DFMG调节TLR4信号通路对氧化损伤的内皮细胞诱导巨噬细胞增殖的影响

目的:观察7-二氟甲氧基-5,4'-二甲氧基金雀异黄素(DFMG)对氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞(HUVE-12)诱导的THP-1(人单核细胞系)源性巨噬细胞(MΦ)增殖的影响及探索其可能的发生机制.方法:制备溶血性磷脂酰胆碱(LPC)氧化损伤HUVE-12与MΦ 共培养模型,浓度梯度DFMG、TLR4特异性拮抗剂(CLI-095)、TLR4特异性激动剂(LPS)干预LPC氧化损伤HUVE-12与MΦ 共培养;MTT法观察MΦ 的增殖;western blot检测HUVE-12 TLR4蛋白的表达水平.结果:LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞增殖,DFMG抑制LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞的增殖,上调TLR4表达进一步促进LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞的增殖,下调TLR4表达抑制LPC氧化损伤HUVE-12诱导巨噬细胞的增殖.结论:DFMG可能通过下调LPC氧化损伤HUVE-12的TLR4蛋白表达水平,抑制炎症反应,从而抑制巨噬细胞增殖.     

晚期糖基化产物通过RAGE/TLR4/STAT1信号通路诱导巨噬细胞M1型极化

目的 探讨晚期糖基化产物(AGEs)诱导巨噬细胞发生M1型极化的分子机制.方法 提取小鼠骨髓细胞并分离培养原代M0型巨噬细胞.分别用Toll样受体4(TLR4)及AGEs受体(RAGE)特异性抑制剂TAK-242及FPS-ZM1对获得的M0型巨噬细胞进行预处理.制备AGEs并以2.5、5及10μmol/L浓度处理巨噬细胞.流式细胞术检测细胞内活性氧簇(ROS)水平;免疫荧光染色观察M1型巨噬细胞表面标记物诱导性一氧化氮合酶(iNOS)表达;酶联免疫吸附试验法对巨噬细胞分泌的炎性因子浓度进行检测;Western blot检测相关浆蛋白及核蛋白的相对表达水平.结果 AGEs刺激可使巨噬细胞内ROS水平、分泌炎性因子浓度、细胞质TLR4、磷酸化信号转导与转录激活因子1(p-STAT1)以及STAT1核转位水平显著升高(P均<0.001),巨噬细胞表面iNOS表达水平显著升高(P均<0.001),且均具有显著的AGEs浓度依赖性(P均<0.001).TAK-242预处理对AGEs诱导的巨噬细胞iNOS表达,细胞内ROS水平及TLR4表达水平无显著影响,可显著降低AGEs诱导的巨噬细胞iNOS表达,分泌炎症因子浓度(P均<0.001)、细胞p-STAT1表达水平及STAT1核转位水平(P均<0.001).FPS-ZM1预处理可显著抑制AGEs诱导的巨噬细胞内ROS水平(P<0.001)、分泌炎症因子浓度(P均<0.001)、细胞TLR4及p-STAT1表达水平(P均<0.001)以及STAT1核转位水平(P<0.001).结论 AGEs可通过RAGE/ROS/TLR4/STAT1信号通路诱导巨噬细胞向M1型极化.     

芍药苷对高糖刺激的小鼠骨髓来源的巨噬细胞TLR4信号通路的影响

目的 探讨芍药苷( PF)对高糖刺激的小鼠骨髓来源的巨噬细胞( BMDMs) Toll 样受体4 ( TLR4)信号通路的影响.方法 分离骨髓来源的巨噬细胞作为研究对象,高糖作为刺激因素,芍药苷作为干预因素分组.将BMDMs分为7组:正常糖对照组( LG 组)、正常糖对照 +PF 组( LG +PF组)、高糖刺激组(HG组)、高糖刺激+PF组( HG+PF组)、TLR4 -/ -对照组(TLR4 -/-组)、TLR4 -/ -对照+高糖刺激组(TLR4 -/ -+ HG 组)、 TLR4 -/ -对照 + 高糖刺激 + PF 组(TLR4-/ -+HG+PF组).流式细胞术鉴定巨噬细胞的纯度及成熟度;CCK-8 检测 PF对 BMDMs活力的影响;Transwell检测各组BMDMs 的趋化功能;激光共聚焦法检测各组的TLR4和诱生型一氧化氮合酶( iNOS)的协同表达;qRT-PCR测定各组细胞中的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β (IL-1β)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)及iNOS mRNA的转录表达;Western blot法检测各组总蛋白中iNOS、TLR4、髓样分化因子88( MyD88)、TIR结构域衔接蛋白( Trif)、磷酸化白介素-1受体相关激酶(p-IRAK1)、磷酸化干扰素调节因子3(p-IRF3)、核因子κB(NF-κB)p65和NF-κBp-p65蛋白的表达;ELISA法检测各组细胞培养上清液中促炎因子TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌情况.结果 与LG组比较,高糖刺激可以增加巨噬细胞的趋化功能;明显上调细胞TNF-α、IL-1β、MCP-1及iNOS mRNA的转录表达(P＜0. 01);同时HG组的iNOS 及 TLR4、MyD88、Trif、p-IRF3、NF-κBp65 和 NF-κBp-p65等信号通路蛋白表达水平明显增强(P＜0. 01);细胞培养上清液中分泌的 TNF-α、 IL-1β 及 MCP-1 水平增高( P ＜0. 01). PF和敲除TLR4基因均可以抑制高糖刺激导致的巨噬细胞的激活效应.结论 高糖可以诱导BMDMs细胞内的TLR4及下游信号传导通路表达上调,同时使巨噬细胞激活导致促炎因子表达上调;PF和敲除TLR4基因均可抑制TLR4信号通路的激活,并且使巨噬细胞促炎因子的表达下调.     

Toll样受体4抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ加重血脂蓄积的分子机制

目的 选取高脂饮食模型大鼠和氧化低密度脂蛋白(oxLDL)暴露下巨噬细胞模型,验证在血脂蓄积过程中Toll样受体4(TLR4)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的具体干预机制。 方法 健康雄性Wistar大鼠20只,随机分为对照组和高脂组,每组10只。测定各组大鼠总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白水平,采用苏木精-伊红染色检测颈动脉血管内膜中膜厚度比,采用Western blotting法检测TLR4、PPARγ蛋白表达水平。体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,以oxLDL(50 mg/L)刺激巨噬细胞制备模型,且应用siRNA-TLR4沉默巨噬细胞内的TLR4因子制备TLR4沉默模型,将细胞分为空白组(A组)、oxLDL组(B组)、oxLDL+siRNA组(C组)、oxLDL+siRNA-TLR4组(D组)、oxLDL+siRNA-TLR4+PPARγ激动剂组(E组)、oxLDL+siRNA-TLR4+PPARγ抑制剂组(F组)。采用油红O染色法观察巨噬细胞内血脂蓄积情况,定量检测巨噬细胞内胆固醇含量,采用Western blotting法检测 TLR4、PPARγ蛋白表达水平。 结果 在动物模型实验中,与对照组相比,高脂组总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平、颈动脉内膜中膜厚度比、TLR4蛋白相对表达含量明显增高(P<0.01),血清高密度脂蛋白水平、PPARγ蛋白相对表达含量明显降低(P<0.01),且TLR4与PPARγ呈负相关性(r=-0.928 1,P<0.001)。在oxLDL暴露巨噬细胞实验中,与A组比较,B、C组巨噬细胞内胆固醇含量、油红O颗粒、光密度值及TLR4蛋白相对表达含量明显增多(P<0.01),PPARγ蛋白相对表达含量明显减少(P<0.05),且B组TLR4与PPARγ呈负相关性(r=-0.986 7,P<0.001)。与B组相比,C组巨噬细胞内胆固醇含量、油红O颗粒、光密度值及TLR4、PPARγ蛋白相对表达含量未见明显改变(P>0.05)。与B组相比,D组巨噬细胞内胆固醇含量、油红O颗粒及光密度值及TLR4蛋白相对表达含量明显减少(P<0.01),PPARγ蛋白相对表达含量明显增多(P<0.05)。与D组相比,E组巨噬细胞内胆固醇含量、油红O颗粒及光密度值明显减少(P<0.01),PPARγ蛋白相对表达含量明显增多(P<0.05),TLR4蛋白相对表达含量未见明显改变(P>0.05)。与D组相比,F组巨噬细胞内胆固醇含量、油红O颗粒及光密度值明显增多(P<0.01),PPARγ蛋白相对表达含量明显减少(P<0.05),TLR4蛋白相对表达含量未见明显改变(P>0.05)。 结论 细胞内的血脂蓄积是动脉粥样硬化形成的机制之一,PPARγ可以抑制巨噬细胞血脂蓄积进而参与动脉粥样硬化调节,是巨噬细胞血脂蓄积过程的保护性因子。而TLR4作为PPARγ上游调控位点,通过抑制PPARγ的表达,加重血脂蓄积的过程,进而干预动脉粥样硬化进程。     

升降散对LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞NF-κB信号的影响

目的?研究升降散对LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)TLR4表达及其下游NF-κB信号通路的影响。方法?用不同浓度LPS（0、2、10?μg/mL）诱导NR8383细胞,采用Real-time PCR和Western Blotting分别检测TLR4的mRNA和蛋白表达水平。用带有NF-κB的质粒转染NR8383细胞,双荧光素酶报告基因检测NF-κB活性,Western Blotting检测磷酸化p65表达水平,Real-time PCR检测细胞因子TNF-α、A20、IL-6和IL-1β的mRNA表达水平,ELISA检测细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。将升降散作用于LPS成功诱导NF-κB上调的NR8383细胞,Real-time PCR、Western Blotting、双荧光报告基因检测和ELISA实验检测升降散在NR8383细胞中对LPS诱导NF-κB信号通路的影响。结果?LPS成功诱导NR8383细胞中NF-κB上调,在蛋白表达和mRNA表达水平均证实,LPS能梯度诱导TLR4高表达,且与LPS浓度呈正相关;同时,LPS能够诱导TLR4下游NF-κB的激活,增加下游靶基因编码细胞因子的合成与分泌,且与LPS浓度呈正相关。10?μg/mL升降散作用NR8383细胞后,能抑制LPS诱导TLR4的高表达和下游NF-κB的激活。结论?LPS能梯度诱导NR8383细胞中TLR4的高表达及其下游NF-κB的激活,升降散能够显著抑制该诱导作用。      

Src、Fyn激酶对脑缺血/再灌注大鼠海马NMDA受体NR2A亚基磷酸化水平的影响

目的观察脑缺血再灌注后海马Src家族酪氨酸蛋白激酶（Src family of protein tyrosine kinase,SrcPTKs）成员Src、Fyn激酶对NMDA受体（N-methyl-D-aspartate receptors,NMDAR,NR）NR2A亚基磷酸化水平的影响。方法采用Pulsinelli-Brierley四动脉阻断（four-vessel occlusion,4-VO）大鼠全脑缺血模型,缺血前连续3天脑室注射Src、Fyn反义寡核苷酸（antisense oligode oxynucletides,AS-ODNs）及错义寡核苷酸组（missenseoligodeoxynucletides,MS ODNs）后缺血15 min,用免疫沉淀和免疫印迹法检测NR2A亚基酪氨酸磷酸化水平的变化。结果Fyn反义寡核苷酸使脑缺血再灌注海马NR2A亚基磷酸化水平下降,而Src反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注海马NR2A亚基磷酸化水平影响更加明显。结论脑缺血/再灌注过程中NMDA受体NR2A亚基的磷酸化主要是由Src激酶介导的。     

粘附斑激酶信号转导与串话研究进展

粘附斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是细胞质中的非受体酪氨酸蛋白激酶,分子量125 kD,缺乏跨膜区[1],但包含SH2和SH3结合序列.它包含6个可以被磷酸化的酪氨酸,即Tyr397、Tyr407、Tyr576、Tyr577、Tyr861、Tyr925.氨基端Tyr397是主要的自主磷酸化部位,可与Src家族(Src、Yes、Fyn等)的SH2结构域结合;在激酶区的活化环内Tyr576和Tyr577是Src家族激酶磷酸化的主要部位[2],其次是羧基端的Tyr861和Tyr925,Tyr861磷酸化可参与纤维原细胞中Ras信号通路[3],Tyr925磷酸化可参与磷酸二酯酶alpha/ATX调控髓鞘形成过程[4].     

地塞米松对肺损伤小鼠肺巨噬细胞TLR4原位表达的影响

目的:探讨地塞米松(DEX)对失血性休克诱导的急性肺损伤小鼠肺巨噬细胞TLR4原位表达的影响.方法:C57BL/6雄性小鼠45只,复制失血性休克诱导的急性肺损伤模型前经鼻分别滴入PBS、PBS+20ug DEX,阴性空白对照组经鼻滴入PBS后仅与予心脏穿刺,分别于0h、1h、2h、4h和6h时取出小鼠的肺组织.通过HE染色法检测肺组织病理,免疫荧光双染检测肺巨噬细胞TLR4表达.结果:失血性休克后6h内肺巨噬细胞TLR4的表达呈上升趋势并于6h时达到峰值,DEX干预组可见显著抑制肺巨噬细胞TLR4表达.结论:地塞米松能显著抑制失血性休克诱导的急性肺损伤小鼠肺巨噬细胞TLR4原位表达,改善肺部病理改变.     

组蛋白去乙酰化酶SIRT1调控氧化低密度脂蛋白诱导巨噬细胞凋亡的表达

目的 观察组蛋白H3赖氨酸残基9乙酰化(H3K9Ac)在氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导的巨噬细胞凋亡模型中的表达,探讨组蛋白去乙酰化酶——炎症因子沉默信息调节蛋白1(SIRT1)对组蛋白乙酰化的影响,及其通过基因表观遗传学作用,经氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)通路调控巨噬细胞凋亡的机制。方法 培养BALB/c小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7),并加入oxLDL构建巨噬细胞模型。将细胞分为对照组(加入双蒸水)和实验组(加入50μg/mL oxLDL),分别检测两组细胞凋亡及白细胞介素(IL-6)、SIRT1、H3K9Ac和PPARγ的蛋白表达水平。另外,将实验组细胞分别给予SIRT1兴奋剂(白藜芦醇,终浓度50 nmoL/L)和SIRT1抑制剂(尼克酰胺,终浓度50 nmoL/L),观察SIRT1过表达或抑制对oxLDL诱导巨噬细胞模型中细胞凋亡及SIRT1、H3K9Ac、PPARγ和磷酸化过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Ser112位点)[pPPARγ(S112)]的蛋白表达水平的影响。采用Hoechst荧光凋亡染色法检测各组细胞凋亡;采用Western blotting...     

莱菔硫烷对oxLDL诱导巨噬细胞泡沫化及氧化应激的影响及机制

目的探讨十字花科蔬菜食物活性成分莱菔硫烷(SFN)对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导巨噬细胞泡沫化及氧化应激的影响及机制。方法采用oxLDL负荷J774A.1细胞建立巨噬泡沫细胞模型,观察SFN预处理24 h对oxLDL诱导巨噬细胞泡沫化和氧化应激的影响,其中泡沫细胞形成采用油红O染色观察和定量,细胞内活性氧自由基(ROS)水平采用流式细胞术检测。机制分析:SFN干预J774A.1细胞24 h后,采用RT-qPCR和Western blot检测CD36表达,采用Western blot检测PPARγ、Nrf2蛋白表达。结果与oxLDL诱导的巨噬泡沫细胞模型组相比,5、10μmol/L SFN预处理24 h显著降低了J774A.1细胞内脂质蓄积(F=39.73,P0.01)且呈剂量依赖性抑制效应,同时抑制了oxLDL诱导的细胞内ROS水平升高(F=39.94,P0.01)。机制研究显示,SFN干预24 h剂量依赖性降低J774A.1细胞清道夫受体CD36基因和蛋白表达(F=15.11、13.05,P均0.01),并伴有PPARγ蛋白表达水平下调(F=19.60,P0.01),以及Nrf2蛋白表达水平升高(F=52.73,P0.01)。结论 SFN具有抑制oxLDL诱导巨噬细胞泡沫化和氧化应激的功效,其机制可能涉及经PPARγ-CD36通路抑制巨噬细胞胆固醇摄入及诱导Nrf2表达。