辛伐他汀抑制PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖及对细胞表型转换的影响

目的 探讨辛伐他汀对血小板源生长因子(PDGF-BB)诱导增殖的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)抑制细胞表型转换及其可能的信号调节机制.方法 以体外培养SD大鼠PASMC为研究对象,PDGF-BB进行诱导,辛伐他汀及RhoA/Rho激酶抑制剂Y-27632进行干预,流式细胞术检测PASMC的增殖,荧光定量RT-PCR 检测各组PASMC α-SM-actin mRNA的表达及Western blot 检测各组PASMC α-SM-actin、SM22α和RhoA蛋白的表达.结果 辛伐他汀及Y-2763在抑制PDGF-BB诱导的PASMC增殖的同时,促进了主要收缩表型蛋白α-SM-actin mRNA 的表达,促进α-SM-actin 、SM22α这两种收缩表型蛋白表达,同步地相应抑制了RhoA蛋白表达.结论 辛伐他汀在抑制PDGF-BB介导的PASMC增殖的同时,也抑制了PASMC细胞表型的转换,而且该作用可能通过抑制RhoA/Rho激酶信号通路实现.     

人参皂苷CK对PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖和表型转换的影响及机制

  目的   探讨人参皂苷CK（ginsenoside compound K, CK）对体外培养肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs）增殖、表型转换的影响和相关机制。   方法   以体外培养的PASMCs为研究对象,血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB）为诱导剂,CK为干预剂。实验分为对照组（不做处理）、模型组（给予20 ng/mL PDGF-BB）和干预组（同时给予20 ng/mL PDGF-BB+5 μmol/L CK）。CCK-8法检测细胞增殖情况〔在上述分组的基础上,将干预组CK浓度设为1、3、5 μmol/L,并增设药物组（分别予以1、3、5 μmol/L CK）〕,流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况,实时荧光定量PCR和Western blot检测各组细胞表型转换标志基因α-肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）和平滑肌22α蛋白（smooth muscle 22α, SM22α）mRNA和蛋白的表达,Western blot检测Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路相关蛋白表达。   结果   与模型组比较,CK以剂量依赖性的方式抑制PDGF-BB诱导的PASMCs增殖,5 μmol/L CK干预时结果与对照组无明显差异（P>0.05）,故后续实验CK浓度选用5 μmol/L;CK以1、3、5 μmol/L剂量单独与PASMCs孵育,未发现细胞毒性作用（P>0.05）;CK将细胞周期阻滞于G₀/G₁期,促进PASMCs的凋亡,并逆转α-SMA、SM22α的mRNA和蛋白表达（P<0.01）;同时CK下调β-catenin蛋白和细胞周期蛋白D1（cyclinD1）的表达,并上调磷酸化糖原合酶激酶3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3β, pGSK-3β）/糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）蛋白表达（P<0.01）。   结论   CK抑制异常的PASMCs增殖并逆转了表型转换,其作用机制可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。提示CK可能具有控制肺动脉高压的治疗潜力。     

低氧致人肺动脉平滑肌细胞PKGIa表达变化与细胞表型的研究

目的观察低氧对人肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC）细胞表型的影响以及不同细胞表型下蛋白激酶G Ia（protein kinase GIa,PKGIa）mRNA及其蛋白表达水平变化,探讨PKGIa信号途径与低氧PASMCs表型转换中的可能调控作用。方法组织块法培养人PASMC。采用RT-PCR和免疫细胞化学法检测常氧组（N组）、低氧12、24h组PASMCs内平滑肌α肌动蛋白（smooth muscle α actin,SM-α-actin）mRNA及蛋白的表达水平变化;同时采用RT-PCR及Western blot检测PKGIa基因mRNA以及相应的蛋白的表达水平。结果各组均检测出SM-α-actin、PKGIa的mRNA以及蛋白表达的变化。低氧刺激下,PASMCs内SM-α-actin的mRNA及蛋白表达水平明显降低;同时PKGIa的mRNA以及蛋白表达表达逐渐降低。结论PKGIa可能在低氧致人PASMCs表型改变中有重要的调控作用。     

血管平滑肌细胞表型转换与动脉粥样硬化关系的研究进展

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心肌梗死、脑卒中等急性心脑血管事件的主要原因,是多种细胞参与的复杂病理过程。作为AS斑块内的主要细胞,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)由收缩表型向其他表型的转换在AS的形成和进展中发挥着关键作用。     

microRNA调控平滑肌细胞分化和表型转换的分子机制研究进展

生理情况下,血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）保持分化和收缩状态,当发生血管增殖性疾病时,平滑肌细胞就由分化状态转换为去分化状态,获得增殖、迁移及合成分泌细胞外基质的能力,可导致血管腔狭窄而引起一系列的临床症状。研究表明,多种分子参与了平滑肌细胞的表型转换调控。本文就microRNA在血管平滑肌细胞表型转换中的调控作用进行阐述。     

白杨素抑制血小板源性生长因子诱导的血管平滑肌细胞迁移和表型转换

目的 研究白杨素对血小板源性生长因子(PDGF)-BB诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移和表型转换的影响及可能的分子机制。方法 采用Transwell小室法评价白杨素对PDGF-BB诱导的VSMCs迁移的影响,Western blot法测定收缩型VSMCs标志蛋白:α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌22α(SM22α)和结蛋白的表达水平,以及AKT和糖原合酶激酶(GSK)3β的总蛋白和磷酸化蛋白水平。结果 20ng/ml PDGF-BB明显促进VSMCs迁移,而12.5μmol/L白杨素预处理能显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCs迁移;20ng/ml PDGF-BB显著降低VSMCs中α-SMA、SM22α和结蛋白的蛋白表达水平,而12.5μmol/L白杨素预处理能逆转这些标志蛋白的下调;20ng/ml PDGF-BB显著升高VSMCs中AKT和GSK3β磷酸化表达水平, 12.5μmol/L白杨素预处理几乎完全阻断PDGF-BB诱导的这些信号分子的磷酸化。结论 白杨素显著抑制PDGF-BB诱导的VSMCs迁移,并能阻止PDGF-BB诱导的VSMCs收缩表型向合成表型转换,其机制可能部分与抑制AKT信号通路活化有关。     

乌司他丁通过上调PPAR-γ抑制低氧诱导的肺血管平滑肌细胞表型转换

目的探讨乌司他丁对低氧诱导的肺血管平滑肌细胞（PASMCs）表型转化的影响及其分子机制。方法体外培养SD大鼠 PASMCs,随机分组4组：正常组（N组）,常氧+乌司他丁组（NU组）,低氧组（H组）,低氧+乌司他丁组（HU组）,各组培养24 h后 采用免疫荧光检测SM-α-actin和Calponin表达水平,应用CCK-8法、3H-TdR和Transwell小室检测各组PASMCs增殖和迁移。 并分别利用Western blotting和荧光素酶报告质粒检测PPAR-γ蛋白表达和转录活性。采用PPAR-γ抑制剂GW9662进行预处理 干预乌司他丁对低氧诱导的PASMCs表型转化的影响,分析干预后PASMCs增殖和迁移改变。结果低氧条件下,乌司他丁能 促进PASMCs 中SM-α-actin 和Calponin 的表达（P<0.05）,抑制PASMCs 的增殖和迁移能力（P<0.05）,同时乌司他丁上调 PPAR-γ的表达（P<0.05）。采用GW9662预处理后,乌司他丁对低氧诱导的PASMCs表型转换的抑制作用显著下降（P<0.05）。 结论乌司他丁通过上调PPAR-γ抑制低氧诱导的PASMCs表型转换。     

血管平滑肌细胞表型转化与骨架蛋白表达之间的关系

目的:探讨体外培养血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型与细胞骨架蛋白表达之间的生物学意义.方法:体外培养大鼠主动脉VSMCs,实验分组为:对照组、血清饥饿组、血清再培养组,RT-PCR检测表型基因平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha,SM22α)mRNA的表达;免疫细胞化学检测细胞骨架蛋白F-肌动蛋白(F-actin)的表达.结果:在体外培养条件下,对照组SM22α表达较低,细胞呈多角形或短梭形,细胞多有板状突起,F-actin的荧光强度明显减低;血清饥饿组SM22α表达恢复上调,VSMCs多细长,呈梭形,少见分裂相细胞,F-actin的荧光强度升高;血清再培养后SM22α表达减少,细胞呈增殖状态,见核分裂现象,F-actin的荧光强度减低.结论:VSMCs的表型和细胞骨架形态和数量表达之间有着重要的相互联系,它们在维持细胞功能、血管重构及在心血管疾病(高血压、动脉粥样硬化)的发生、发展中起重要作用.     

大鼠子宫动脉和冠状动脉平滑肌细胞表现型的差异

目的:探讨大鼠体内雌激素对子宫动脉和冠状动脉的作用与两者的平滑肌细胞(SMC)表现型的关系.方法:HE染色观察子宫动脉和冠状动脉的的组织形态学结构.间接免疫荧光染色比较子宫动脉和冠状动脉SMC中平滑肌特异性肌动蛋白α-SM actin和非肌细胞型肌动蛋白β-NM actin平均荧光强度.Western blot检测子宫动脉和冠状动脉SMC的α-SM-actin和β-NM-actin含量,并检测β-雌二醇刺激下两者β-NM actin含量变化情况.结果:冠状动脉SMC以收缩型SMC为主,高表达α-SM actin;子宫动脉SMC以合成型SMC为主,高表达β-NMactin.在生理浓度β-雌二醇刺激下子宫动脉SMC的β-NM actin含量显著上升.结论:冠状动脉和子宫动脉的SMC表现型存在明显差异,前者显示收缩型SMC特点,后者接近合成型SMC.雌激素能够刺激合成型SMC的增殖.     

缺氧时肺腺泡内动脉中膜平滑肌细胞表型变化

观察了减压缺氧不同时间Ｗｉｓｔａｒ大鼠肺腺泡内动脉中膜平滑肌细胞（ＳＭＣ）表型情况。主要发现：（１）缺氧３～４０ｄ组，肺动脉压（ＰＡＰ）持续显著升高，右心肥厚程度逐渐加重。（２）缺氧１～５ｄ组，中膜ＳＭＣ仍为收缩表型，胞间胶原分布略有所增加；缺氧７ｄ组，于近内弹力层处少数ＳＭＣ转变为合成表型，还有些细胞向合成表型部分转化，胞间胶原增多；缺氧１４～４０ｄ组，与合成分泌功能有关细胞器及胶原分布仍较缺氧１～５ｄ组ＳＭＣ为多，少数ＳＭＣ仍呈部分合成表型，大多数ＳＭＣ又出现收缩表型的特征。提示：随缺氧时间延长，ＩＡＡ中膜ＳＭＣ表型可能存在动态变化，但与ＰＡＰ的变化不呈平行关系。原因有待探讨。     

内皮素－1诱导肺动脉平滑肌细胞的趋化反应

本实验发现ＥＴ－１可诱导肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）的趋化反应，１０~（－１２）～１０~（－９）ｍｏｌ／ＬＥＴ－１可剂量依赖地促进ＰＡＳＭＣ的趋化反应，而高浓度的ＥＴ－１（１０~（－８）～１０~（－６）ｍｏｌ／Ｌ）对ＰＡＳＭＣ的趋化作用减弱，内皮素Ａ型受体的特异拮抗剂ＢＱ１２３可抑制ＰＡＳＭＣ对ＥＴ－１的趋化反应，此外还观察到缺氧可促进ＰＡＳＭＣ对ＥＴ－１的趋化反应。提示ＥＴ－１可能对缺氧性肺血管结构重组中平滑肌细胞及其前体的迁移具有重要作用。     

miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用

【目的】观察miR-34a在低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用并探讨其可能的机制。【方法】原代分离和培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）,并给予3%低氧处理后,用Real-time PCR法检测miR-34a和Notch1mRNA在大鼠PASMC中的表达;低氧条件下用细胞转染法过表达和抑制miR-34a、沉默Notch1基因的表达后用EDU法观察细胞增殖情况,并用Real-time PCR和Western blot法检测细胞核增殖抗原PCNA的表达。【结果】分离和培养大鼠PASMC并给予3%低氧处理后,大鼠PASMC中miR-34a表达明显降低,且低氧48h降低较明显,组间差异有统计学意义（P<0.05）。而Notch1的表达明显增高,且48h增高较明显,组间差异有统计学意义（P<0.05）。此外,过表达miR-34a和沉默Notch1后会显著抑制低氧引起的细胞增殖,抑制miR-34a的表达后则会促进细胞增殖,且组间差异有统计学意义（P<0.05）。【结论】在低氧诱导的PASMC细胞增殖过程中miR-34a参与了PASMC的增殖过程,且可能是通过上调Notch1引起了细胞增殖。     

异搏定对缺氧和缩血管物质促肺动脉平滑肌细胞增生的影响

采用~３Ｈ－ＴｄＲ掺入、结晶紫染色以及ＰＣＮＡ免疫细胞化学方法观察异搏定对缺氧和４种缩血管物质促肺动脉平滑肌细胞增生的影响。结果发现：①４种缩血管物质（ＥＴ－１、ＡＴⅡ、Ａ_（２３１７８）、ＫＣｌ）均有不同程度的促肺动脉平滑肌细胞（ＰＡＳＭＣ）ＤＮＡ合成的作用,其作用可被Ｃａ~（２＋）通道阻滞剂异搏定阻断;②缺氧所致ＰＡＳＭＣ增殖的３项指标变化同样可被异搏定阻断。表明［Ｃａ~（２＋）］ｉ升高可能为缺氧和缩血管物质引起肺血管ＳＭＣ收缩和增生的信息传递的共同途径。     

二苯乙烯苷抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的机制研究

目的 建立PDGF-BB诱导的原代大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary vascular smooth muscle cells,PASMCs)增殖的细胞模型,并探讨二苯乙烯苷(2,3,5,4-tetrahydroxyl diphenylethylene-2-o-glucoside,TSG)对PASMCs增殖的影响及其机制,为肺血管重构防治寻找新药物。方法 采用酶消化法分离培养大鼠原代PASMCs,通过20ng/ml PDGF-BB诱导PASMCs增殖建立细胞模型,采用1~100μmol/L TSG干预PDGF-BB诱导的PASMCs增殖,通过CCK-8检测PASMCs增殖及TSG的细胞毒作用,BRDU检测DNA的合成,流式细胞仪分析细胞周期,实时定量PCR(RT-PCR)检测CyclinD1、CyclinE、CDK2/4/6 mRNA的表达,Western blot法检测总的和磷酸化AKT/GSK3β的表达。结果 CCK-8检测结果表明TSG抑制PDGF-BB诱导的PASMCs增殖及DNA合成具有浓度依赖性,并且实验浓度的TSG对PASMCs无明显毒性不良反应;流式细胞仪分析结果表明TSG能够阻滞细胞周期于G₀/G₁~S期,RT-PCR结果表明TSG能够抑制CyclinD1、CyclinE、CDK2/4/6 mRNA的表达;Western blot法检测结果表明TSG能够抑制AKT/GSK3β活化。结论 TSG通过阻滞细胞周期于G₀/G₁~S抑制PDGF-BB诱导的PASMCs增殖。TSG抑制PASMCs增殖与抑制AKT/GSK3β信号通路的活化有关。     

酶消化法分离培养原代肺动脉平滑肌细胞及免疫组化鉴定

目的建立体外胶原酶消化法分离培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)及免疫鉴定的方法。方法采用I型胶原酶对PASMCs进行体外培养。在无菌环境下,分离提取雄性Sprague Dawley(SD)大鼠肺动脉主干,剥离外膜、剔除内皮细胞,经酶消化法,体外培养PASMCs。倒置相差显微镜观察PASMCs生长状态及特点;台盼兰测定细胞活力;免疫细胞染色法进行平滑肌α-肌动蛋白(α-SM actin)鉴定。结果酶消化法分离培养的PASMCs 3 d后,可见细胞贴壁呈梭形生长,6 d后生长迅速呈典型的峰-谷状生长,9 d后达90%融合。通过形态学观察及免疫荧光染色法鉴定表明:培养的细胞为PASMCs;细胞存活率为98.5%;原代培养8~10 d后即可传代,3-10代细胞生长迅速、细胞形态不易发生改变,可用于进行细胞实验。结论采用I型胶原酶消化法简单易行、可靠、PASMCs生长迅速、传代周期短的特点;尤为重要的是,培养的原代PASMCs可用于肺动脉高压和肺血管重构的研究工作。     

丹参酮Ⅱ-A硫酸钠对低氧诱导肺血管平滑肌细胞增殖的影响

应用免疫细胞化学、流式细胞术和核酸原位杂交技术观测丹参酮Ⅱ-A硫酸钠(DS201)对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖的影响.结果发现DS201能明显地阻抑PASMC由G0/G1期进入S期(P<0.05);使PASMC增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及PDGF-A和B链mRNA的表达均显著降低(P<0.01).提示DS201可能通过下调PDGFmRNA基因表达而有效抑制HECCM诱导的PASMC增殖.