼠大脑皮质及肾脏的总RNA,逆转录PCR扩增获得Smad7目的基因片段,EcoRI及BamHI酶切连接慢病毒载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,构建融合copGFP共表达的Smad7重组质粒。转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经PCR扩增及测序鉴定正确后,Smad7重组质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293TN,包装产生病毒液,转染H1299细胞株测定病毒滴度。结果:通过扩增获得1.3kb Smad7 cDNA片段,测序结果证实目的基因与Genebank序列完全一致,Smad7重组质粒慢病毒包装后获得Smad7慢病毒载体,病毒滴度为1.0×107ifu/ml。结论:成功构建大鼠Smad7慢病毒载体,为进一步研究Smad7基因的相关功能提供了适合的转染载体。