人表皮干细胞体外分选和培养对构建组织工程皮肤种子细胞的可能性

目的：探讨人表皮干细胞在体外分选和培养的叮能性，为构建组织工程皮肤寻找理想的种子细胞。方法：实验于2002-01／12在中山大学基础医学院动物中心完成。根据表皮干细胞与Ⅳ型胶原蛋白的高黏附的特性，运用黏附实验将干细胞从培养在鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶的表皮细胞中分选出来，并从形态学、超微结构及免疫组化等方面进行了鉴定。结果：分选出来培养的细胞符合表皮千细胞的特征，说明分选培养的细胞是表皮干细胞。结论：预先在体外对表皮干细胞进行分选和培养是可行的，该细胞群有望成为构建组织工程皮肤的种子细胞，为下一步应用表皮干细胞构建组织工程皮肤奠定了牢固的基础。     

皮肤组织工程中人表皮干细胞的体外培养及分化特性研究

目的探索人表皮干细胞( keratinocyte stem cell, KSC)的筛选方法、体外培养条件及生长分化特性. 方法由包皮消化获得表皮细胞,以低密度单克隆筛选法挑取 KSC克隆,并以挑取克隆传代及子代细胞混合传代两种不同的方法持续传代培养,采用 3种不同的滋养细胞.计算每代 KSC子代细胞的克隆形成率( colony forming efficiency,CFE)以及整合素β 1及外皮蛋白的表达情况. 结果将 KSC克隆的子代细胞混合消化传代培养, CFE会逐渐下降,从最初的 95%以上降至第 6代时的 25%左右.每代均可见 3种处于不同分化状态的克隆混合生长,即干细胞克隆(绝大部分细胞未分化,整合素β 1阳性、外皮蛋白阴性)、短暂增殖克隆(部分细胞进入终末分化)、终末分化克隆(所有细胞均发生终末分化,外皮蛋白阳性、整合素β1阴性).以挑取克隆传代法传代培养,其 CFE仍能保持在 95%以上并能持续传代. 结论以低密度单克隆筛选法可成功地筛选出 KSC克隆并能持续传代培养,多种成纤维细胞可作为培养 KSC的滋养细胞. KSC在体外会分裂增殖并逐渐分化,但干细胞的数量比例可以保持在较高水平.     

皮肤组织工程种子细胞-表皮干细胞提供来源选择的研究

目的寻找表皮基底层细胞中含有较高干细胞比例的供皮区。方法选择不同供皮部位，利用免疫组织化学的方法，以K19和整合素β1作为表皮干细胞鉴定标记。结果皮肤基底层表皮干细胞以包皮及阴囊最多，其次是臀部，背部多于胸部。四肢近端外侧多于四肢近端内侧，头皮、手掌及足底皮肤基底层干细胞数量较少。结论从组织工程种子细胞的供应来源考虑，以男性包皮最佳，在客观上也容易获得。     

皮肤组织工程中人表皮干细胞的体外培养及分化特性研究

目的：探索人表皮干细胞(keratinocyte stem cell，KSC)的筛选方法、体外培养条件及生长分化特性。方法：由包皮消化获得表皮细胞，以低密度单克隆筛选法挑取KSC克隆，并以挑取克隆传代及子代细胞混合传代两种不同的方法持续传代培养，采用3种不同的滋养细胞。计算每代KSC子代细胞的克隆形成率(colony forming efficiency，CFE)以及整合素β1及外皮蛋白的表达情况。结果：将KSC克隆的子代细胞混合消化传代培养，CFE会逐渐下降，从最初的95％以上降至第6代时的25％左右。每代均可见3种处于不同分化状态的克隆混合生长，即干细胞克隆(绝大部分细胞未分化，整合素β1阳性、外皮蛋白阴性)、短暂增殖克隆(部分细胞进入终末分化)、终末分化克隆(所有细胞均发生终末分化，外皮蛋白阳性、整合素β1阴性)。以挑取克隆传代法传代培养，其CFE仍能保持在95％以上并能持续传代。结论：以低密度单克隆筛选法可成功地筛选出KSC克隆并能持续传代培养，多种成纤维细胞可作为培养KSC的滋养细胞。KSC在体外会分裂增殖并逐渐分化，但干细胞的数量比例可以保持在较高水平。     

人表皮干细胞的体外分离和培养

背景：如何获得高纯度的表皮干细胞以及维持其干细胞表型和体外增殖特性，是目前表皮干细胞体外培养过程中急需解决的问题。目的：建立人表皮干细胞体外分离和培养的技术方法。设计、时间及地点：细胞观察，于2005-03／2006-05在南昌大学第一附属医院烧伤科完成。材料：所用包皮来自2～12岁行包皮环切术的患者，患者无泌尿系统感染等疾病。方法：取包皮皮片，采用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法分离出角朊细胞和成纤维细胞，Ⅳ型胶原快速黏附法富集分离表皮干细胞。收集处于指数生长期第二三代成纤维细胞的上清液，过滤后与角朊细胞无血清培养基等比例混合，并加入胎牛血清、表皮生长因子、牛垂体提取物等组成表皮干细胞培养液，用以人表皮干细胞的体外扩增培养，以角朊细胞作对照。主要观察指标：传至第2代，通过平板克隆形成实验计算克隆形成率和克隆维持时间，采用免疫组织化学染色检测β1整合素和角蛋白19的表达。结果：①与同一标本同一批次培养的角朊细胞相比，人表皮干细胞的克隆形成率明显升高，克隆维持时间延长（P〈0．01）。②表皮干细胞β1整合素及角蛋白19免疫组织化学染色均呈阳性。结论：应用Ⅳ型胶原快速黏附法及人成纤维细胞条件培养基，对人表皮干细胞成功进行了体外分离和培养。     

骨髓间充质干细胞复合胶原构建组织工程皮肤修复皮肤缺损

目的：骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潜能和持续增殖能力，显示出作为组织工程种子细胞新来源的诱人前景。探讨MSCs作为皮肤组织工程种子细胞修复皮肤缺损的可能性。方法：采用密度梯度离心结合贴壁法分离纯化新西兰兔MSCs，经体外扩增后接种于胶原凝胶构建组织工程活性皮肤替代物。12只兔随机分成3组：MSCs复合胶原组织工程活性皮肤替代物实验组、单纯胶原对照组和空白对照组。将各组相应材料分别移植于兔耳皮肤缺损处，比较观察创面修复效果。结果：MSCs复合胶原实验组、单纯胶原对照组和空白对照组创面愈合时间分别为(14．2&;#177;1．9)d，(16．3&;#177;2．7)d和(20．1&;#177;4．1)d，差异有显著性意义(P&;lt;0．05)。组织学观察显示，MSCs复合胶原实验组成纤维细胞、微血管、胶原纤维均较单纯胶原对照组和空白对照组明显增多。结论：MSCs复合胶原构建的组织工程活性皮肤替代物移植后可加速新生血管形成、促进创面修复。提示以MSCs作为种子细胞复合胶原构建的组织工程皮肤可用于皮肤缺损的修复治疗。     

表皮细胞、成纤维细胞复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

目的；观察体外培养的人皮肤角朊细胞和成纤维细胞的生物学特性，复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步临床应用奠定基础。方法：分别取人皮肤角朊细胞和成纤维细胞体外培养、扩增，测定细胞生长曲线、克隆形成率和染色体倍性；将培养的角朊细胞、成纤维细胞分别接种于脱细胞真皮基质表面，体外构建组织工程皮肤，观察细胞生长增殖情况。结果：在本培养体系下人皮肤角朊细胞和成纤维细胞增殖良好，细胞染色体倍性检测结果均为二倍体细胞。脱细胞真皮基质对角朊细胞、成纤维细胞无明显毒性作用，体外复合培养细胞可生长增殖。结论：此实验方法可以获得生长状态良好的组织工程皮肤种子细胞，复合脱细胞真皮基质可成功构建组织工程皮肤     

重组人表皮生长因子对体外培养人角质细胞增殖的影响

目的：观察不同浓度条件下表皮生长因子对角质形成细胞增殖的影响，分析表皮生长因子对角质形成细胞增殖过程中有无异常影响。方法：实验于2003-09／2005-01在新疆维吾尔自治区包虫病研究所细胞室完成。实验所用细胞从手术中切取的皮片（中厚皮片）获得。采取体外角质形成细胞的原代培养技术，用浓度分别为0．001，0．01，0．1，1，10，100，500μg／L浓度的表皮生长因子干预体外培养的细胞。采用噻唑蓝法检测细胞活性。选择最适浓度表皮生长因子干预的角质形成细胞，用流式细胞仪检测细胞的DNA倍体情况。结果：①角质形成细胞生长过程的观察：细胞培养3d可见部分贴壁，内有各层角质形成细胞；细胞培养12d可见明显的贴壁现象，有圆形或椭圆形细胞核，细胞体呈不规则形态；13d后可见细胞膜片的形成。细胞间隙明显，细胞大部分为多角形。细胞核明显；20d左右可见细胞膜片仍然存在，细胞形态正常，折光性好。②角质形成细胞的鉴定：胞核内可见棕黄色着色，多数可见明显的细胞核。③不同浓度表皮生长因子对人角质形成细胞增殖的影响：进人对数生长期的细胞在表皮生长因子浓度为0．01-100μg/L时，其吸光度值为0．330&;#177;0．014～0．400&;#177;0．018，此浓度下对角质形成细胞有增殖作用；浓度为0．1～1μ／L时，其吸光度值为0．386＋0．043～0．428&;#177;0．024，增殖作用最强；浓度为0．001或500g／L时，其吸光度值为0．344&;#177;0．013和0．251&;#177;0．025，无明显增殖作用。④培养12d时流式细胞仪对表皮生长因子最适浓度下细胞倍体含量的测定：合成前期=95．9％，大多数为二倍体；分裂前期=4．1％，为四倍体；未见非整倍体。细胞分化良好，无异常分化表现。结论：表皮生长因子浓度为0．01～100μg／L时，促角质形成细胞增殖作用明显，在促增殖范围内无致细胞染色体异常分化的现象，细胞多数为合成前期，提示此条件下角质形成细胞具有很强的增生能力。表皮生长因子浓度为500μg／L时，对角质形成细胞有明显的抑制作用，0．001μg／L为最低有效浓度。重组表皮生长因子对细胞生周长期无影响．     

骨髓间充质干细胞复合胶原构建组织工程皮肤修复皮肤缺损

目的:骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)具有多向分化潜能和持续增殖能力,显示出作为组织工程种子细胞新来源的诱人前景。探讨MSCs作为皮肤组织工程种子细胞修复皮肤缺损的可能性。方法:采用密度梯度离心结合贴壁法分离纯化新西兰兔MSCs,经体外扩增后接种于胶原凝胶构建组织工程活性皮肤替代物。12只兔随机分成3组:MSCs复合胶原组织工程活性皮肤替代物实验组、单纯胶原对照组和空白对照组。将各组相应材料分别移植于兔耳皮肤缺损处,比较观察创面修复效果。结果:MSCs复合胶原实验组、单纯胶原对照组和空白对照组创面愈合时间分别为(14.2±1.9)d,(16.3±2.7)d和(20.1±4.1)d,差异有显著性意义(P<0.05)。组织学观察显示,MSCs复合胶原实验组成纤维细胞、微血管、胶原纤维均较单纯胶原对照组和空白对照组明显增多。结论:MSCs复合胶原构建的组织工程活性皮肤替代物移植后可加速新生血管形成、促进创面修复。提示以MSCs作为种子细胞复合胶原构建的组织工程皮肤可用于皮肤缺损的修复治疗。     

重组人表皮生长因子对体外培养人角质细胞增殖的影响

目的:观察不同浓度条件下表皮生长因子对角质形成细胞增殖的影响,分析表皮生长因子对角质形成细胞增殖过程中有无异常影响。方法:实验于2003-09/2005-01在新疆维吾尔自治区包虫病研究所细胞室完成。实验所用细胞从手术中切取的皮片(中厚皮片)获得。采取体外角质形成细胞的原代培养技术,用浓度分别为0.001,0.01,0.1,1,10,100,500μg/L浓度的表皮生长因子干预体外培养的细胞,采用噻唑蓝法检测细胞活性。选择最适浓度表皮生长因子干预的角质形成细胞,用流式细胞仪检测细胞的DNA倍体情况。结果:①角质形成细胞生长过程的观察:细胞培养3d可见部分贴壁,内有各层角质形成细胞;细胞培养12d可见明显的贴壁现象,有圆形或椭圆形细胞核,细胞体呈不规则形态;13d后可见细胞膜片的形成,细胞间隙明显,细胞大部分为多角形,细胞核明显;20d左右可见细胞膜片仍然存在,细胞形态正常,折光性好。②角质形成细胞的鉴定:胞核内可见棕黄色着色,多数可见明显的细胞核。③不同浓度表皮生长因子对人角质形成细胞增殖的影响:进入对数生长期的细胞在表皮生长因子浓度为0.01～100μg/L时,其吸光度值为0.330±0.014～0.400±0.018,此浓度下对角质形成细胞有增殖作用;浓度为0.1～1μg/L时,其吸光度值为0.386±0.043～0.428±0.024,增殖作用最强;浓度为0.001或500g/L时,其吸光度值为0.344±0.013和0.251±0.025,无明显增殖作用。④培养12d时流式细胞仪对表皮生长因子最适浓度下细胞倍体含量的测定:合成前期=95.9%,大多数为二倍体;分裂前期=4.1%,为四倍体;未见非整倍体。细胞分化良好,无异常分化表现。结论:表皮生长因子浓度为0.01～100μg/L时,促角质形成细胞增殖作用明显,在促增殖范围内无致细胞染色体异常分化的现象,细胞多数为合成前期,提示此条件下角质形成细胞具有很强的增生能力。表皮生长因子浓度为500μg/L时,对角质形成细胞有明显的抑制作用,0.001μg/L为最低有效浓度。重组表皮生长因子对细胞生长周期无影响。     

应用表皮干细胞构建组织工程皮肤及移植实验

目的:探讨应用人表皮干细胞和猪脱细胞真皮构建组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性。方法:实验于2004-06/2005-12在南昌大学医学院烧伤研究所完成。①取环状切除后幼儿包皮(家属知情同意)用中性蛋白酶与胰蛋白酶混合消化液消化,收集细胞,接种在已包被Ⅳ型胶原的培养皿中,快速黏附,保留快速黏附细胞继续培养,培养体系为低钙高糖DMEM培养基,待融和状态时,再次消化,离心收集细胞,再次经过Ⅳ型胶原快速黏附,保留黏附细胞,培养20d左右,用作构建表皮干细胞并进行细胞鉴定。②将第2代细胞接种于铺好Ⅳ型胶原的猪无细胞真皮上,每3天换液。10d后将其转移至不锈钢网架上,行气液界面培养5d左右,构建复合皮。③取SD大鼠20只,随机分2组。于动物背部尾侧正中作2.5cm×2.5cm的全层皮肤至肌筋膜的切除。实验组10只创面覆盖表皮干细胞构建的复合皮移植物,对照组10只覆盖无细胞真皮移植物。④移植后7,10,14,21和35d,两组动物均活检取材,进行创面大体观察、组织学观察及免疫组织化学、免疫荧光鉴定等。结果:①表皮干细胞的分离、扩增及鉴定:在扩增的细胞拟接种于无细胞真皮前,进行角蛋白19免疫组织化学鉴定、以流式细胞术进行α6、CD71鉴定。经胶原Ⅳ黏附的细胞培养后形成较大集落,拟接种的种子细胞中α6briCD71dim细胞占总细胞的(39±7)%;鼠抗人角蛋白19阳性细胞率为(53±6)%。②组织工程皮肤的建立结果:表皮干细胞种植于无细胞真皮上1d后,细胞便贴壁并开始生长增殖,8d左右透过间隙见无细胞真皮上表皮干细胞渐增殖融合成片;2周时无细胞真皮表面可见菲薄皮片状生长的细胞膜片物。复合皮组织学检查可见无细胞真皮表面覆盖多层融合的表皮层细胞,无细胞真皮内细胞成分去除完全。③创面愈合情况:术后2周,实验组移植物成活,创面上已上皮化,移植物柔软,而对照组无细胞真皮表面未上皮化,较干燥,色暗、触之较硬,两组创面均未见明显收缩。4周,实验组创面愈合,未见明显排斥反应。对照组无细胞真皮干燥脱落而创面暴露,创面收缩明显,创面边缘因自体表皮细胞爬行而缩小创面。④组织学检查及免疫组织化学染色结果:实验组2周时创面已全部上皮化,但细胞分层少;3,4周表皮层分化良好,多层结构,真皮纤维内见成纤维细胞长入,见少许炎症细胞,大鼠自体正常皮肤见毛囊及毛发结构。对照组2周创面尚未上皮化,无细胞真皮干燥变性,3,4周后创面仍未愈合,可见大量炎症细胞。实验组愈合创面抗人人类白细胞抗原-Ⅰ型抗原直接免疫荧光染色呈阳性,证明新生表皮由移植的人表皮细胞形成。而对照组阴性。实验组愈合创面广谱角蛋白免疫组织化学染色见整个表皮层细胞胞浆染呈棕黄,为阳性反应。结论:利用体外纯化扩增的表皮干细胞及制备的猪脱细胞真皮可体外联合构建具有复层结构的组织工程皮肤,该组织工程皮肤可用于修复动物全层皮肤缺损。     

改良五黄油对体外人表皮干细胞生长的影响

背景：烧伤创面外用药物五黄油具有抑菌、促进创面愈合的作用，但长期临床应用发现该制剂在止痛、抑制瘢痕形成等方面疗效不确切，且促进表皮生长作用仍有待加强。目的：观察加入黄芪、粉防己碱的改良五黄油不同药物浓度和药物作用时间对人表皮干细胞体外生长增殖的影响。设计、时间及地点：对比观察实验，于200510／2006—10在南昌大学医学院烧伤研究所细胞培养实验室完成。材料：2～12岁患者包皮环切术后的新鲜包皮（患者对实验内容均知情同意，并自愿捐献），改良五黄油工作液及五黄油工作液由南昌大学第一附属医院药剂科提供。方法：将不同质量浓度的改良五黄油（0，0．15，0．20，0．25，0．30g／mL）分别加入体外培养的表皮干细胞中，并于5个不同时相点（2，4，6，8，10d），以五黄油为对照组进行MTT细胞生长增殖检测，观察对细胞增殖影响程度。主要观察指标：利用MTT法在酶标仪上分别测定各组表皮干细胞的增殖率。结果：以0，0．15，0．20，0．25，0．30g／mL质量浓度药物作用人表皮干细胞，其增殖程度与改良五黄油的质量浓度正相关性；改良五黄油在0．25g／mL和0．30g／mL质量浓度，相同作用时间（4，6，8d）对表皮干细胞的增殖率高于五黄油，差异有显著性意义（P〈0．01）。结论：在一定的体外作用时间范围内，改良五黄油对表皮干细胞的促增殖能力与药物质量浓度呈正相关；改良五黄油对体外表皮干细胞的增殖效果好于五黄油。     

表皮细胞、成纤维细胞复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

目的:观察体外培养的人皮肤角朊细胞和成纤维细胞的生物学特性,复合脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤,为进一步临床应用奠定基础。方法:分别取人皮肤角朊细胞和成纤维细胞体外培养、扩增,测定细胞生长曲线、克隆形成率和染色体倍性;将培养的角朊细胞、成纤维细胞分别接种于脱细胞真皮基质表面,体外构建组织工程皮肤,观察细胞生长增殖情况。结果:在本培养体系下人皮肤角朊细胞和成纤维细胞增殖良好,细胞染色体倍性检测结果均为二倍体细胞。脱细胞真皮基质对角朊细胞、成纤维细胞无明显毒性作用,体外复合培养细胞可生长增殖。结论:此实验方法可以获得生长状态良好的组织工程皮肤种子细胞,复合脱细胞真皮基质可成功构建组织工程皮肤。     

转基因骨髓间充质干细胞移植与组织工程皮肤的血管化

背景:组织工程化皮肤移植后常因缺乏足够的血管化而导致低灌注和缺血损伤.利用转基因技术,可将血管生成调控因子摹因导入目的细胞,使其表达某些调控因子,进而利于血管生成.目的:观察转基因骨髓间充质干细胞移植促进组织工程皮肤血管化基因治疗的可行性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-03/11在江西省南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:人骨髓间充质干细胞由试验者取自临床骨髓穿刺检查骨髓正常的患者.pShuttle-CMV/VEGF165质粒转化大肠杆菌菌种由武汉协和医院郜勇博士惠赠.16只新西兰大白兔用于皮肤缺损模型的制作,分为基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组、真皮支架材料组进行移植.方法:采用密度梯度离心结合贴壁法分离培养入骨髓间充质干细胞,以pShuttle-CMV/VEGF165质粒转染骨髓间充质干细胞.于兔背部两侧制备2 cm×2 cm的正方形全层皮肤缺损3个,并分别以人血管内皮细胞生长因子165转染骨髓间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、不含细胞的真皮支架材料植入全层皮肤缺损创面.主要观察指标:观察局部组织微血管密度变化及移植物成活率.结果:术后7 d,3组创口周围皮肤均无明显红肿及炎症反应,移植物与创面接触紧密,基因转染骨髓间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组可见部分真皮泛红,真皮支架材料组不明显,术后3周创面基本愈合,基因转染骨髓间充质干细胞组创面的毛细血管密度较骨髓间充质干细胞组、真皮支架材料组明显增高(P<0.01),14 d时3组中基因转染骨髓间充质干细胞组血管密度仍最高,但3组数据无统计学差异.术后二三周基因转染骨髓间充质干细胞组移植物成活率最高(P<0.01).结论:血管内皮细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植可改善和促进局部血管再生,促使新的毛细血管从创面长入移植的组织工程皮肤,从而促进组织工程皮肤的早期血管化及创面愈合.     

体外分离培养人源性脂肪间充质干细胞及其鉴定

目的 体外分离培养人皮下脂肪来源的细胞群,依据国际标准规定通过形态观察、免疫表型检测及多种分化潜能的鉴定证实体外获得的细胞群为脂肪来源的间充质干细胞.方法 采用0.1％胶原酶Ⅰ及0.25％胰酶双消化法进行细胞的体外分离,LG-DMEM培养基加入体积分数为10％胎牛血清,于37℃、5％ CO2的饱和湿度条件下培养,待细胞生长至70％ ～ 80％融合时消化传代扩增.通过倒置显微镜观察细胞形态;流式细胞仪检测细胞免疫表型表达;取第3代细胞,于培养基中分别加入成骨及成脂诱导剂进行定向诱导分化,并对诱导后的细胞染色鉴定.结果 分离培养的细胞群呈长梭状,漩涡样贴壁生长;流式细胞仪检测P2代细胞,其中CD73,CD105,C90,CD44,CD29及CD49d呈阳性表达,而CD14,CD34,CD45,HLA-DR及CD106呈阴性表达;成骨诱导3周后,茜素红染色、VON-KOSSA染色及细胞碱性磷酸酶染色都呈阳性;成脂诱导2周后,细胞内有小脂滴出现,油红O染色呈阳性.结论 胶原酶胰酶双消化法从脂肪组织中分离获得的细胞可贴壁生长;流式细胞仪检测证实细胞表达与间充质干细胞相符的免疫表型;定向诱导后具有成骨及成脂分化能力;符合间充质干细胞的特性.     

组织工程皮肤中人毛乳头细胞体外培养条件的优化

目的:优化人毛乳头细胞体外培养条件。方法:采用成人头皮标本,显微器械分离法及器械分离结合胶原酶消化二步法分离毛乳头,分别利用普通有血清的Dulbecco最低必需培养基(DMEM)、含生长因子的有血清DMEM培养基及角质细胞条件培养基,进行人毛乳头细胞的体外培养,比较细胞的生长特点、增殖活性、细胞周期等生物学特性。结果:二步法分离毛乳头的效率为显微器械分离法的100倍,利用含生长因子的有血清DMEM培养基和角质细胞条件培养基均可使毛乳头细胞长期维持较强的增殖潜能。结论:二步法分离毛乳头,利用含生长因子的有血清DMEM培养基或角质细胞条件培养基进行培养,可以快速、简便、高效地获得大量保持高增殖潜能的毛乳头细胞。     

体外分离培养兔脂肪干细胞的生物学特性

目的：建立兔脂肪干细胞的体外分离培养方法，鉴定并分析其生物学特性。方法：实验于2005—06／2006—03在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成。选用雌性新西兰大白兔，兔龄4个月，无菌取出雌兔双侧腹股沟脂肪垫，贴壁法及Ⅰ型胶原酶法分离出兔脂肪干细胞，并进行体外培养，取5代以后的兔脂肪干细胞观察其形态特征，并绘制细胞生长曲线及倍增时间，同时进行细胞过氧化物酶、苏丹黑B、碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原化学染色；用流式细胞仪检测其细胞表面标志并进行细胞周期分析。结果：①兔脂肪干细胞原代及传代细胞形态：原代及传代的兔脂肪干细胞均呈长梭形或多边形贴壁生长，生长分化活跃。②兔脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间：传代的兔脂肪干细胞生长曲线呈“S”形，群体倍增时间为22h。③兔脂肪干细胞的化学染色特点：兔脂肪干细胞的过氧化物酶、苏丹黑B染色呈阴性，而碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原染色呈阳性。④兔脂肪干细胞表面标志及细胞周期：流式细胞仪检测结果显示兔脂肪干细胞的表面标志物CD29，CD44，CD90，CD15，CD166表达阳性，而CD31，CD34，CD45和CD106表达阴性。细胞周期分析显示，G0／G1期占80．25％，G2/M期占6．03％，S期占13．72％。结论：本次实验所分离出来的兔脂肪干细胞在体外具有生长稳定，增殖较快的特点。     

体外分离培养兔脂肪干细胞的生物学特性

目的:建立兔脂肪干细胞的体外分离培养方法,鉴定并分析其生物学特性。方法:实验于2005-06/2006-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成。选用雌性新西兰大白兔,兔龄4个月,无菌取出雌兔双侧腹股沟脂肪垫,贴壁法及Ⅰ型胶原酶法分离出兔脂肪干细胞,并进行体外培养,取5代以后的兔脂肪干细胞观察其形态特征,并绘制细胞生长曲线及倍增时间,同时进行细胞过氧化物酶、苏丹黑B、碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原化学染色;用流式细胞仪检测其细胞表面标志并进行细胞周期分析。结果:①兔脂肪干细胞原代及传代细胞形态:原代及传代的兔脂肪干细胞均呈长梭形或多边形贴壁生长,生长分化活跃。②兔脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间:传代的兔脂肪干细胞生长曲线呈“S”形,群体倍增时间为22h。③兔脂肪干细胞的化学染色特点:兔脂肪干细胞的过氧化物酶、苏丹黑B染色呈阴性,而碱性磷酸酶、α-醋酸萘酚酯酶与糖原染色呈阳性。④兔脂肪干细胞表面标志及细胞周期:流式细胞仪检测结果显示兔脂肪干细胞的表面标志物CD29,CD44,CD90,CD105,CD166表达阳性,而CD31,CD34,CD45和CD106表达阴性。细胞周期分析显示,G0/G1期占80.25%,G2/M期占6.03%,S期占13.72%。结论:本次实验所分离出来的兔脂肪干细胞在体外具有生长稳定,增殖较快的特点。