微酸法提取肿瘤抗原肽体外冲击树突状细胞后回输体内的抗肿瘤效应

肿瘤抗原可以由肿瘤细胞的MHCⅠ类分子提呈于细胞表面,经微酸法可以从肿瘤细胞表面洗脱下被MHCⅠ类分子所提呈的抗原多肽,进一步纯化富集后可获得高纯度的肿瘤抗原多既.从癌性腹水分离FBL3白血病细胞,以微酸提取液洗脱瘤细胞表面1类肽,洗脱液经Separk C18柱吸附,乙酸洗脱后,可获得分子量小于5,000D的多肽分子,冻干后即可用作肿瘤抗原多肽富集产物.骨髓诱生的树突状细胞,加人FBL3酸提抗原可有效激发FBL3特异性T细胞株的增殖,表明可以被酸提抗原多肽树突状细胞提呈给T细胞.将酸提抗原冲击后的树突状细胞回输小鼠体内,2天后,皮下接种FBL3细胞(3×10~6),而另设FBL3冻融抗原冲击DC治疗组及未处理组.酸提抗原致敏DC治疗组小鼠可诱导较     

人外周血树突状细胞的体外扩增及鉴定

树突状细胞(DC)作为抗原提呈细胞,在激发T细胞免疫应答及T细胞依赖性抗体生成中起重要作用,骨髓及外周血的CD34造血前体细胞在GM-CSF和TNF-α的作用下,可在体外分化发育,生成树突状细胞.本研究从正常人外周血分离获得单核细胞,加入100ng/ml hGM-CSF、500U/ml hIL-4,体外培养1周后,获得大量高纯度的树突状细胞,其高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子及共刺激分子B7-1和CD40,能强烈激发同种异体T淋巴细胞增殖,培养条件以应用自体血清或胎牛血清为最佳;单独应用hGM-CSF只能生成巨噬细胞;在培养末期加入TNFα可促进DC进一步成熟.本研究为DC的深入研究与临床应用奠定了基础.     

自体恶性黑色素瘤抗原激活的树突状细胞体外诱导免疫试验

树突状细胞(dendritic cells,DC)是迄今为止所知的抗原呈递能力最强的抗原呈递细胞(antigen presenting cells,APC).肿瘤患者因DC免疫功能低下致宿主抗肿瘤免疫无能.研究表明,人外周血单核细胞在体外用粒/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)及白介素4(IL-4)诱导后,可培养出表达高水平MHCI、MHCII类抗原和CD80、CD86等因子的DC.本实验拟应用黑色素瘤患者外周血单核细胞,经GM-CSF及IL-4诱导后获得DC,再经自体肿瘤细胞冻融物冲击,在体外激活自体T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),观察其体外抗肿瘤作用.     

γ-射线诱导胆管癌细胞凋亡致敏树突状细胞后的免疫应答

目的：建立γ-射线诱导癌细胞凋亡致敏从人外周血诱导扩增的树突状细胞（dendritic cells,DCs的方法。方法：从正常人外周血分离获得单核细胞，加入50ng/ml rhGM-CSF,1000U/ml rhIL-4，隔天1次，共4次，培养第3天，加入γ-射线诱导凋亡的胆管癌细胞，再继续体外培养4天后，用树突细胞富集柱收集DCs。结果：DCs高表达共刺激分子B7和CD1a，表达具有典型不规则突起，γ-射线诱导癌细胞凋亡形成的凋亡小体被DC捕捉、吞噬，负载抗原的DCs其激发同种异体T淋巴细胞增殖的能力进一步增强。结论：γ-射线诱导癌细胞凋亡可以致敏rhGM-CSF加rhIL-4从人外周血单核细胞诱导、扩增出的DCs，DCs可以有效提呈凋亡胆管癌细胞的抗原，可望成为有效的肿瘤抗原致敏DC的新途径。     

负载腮腺腺样囊性癌抗原的树突状细胞诱导的抗肿瘤效应

目的:探讨腺样囊性癌肿瘤抗原负载的树突状细胞通过淋巴细胞介导的免疫反应,体外杀伤腺样囊性癌细胞的细胞毒性效应.方法:外周血单核细胞在GM-CSF + IL-4 的诱导下体外培养,用肿瘤细胞抗原冲击后,流式细胞仪检测树突状细胞抗原负载前后CD1a、CD83表达量的变化.MTT比色法检测同种异体的混合淋巴细胞反应和诱导细胞毒淋巴细胞CTL杀伤肿瘤细胞.结果:凋亡肿瘤抗原刺激后,CD83 表达增加﹙P<0.01﹚,而CD1a表达量下调﹙P<0.05).负荷肿瘤抗原树突状细胞体外诱导出明显的细胞不良反应,并刺激同种T淋巴细胞增殖.结论:GM-CSF + IL-4 诱导的单核细胞来源的树突状细胞,能在体外摄取肿瘤抗原而进一步成熟,通过激活淋巴细胞杀伤癌细胞.     

Caveolin1对KDR信号通路的作用

目的:研究以小鼠结肠癌细胞CT-26RNA作为抗原体外转染经mIL-12基因修饰的树突状细胞(dendriticcells,DC),观察其诱导特异性抗肿瘤的效应。方法:小鼠骨髓细胞体外以rmGM-CSF、rmIL-4诱导培养获取树突状细胞,流式细胞术检测纯度;293细胞扩增携带mIL-12基因的重组腺病毒,体外转染树突状细胞;Trizol法提取CT-26细胞总RNA,应用Trans-Messenger体外转染mIL-12基因修饰的树突状细胞,免疫接种小鼠。ELISA法检测细胞上清及小鼠血液中mIL-12水平,LDH释放法检测小鼠体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性。结果:小鼠骨髓细胞经诱导培养后,获得大量高纯度的树突状细胞,流式细胞术检测CD11c 的树突状细胞>90%;提取的CT-26细胞总RNA体外经TransMessenger介导,转染mIL-12基因修饰的树突状细胞后,回输小鼠,可以诱导体内生成较高水平的特异性CTL活性,亲本肿瘤接种后小鼠100%长期存活,而以该RNA转染Ad-LacZ修饰DC后的对照组及RNA转染DC的对照组,诱导机体生成的特异性CTL活性显著低于实验组(P<0.01),亲本肿瘤接种后小鼠60%长期存活,DC、PBS对照组则均未诱导机体生成特异性CTL活性,小鼠无长期存活。结论:树突状细胞经小鼠结肠癌CT26细胞RNA转染和mIL-12基因修饰后免疫接种小鼠,可在体内有效提呈肿瘤抗原,诱导机体产生高水平的CTL,更有效地诱发特异性抗肿瘤效应。     

人外周血树突状细胞体外稳定、高效培养的新方法

目的:建立稳定、高效的人外周血树突状细胞(dendritic cells,DC)体外培养的新方法。方法:离心获取人外周血白膜层细胞,裂解去除红细胞后获得全部白细胞,贴壁培养1 h获得单核细胞,加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1 000 U/ml 重组人白细胞介素-4(rhIL-4)500 U/ml,体外培养7 d获得DC,以流式细胞术分析表型,体外混合淋巴细胞反应检测细胞抗原提呈功能。结果:从100 ml全血分离获得具有较好活力的贴壁单核细胞仅需2 h;部分肿瘤患者应用传统分离方法不能获得单个核细胞,用新方法仍能从患者外周血稳定地获得足够数量的单核细胞。新方法培养生成DC的数量为传统方法培养生成DC数量的1.8~2.6倍;其中40%~85%为CD1a ,表达高水平的HLA-DR、CD80、CD86,体外可以强烈刺激同种T细胞增殖。结论:建立了更为稳定的、得率更高的DC体外扩增培养的新方法。     

榄香烯复合瘤苗冲激的树突状细胞的功能研究

大多数树突状细胞(Dendritic cell,DC)来源于骨髓.在小鼠、大鼠及人的骨髓中均含有许多DC前体细胞,经体外培养能生成具有典型形态、表型及功能的非成熟的DC,抗原能使非成熟的DC转变为成熟的DC,成熟DC能表达高水平多肽-MHC复合物及共刺激分子CD86(B7-2)及CD40等,能分泌TH1型细胞因子(IL-12),能有效地将抗原提呈给初始型T细胞并使之激活.     

负载腮腺腺样囊性癌抗原的树突状细胞诱导的抗肿瘤效应

目的：探讨腺样囊性癌肿瘤抗原负载的树突状细胞通过淋巴细胞介导的免疫反应,体外杀伤腺样囊性癌细胞的细胞毒性效应。方法：外周血单核细胞在GM—CSF＋IL-4的诱导下体外培养,用肿瘤细胞抗原冲击后,流式细胞仪检测树突状细胞抗原负载前后CD1a、CD83表达量的变化。MTT比色法检测同种异体的混合淋巴细胞反应和诱导细胞毒淋巴细胞CTL杀伤肿瘤细胞。结果：凋亡肿瘤抗原刺激后,CD83表达增加（P〈0．01）,而CD1a表达量下调（P〈0．05）。负荷肿瘤抗原树突状细胞体外诱导出明显的细胞不良反应,并刺激同种T淋巴细胞增殖。结论：GM—CSF＋IL-4诱导的单核细胞来源的树突状细胞,能在体外摄取肿瘤抗原而进一步成熟,通过激活淋巴细胞杀伤癌细胞。     

人急性早幼粒细胞性白血病细胞诱导分化生成树突状细胞的体外研究

树突状细胞(dendritic cells,DC)在激发机体抗白血病T细胞免疫应答中具有重要作用,有报道DC可以由单核细胞及粒细胞分化生成,本研究应用细胞因子在体外诱导了急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞向DC的分化.从M3型APL患者外周血分离白血病细胞,加入GM-CSF(100ng/ml)或GM-CSF(100ng/ml) rhIL-4(500U/ml)体外培养14天,并于培养结束前3天加人TN-α(100ng/ml).结果表明,GM-CSF可以促进白血病细胞体外增殖,并从幼稚状态逐渐分化成熟,表达高水平的CD45分子,其中部分为CD14~ 的单核细胞,部分为CDla~ 的DC(M3DC);培养后期加入TNF-α,可以促进DC生成,约占35%;以GM-CSF IL-4培养也诱导了幼稚细胞的成熟,2周后DC约占10%,但较少单核细胞生成,培养至3周时DC约占60%;而在培养后第11天加入TNF-α则可以加速DC生成,3天后生成的白血病型DC达90%.电镜观察到M3DC具有与单核细胞来源的DC相似的超微结构,但具有的突出特征是部分细胞存在少量胞浆颗粒;M3DC高表达HLA-DR、B7-2、CD40、CD54分子,体外可以强烈刺激同种T细胞增殖.此类由白血病细胞诱导生成的DC可被用于体内外诱导生成肿瘤特异性CTL,在APL的免疫治疗中具有一定的应用价值.     

树突状细胞的肿瘤抗原负载

树突状细胞（DC）是体内功能最强的专职抗原提呈细胞，在诱导特异性抗肿瘤免疫反应中起着至关重要的作用。通过体外负载肿瘤抗原致敏DC可以有效地增强其抗原提呈能力，所制备的肿瘤抗原DC疫苗回输体内后可促进机体产生特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）和其他抗肿瘤免疫应答机制，有效地杀伤肿瘤细胞。目前已发展了多种针对DC负载肿瘤抗原的方法，有些方法已被应用到了人体肿瘤治疗。     

两种不同来源的树突状细胞体外诱导CTL杀瘤作用的研究

目的比较两种不同来源的树突状细胞体外负载肿瘤抗原后激活CTL的杀瘤效果,探讨其在抗肿瘤免疫中的作用.方法分别应用相应的细胞因子组合建立外周血单个核细胞来源和脐血来源DC的培养体系.体外比较两类DC负载K562白血病细胞冻融抗原后激活CTL的杀瘤效果.结果在合适的细胞因子组合下,两种方法都能得到成熟的DC,两种来源的DC在负载了肿瘤抗原后对于CTL肿瘤的杀伤有明显的增效作用.结论外周血和脐血来源的DC功能相似,均可在肿瘤免疫中发挥重要作用.     

树突状细胞疫苗的临床研究进展

 树突状细胞(Dendritic Cells，DC)最先由Steinman在1973年描述，是体内最活跃、功能最强大的专职抗原提呈细胞。DC广泛存在于淋巴组织和非淋巴组织中，在血细胞中占单个核细胞总数的0．5%～1％。在大多数组织中，DC以不成熟形式存在，其MHC、共刺激分子和黏附分子的表达低，不能够有效地捕捉抗原和激活T细胞。而多种细胞因子能够在体外培养中刺激外周血、骨髓和脐血中DC前体，如在GM-CSF、IL-4和TNF-a的作用下，产生成熟的树突状细胞。     

树突状细胞与胃癌免疫治疗的研究进展

树突状细胞（DC）是机体重要的专职抗原提呈细胞,参与多种生理病理过程,其数量与功能改变与肿瘤的发生发展密切相关。在胃癌组织中,DC的数量与成熟度的降低使肿瘤易于进展与转移,并影响患者预后。DC经体外培养、刺激成熟和负载肿瘤抗原后回输患者体内,可诱导特异性抗肿瘤细胞免疫反应,发挥抗肿瘤作用。以DC为基础的肿瘤免疫治疗已显示出良好的临床应用前景,有望成为肿瘤治疗体系中一种新手段。     

单核细胞条件培养基对体外培养人血液树突状细胞的促成熟作用

树突状细胞 (dendritic cell,DC)为基础的新型肿瘤疫苗正在临床试验中。目前的多种制备方法中,以动员人外周造血祖细胞为主要细胞来源,用血细胞分离机分离、体外加入 GM-CSF和 IL-4培养扩增制备树突状细胞是一种新的制备技术,具有获得的细胞数量多、均质性好等优点 [1]。但是,在 GM-CSF和 IL-4中培养 2周得到的仍是未成熟的树突状细胞。未成熟树突状细胞具有很强的摄取和加工处理抗原的功能,但它们刺激处女型 T细胞的能力则很弱,因此在瘤苗制备步骤中,用肿瘤抗原冲击致敏树突状细胞后,必须先加入促成熟因子使之进入成熟期,然后才能回输给患者 [2]。单核细胞条件培养基（ monocyte condictioned medium, MCM）和脂多糖（ lipopolysaccharide, LPS）是两种较好的促成熟因子 [3～ 5],本实验研究了这两种因子应用于人外周造血祖细胞来源的树突状细胞后细胞形态和共刺激分子和 MHC分子表达的变化,为制备新型瘤苗筛选合适的技术途径。     

负载酸洗抗原肽的树突状细胞诱导抗膀胱癌的作用

目的研究弱酸洗脱法提取抗原肽致敏的树突状细胞(DCs)诱导针对膀胱癌细胞的特异性杀伤效应。方法弱酸洗脱法获得BI U-87细胞抗原肽,用GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导正常人DC并负载肿瘤抗原,进而激活T淋巴细胞;用MTT法检测其对BI U-87体外杀伤效应。结果弱酸可以洗脱肿瘤细胞膜表面大部分与MHC-Ⅰ类分子结合的抗原肽;外周血单个核细胞可培养出DC;效靶比40:1时负载膀胱癌抗原肽的DC诱导特异性CTLs可杀伤高达(78.5±7.0)%的BI U-87细胞。结论弱酸可以有效洗脱肿瘤细胞表面的Ⅰ类抗原肽,负载该类多肽的DC在体外可诱导出高效而特异的抗膀胱癌效应。     

人脐血树突状细胞抗神经胶质瘤的体外免疫效应研究

目的　研究肿瘤抗原致敏的树突状细胞 (DC)对神经胶质瘤细胞的免疫杀伤效应。方法　应用免疫磁珠分选脐血 CD34细胞 ,经 SCF FL3 GM- CSF IL- 4 TNF- α的联合诱导培养 DC,采用相差显微镜观察树突状细胞的形态 ;流式细胞仪作 DC的表面标志检测 ;MTT比色法测定同种异型的混合淋巴细胞反应能力和诱导CTL 毒性的检测。结果　 (1)脐血 CD34细胞在体外经细胞因子联合刺激后呈典型的 DC形态 ;(2 )流式检测 CD4 0、CD80和 CD86等成熟 DC特异性表面标志呈高表达 ,分别与诱导前比较 ,差异均有显著性 ;(3) MTT法测得脐血来源的 DC较外周血 DC刺激同种异体 T淋巴细胞增殖能力弱 ;经肿瘤抗原负载的 DC体外诱导出较强 CTL 毒性。结论　脐血 CD34细胞经体外扩增诱导的 DC具有典型的 CTL 毒性 ,为临床应用脐血来源 DC抗神经胶质瘤的生物治疗提供了理论依据     

负载Walker-256肿瘤细胞抗原的树突状细胞疫苗的制备

目的 制备负载大鼠Walker-256肿瘤细胞抗原的树突状细胞(DC)疫苗,为进一步研究打下基础.方法 从大鼠骨髓细胞中利用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介导素4(IL-4)在体外定向诱导分化出DC,以液氮冻融法制备肿瘤抗原刺激DC制备肿瘤疫苗.ELISA检测培养液中IL-12的浓度.结果 得到大量具备典型光镜和电镜形态特征的DC,表达大鼠DC特异性标志OX62.负载抗原前后DC产生IL-12的水平存在明显差异(P＜0.05).结论 负载Walker-256肿瘤抗原的树突状细胞疫苗制备成功,具有促进Th1极化的潜能.     

白细胞介素24对人树突状细胞活化和成熟的诱导作用

目的: 〖HT5"SS〗研究白细胞介素24（interleukin24,IL24）对人外周血单核细胞来源树突状细胞（dendritic cell, DC）表型及抗原提呈功能的影响。〖HT5W〗方法： 〖HT5"SS〗利用Western blot检测DC培养上清中IL24的分泌水平;利用半定量RTPCR方法分析不同条件下DC表达IL24受体及趋化因子受体的情况;通过流式细胞术分析检测IL24共培养后DC细胞表面CD80、CD86、MHCⅡ类分子的表达水平;采用体外混合淋巴细胞实验分析经IL24共培养对DC抗原提呈功能的影响。〖HT5W〗结果：〖HT5"SS〗 体外培养过程中,用LPS刺激DC可诱导其分泌IL24;同时,LPS还能上调DC表达IL24受体亚单位IL22R1。IL24作用于DC可上调DC细胞表面CD80、CD86及MHCⅡ类分子的表达,并增强DC对T细胞的抗原提呈功能。〖HT5W〗结论： 〖HT5"SS〗IL24这一新型的细胞因子在体外实验中能促进DC的表型成熟,增强DC的抗原提呈功能。     

肿瘤抗原致敏树突状细胞治疗胶质瘤的实验研究

 目的　研究肿瘤冻融抗原致敏树突状细胞 (DC)治疗胶质瘤的疗效。方法　从大鼠骨髓中分离出单核细胞后 ,加入添加rGM CSF和rIL 4的IMDM培养基中培养后鉴定。制备大鼠C6胶质瘤冻融抗原以及DC疫苗 ,同时肿瘤冻融抗原致敏DC体外细胞毒试验 ;建立动物模型 ,体内应用DC疫苗并观察疗效。结果　单核细胞培养 8天后可获得大量的树突状细胞 ;体外细胞毒试验发现对相应的C6肿瘤细胞有明显的杀伤作用 ;动物实验发现治疗组肿瘤生长明显抑制 ,而对照组肿瘤明显生长 ,两组肿瘤体积有显著性差异P <0 .0 1。结论　建立了体外扩增大鼠骨髓DC以及制备DC疫苗的方法 ,采用冻融抗原致敏DC疫苗治疗荷瘤动物生存时间明显延长 ,肿瘤生长明显抑制 ,为研究其在脑胶质瘤临床免疫治疗打下基础