姜黄素抑制硝普钠诱导的大鼠软骨细胞凋亡机制研究

目的 探讨姜黄素抑制硝普钠(SNP)诱导的大鼠软骨细胞凋亡的机制研究。 方法 每组取4只SD大鼠关节软骨，细胞进行原代培养，将软骨细胞分成6组，分别为空白对照组(A组)，SNP损伤组(B组)，SNP+5 μmol/L姜黄素组(C组)，SNP+10 μmol/L姜黄素组(D组)，SNP+20 μmol/L姜黄素组(E组),SNP+30 μmol/L姜黄素组(F组)。用CCK8法检测不同浓度的姜黄素对软骨细胞增殖的影响，同时检测各组中软骨细胞的活性；用RtPCR检测软骨细胞MMP-13、caspase-3、Bax和Bcl-2基因的表达情况；用Hoechst 33342染色观察软骨细胞核凋亡情况；Western Blotting检测线粒体凋亡途径相关蛋白的表达情况。 结果 ①当姜黄素的浓度为20 μmol/L时，姜黄素对软骨细胞的促增殖作用最为明显；②CCK8法检测各组细胞的活性率从大至小依次为A组＞E组＞D组＞C组＞F组＞B组；③RtPCR检测软骨细胞caspase-3、Bax和Bcl-2表达量经姜黄素处理后均有显著变化；④Hoechst 33342染色结果表明姜黄素能改善SNP诱导的软骨细胞核染色质的损伤，减少软骨细胞中的线粒体膜电位；⑤Western boltting检测各组软骨细胞中caspase-3、Bax、蛋白的表达情况，表达量依次为B组＞E组＞A组；Bcl-2蛋白的表达情况，表达量依次为A组＞E组＞B组。 结论 姜黄素通过抑制线粒体凋亡途径，从而减少SNP诱导的大鼠软骨细胞的凋亡。      

NALP3炎性复合体及ERK信号通路在氧化应激中的作用及阿魏酸钠的干预机制

目的 探讨氧化应激时人肺上皮细胞（A549）中NALP3炎性复合体、细胞外调节蛋白激酶（ERK）的表达变化,阿魏酸钠（SF）的干预作用及其可能的机制。方法 培养A549细胞,分为空白对照组,H₂O₂刺激组,阿魏酸钠组,caspase-1抑制剂（Z-VAD）组,ERK阻断剂（PD98059）组, 阿魏酸钠+H₂O₂组。其中H₂O₂刺激组用H₂O₂ 200 μmol/L培养细胞2 h,阿魏酸钠组用阿魏酸钠400 μg/mL处理细胞30 min,Z-VAD组、PD98059组、阿魏酸钠+H₂O₂组分别用Z-VAD 20 μmol/L、PD98059 50 μmol/L、阿魏酸钠 400 μg/mL预处理A549细胞30 min后加入H₂O₂ 200 μmol/L培养2 h,采用实时荧光定量PCR检测各组A549中caspase-1、NALP3 mRNA的表达,Western blot检测caspase-1、NALP3、磷酸化ERK（p-ERK）、ERK蛋白含量;ELISA法检测各组A549 上清液中白细胞介素-1β（IL-1β）含量。结果 与空白对照组比较,H₂O₂ 可使A549细胞caspase-1 、NALP3 mRNA及caspase-1、NALP3、p-ERK/ERK蛋白水平表达增强,IL-1β分泌增加（P 均< 0.05）,而阿魏酸钠组与空白对照组差异无统计学意义（P >0.05）。与H₂O₂刺激组比较, Z-VAD组、PD98059组和阿魏酸钠+H₂O₂组caspase-1、NALP3 mRNA及蛋白表达降低,p-ERK/ERK蛋白表达降低,IL-1β分泌下降（P 均<0.05）,Z-VAD组或PD98059组与阿魏酸钠+H₂O₂组间上述作用差异无统计学意义（P >0.05）。结论 阿魏酸钠可能通过抑制ERK活化,减少caspase-1、NALP3及IL-1β的表达,从而减轻氧化应激导致的炎症级联反应。     

谷氨酰胺抑制过氧化氢诱导的A549细胞凋亡

目的观察谷氨酰胺诱导A549细胞表达HSP70及在抗过氧化氢（H2O2）诱导的细胞凋亡中的作用。方法体外培养A549细胞,随机分为4组：①空白对照组（C组）即生理盐水组;②谷氨酰胺组（Gln组）：以含谷氨酰胺8mmol/L的培养液预处理细胞;③过氧化氢组（H₂O₂组）：以浓度为400μmol/L过氧化氢处理细胞;④谷氨酰胺预处理后过氧化氢刺激组（Gln+H₂O₂组）：以含谷氨酰胺8mmol/L预处理细胞后,再加入400μmol/L过氧化氢处理细胞. 用免疫印记（Western blotting）法检测HSP70蛋白的表达,记录平均灰度值;用流式细胞仪Annexin-V法检测细胞凋亡,计算细胞总凋亡率。结果① 与C组HSP70表达（1.87±0.55） 相比,Gln组（8.42±1.38）、H₂O₂组（9.35±1.57）和Gln+H₂O₂组（13.12±1.85）的HSP70表达分别增高约4.5倍、5倍和7倍（P＜0.01）;与H₂O₂组HSP70表达相比,Gln+H2O2组进一步增高（P＜0.01）;②与C组相比,Gln组细胞总凋亡率无明显变化;H₂O₂组和Gln+H₂O₂组细胞总凋亡率分别为7.48%和6.06%,均明显高于C组（P＜0.01）;与H₂O₂组相比,Gln+H₂O₂组细胞总凋亡率明显降低（P＜0.01）。结论谷氨酰胺诱导A549细胞表达HSP70并可明显地抑制H2O2所致的细胞凋亡作用。     

NR4A1通过IκBα/NF-κB通路调控过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的机制

目的 探讨过氧化氢(H₂O₂)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)氧化应激中孤核受体NR4A1表达变化,以及其对细胞凋亡的影响及机制。方法 使用不同浓度及时间梯度H₂O₂处理HUVECs,采用CCK-8法检测细胞活性,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blotting法检测Bcl-2、Bax与NR4A1蛋白表达;采用siRNA转染建立敲低NR4A1与对照的HUVECs,分为si-NC组及si-NR4A1组,H₂O₂处理后检测各组细胞抑凋亡蛋白Bcl-2、凋亡蛋白Bax表达,TUNEL法检测细胞凋亡;采用慢病毒感染建立稳定过表达NR4A1与对照的HUVECs,并进行H₂O₂处理,分为空载对照组(NC组)、过表达组(OV组)、NC+H₂O₂组及OV+H₂O     

右美托咪定调控Nrf2/HO-1通路对H2O2诱导心肌细胞氧化应激损伤的作用研究

目的 探讨右美托咪定调控核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)通路对过氧化氢(H₂O₂)诱导心肌细胞氧化应激损伤的作用。方法 体外培养大鼠H9C2心肌细胞,设置对照组、H₂O₂组、1μmol右美托咪定+H₂O₂组、5μmol右美托咪定+H₂O₂组、10μmol右美托咪定+H₂O₂组。CCK-8法检测各组H9C2细胞增殖情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组H9C2细胞丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测各组H9C2细胞Nrf2、HO-1 mRNA相对表达量;Western blotting检测各组H9C2细胞Nrf2、HO-1蛋白相对表达量。结果 与对照组比较,H₂O₂组H9C2细胞存活率、SOD水平、Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白相对...     

去甲乌药碱对过氧化氢引起的PC12细胞损伤的保护作用研究

目的 探讨去甲乌药碱对过氧化氢(H₂O₂)引起的PC12细胞损伤的保护作用。方法 将PC12细胞分为对照组、H₂O₂组(100 μM H₂O₂)、去甲乌药碱组(50 μM去甲乌药碱+100 μM H₂O₂),CCK8法检测细胞活力,TUNEL染色检测细胞凋亡情况,流式检测ROS水平,氧化应激标志物MDA、SOD分别采用TBA法和WST法检测,蛋白免疫印迹检测凋亡相关蛋白Caspase3、Bax和Bcl-2的表达情况。结果 与H₂O₂组比较,去甲乌药碱组细胞活力显著提高,ROS、MDA含量显著降低,SOD活性显著升高,Caspase3、Bax表达量减少,Bcl-2表达量增加。结论 去甲乌药碱能通过抗氧化及抗凋亡抑制H₂O₂引起的PC12细胞损伤。     

孤核受体NR4A1在H2O2诱导小鼠肾脏足细胞损伤中的作用

目的 观察双氧水(H₂O₂)诱导的小鼠肾脏足细胞(MPC-5)氧化应激中孤核受体(NR4A1)表达变化,以及其对细胞增殖和凋亡的影响。方法 MPC-5分为空白对照组(H₂O₂处理浓度为0μmol/L或时间为0 h)和处理组(对应H₂O₂处理各浓度或时间),慢病毒感染后的MPC-5分为过表达组(Ad-NR4A1组)和空载对照组(Ad-Ctrl组)。采用H₂O₂处理MPC-5建立氧化应激模型;采用Q-PCR法检测H₂O₂处理MPC-5后,NR4A1 mRNA表达变化;采用Western blotting法检测NR4A1蛋白、凋亡相关蛋白Caspase 3(17 kDa)表达变化;采用慢病毒感染MPC-5,嘌呤霉素筛选并获得稳定过表达NR4A1的MPC-5细胞(Ad-NR4A1组)与空载细胞(Ad-Ctrl组),H₂O₂处理后,采用...     

线粒体靶向性肽SS-31对H2O2诱导人晶状体上皮细胞凋亡的保护作用

目的 研究线粒体靶向性肽SS-31在H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中的保护作用及其分子机制.方法 体外培养人晶状体上皮细胞系SRA01/04,选取相同代次的SRA01/04细胞进行实验,应用100 μmol/L H₂O₂ 构建凋亡模型,随机分为正常对照组、H₂O₂处理组、3个不同浓度的SS-31预处理组.应用MTT法检测各组细胞存活率;流式细胞术检测各组细胞凋亡率;Western blotting检测各组凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3的表达.结果 H₂O₂处理24 h后,细胞存活率降低,凋亡率升高,促凋亡蛋白Bax的表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达降低,Bax/Bcl-2比率升高,Cleaved-Caspase-3的表达升高.SS-31预处理能明显提高细胞的存活率,且与浓度呈正相关.同时,SS-31还能减少细胞的凋亡率,下调Bax的表达,上调Bcl-2的表达,减少Cleaved-Caspase-3的激活,从而发挥抗凋亡作用.结论 SS-31能在H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞凋亡中有效地发挥保护作用,但能否应用于白内障治疗有待深入研究.     

Akt信号途径参与二氮嗪预处理抑制缺氧复氧损伤大鼠海马神经元的凋亡

目的 探讨二氮嗪(DZ)预处理能否通过上调Akt信号增强Bcl-2表达、抑制Bax表达发挥抗凋亡作用.方法 离体培养9～10 d SD大鼠海马神经元分为正常对照组(A组)、缺氧组(B组)、缺氧+DZ 100 μmol/L组(c组)、缺氧+DZ 100 μmol/L+5-羟癸酸100 μmol/L组(D组)、缺氧+DZ 100 μmol/L+LY294002 50 μmol/L组(E组),自缺氧前2 d开始,神经元接受DZ预处理,每天1次,每次1 h.每次实验,每组16孔或2皿细胞,实验重复3次.比较缺氧4 h复氧48 h各组海马神经元的活力、凋亡率、Akt、Bcl-2和Bax蛋白的表达程度.结果 缺氧复氧后C组吸光度值较B、D、E组显著增高(P＜0.05);其他缺氧各组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).C组凋亡率较B、D、E组显著减低(P＜0.05).C组Akt、Bcl-2表达较B、D、E组强烈(P＜0.05),Bax表达则减弱(P＜0.05).B、D、E组问比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 DZ可经Akt信号通路上调Bcl-2/Bax蛋白比值而抑制缺氧复氧损伤大鼠海马神经元的凋亡.     

组织蛋白酶B通过瞬时受体电位黏蛋白-1对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体活化的影响

目的 探索在细胞氧化应激模型和特异性基因沉默细胞模型中,组织蛋白酶B(CTSB)通过瞬时受体电位黏蛋白-1(TRPML1)对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体活化的影响。方法 对体外培养的BV2细胞分别用H₂O₂、钙敏感性受体激动剂GdCl₃、CTSB抑制剂CA-074Me单独或同时处理,用酶联免疫吸附实验方法检测白细胞介素-1β(IL-1β)和半胱天冬酶-1-蛋白;用定量PCR方法检测各组BV2细胞的NLRP3 mRNA。用MTT法检测各组BV2细胞生长活力。用定量PCR方法检测BV2细胞中胱抑素C和TRPML1的mRNA,用Western blot检测TRPML1、CTSB、组织蛋白酶D(CTSD)、组织蛋白酶L(CTSL)、组织蛋白酶V(CTSV)蛋白。针对TRPML1基因靶序列设计特异性小干扰RNA(siRNA),在BV2细胞中建立TRPML1基因沉默细胞株(命名为Tr-si-BV2细胞),通过H₂O₂处理,再用Western blot检测Tr-si-BV2细胞或对照组细胞中的TRPML1、CTSB和转录因子EB(TFEB)蛋白。结果 用H₂O₂处理后,BV2细胞中半胱天冬酶-1蛋白和NLRP3 mRNA表达增加,加用GdCl₃处理后,BV2细胞中IL-1β显著增加(P=0.0036);使用CA-074Me处理后,NLRP3 mRNA(P=0.037)、半胱天冬酶-1(P=0.021)、IL-1β(P= 0.036)均显著减少。H₂O₂组和H₂O₂+GdCl₃组的细胞生长较慢。在H₂O₂浓度为200 μmol/L的处理组,BV2细胞中CTSB mRNA与TRPML1 mRNA、或CTSB与TRPML1蛋白的表达均有相似的变化;沉默TRPML1基因表达水平后能够抑制H₂O₂诱导的CTSB蛋白表达。组织蛋白酶CTSD、CTSL、CTSV的变化不受H₂O₂处理浓度高低的影响。在进行TRPML1基因沉默处理的BV2细胞中,H₂O₂ +siRNA处理组与H₂O₂处理组比较,CTSB蛋白的表达显著减少(P=0.021)。结论 在小胶质细胞的氧化应激模型中,CTSB具有调节NLRP3炎症小体活化的作用,这种作用有可能通过钙离子通道蛋白TRPML1介导。     

NALP3及NF-κB信号通路在氧化应激反应中的作用及阿魏酸钠的干预效应

目的 检测氧化应激时人肺上皮细胞（A549）炎性复合体NALP3、核转录因子-kappa B （NF-κB）基因和蛋白的表达,探讨阿魏酸钠对其的干预作用及可能的作用机制。方法 培养A549细胞,分为对照组、 H2O2（100 μmol/L）应激组、NF-κB阻断剂组（PDTC + H2O2组）、阿魏酸钠干预组（阿魏酸钠+H2O2组）,其中PDTC(100 μmol/L)和阿魏酸钠（400 μg/mL）预处理30 min后加入H2O2（100 μmol/L）,培养2 h后,采用实时荧光定量-PCR （qRT-PCR）检测NALP3、NF-κB（P65） mRNA的表达; Western blot检测NALP3、IκBα蛋白的表达;酶联免疫吸附（ELISA）测定细胞上清中白介素-1β（IL-1β）的表达。结果 与对照组比较,H2O2 可使A549细胞NALP3 mRNA、NALP3蛋白水平表达增强,NF-κB（P65） mRNA表达上调、IκBα降解增强,IL-1β分泌增加（P均<0.05）;而阿魏酸钠及NF-κB阻断剂PDTC可抵抗H2O2对A549细胞的作用,与H2O2应激组比较,下调NALP3 mRNA、NALP3蛋白、NALP3、NF-κB（P65） mRNA表达,IκBα降解减少,IL-1β分泌下降（P均<0.05）,并且阿魏酸钠与NF-κB阻断剂PDTC上述作用差异无统计学意义。结论 阿魏酸钠可能通过抑制NF-κB的活化,减少NALP3及IL-1β的表达,从而减轻氧化应激导致的炎症反应。     

过氧化氢抑制三氧化二砷诱导的伯基特氏淋巴瘤细胞凋亡

目的 探讨过氧化氢(H₂O₂)对三氧化二砷(As₂O₃)诱导人类伯基特氏淋巴瘤细胞凋亡的影响及双染法荧光显微技术在检测细胞凋亡中的作用。方法 应用As₂O₃诱导人类伯基特氏淋巴瘤细胞株BJAB细胞凋亡,采用Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)核染料双染法荧光显微镜和透射电镜对细胞死亡进行观察及定量分析。结果 BJAB细胞经As₂O₃处理后,荧光显微镜下可见大多数细胞出现细胞染色质凝集、核边集、核碎裂等凋亡的特征性改变;在低剂量(200 μmol/L)H₂O₂的影响下,抑制了As₂O₃诱导的细胞凋亡,降低细胞的死亡率;细胞的死亡方式由凋亡转变为核固缩性坏死,表现为既无凋亡的特征性改变,又非典型的细胞坏死,死亡细胞的细胞核呈固缩状态而非肿胀。结论 低浓度(200 μmol/L)H₂O₂可抑制临床治疗浓度的As₂O₃诱导的人类伯基特氏淋巴瘤BJAB细胞凋亡;双染法荧光显微镜技术不但可明确区分细胞凋亡及坏死,还可判断早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞,并可进行定量分析,是一种良好的细胞凋亡检测方法。     

盐酸右美托咪定对H2O2诱导的肺泡巨噬细胞氧化应激的影响

目的: 观察α2肾上腺素受体激动剂盐酸右美托咪定是否能够对抗过氧化氢(H₂O₂)诱导的肺泡巨噬细胞氧化损伤。方法: 选择合适浓度H₂O₂和作用时间建立细胞氧化损伤模型,应用0.01,0.10,1.00 μmol/L浓度盐酸右美托咪定分别处理24 h后,再应用MTT比色法检测H₂O₂诱导的损伤细胞的存活率;用相应试剂盒测定细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)释放量。结果: 50~300 μmol/L H₂O₂浓度依赖性地引起肺泡巨噬细胞氧化损伤,降低细胞存活率,增加LDH和TNF-α释放。0.01~1.00 μmol/L盐酸右美托咪定可以浓度依赖性地对抗H₂O₂诱导的细胞氧化损伤,使细胞存活率明显增加,减少LDH和TNF-α释放,这种作用具有剂量依赖性。α2受体拮抗剂育亨宾能够完全拮抗盐酸右美托咪定的这种保护作用,并且育亨宾本身对细胞的氧化损伤没有影响。结论: 盐酸右美托咪定能保护肺泡巨噬细胞对抗H₂O₂诱导的氧化应激损伤,此作用可能通过α2肾上腺素受体发挥作用。     

活性氧促使L6成肌细胞的分化

目的 探讨氧化应激对L6成肌细胞生长分化的影响。方法 MTT法检测H₂O₂对L6细胞活力的影响;观察H₂O₂引起的细胞形态学变化,RT-PCR检测myogenin基因表达水平。结果 在较短的处理时间内(1h),低浓度的活性氧(50μmol/LH₂O₂)有利于细胞的生长(P<0.05);H₂O₂处理12h后,50和150μmol/L的H₂O₂能够诱导成肌细胞分化的标记分子-myogenin基因的表达,形态学研究结果表明H₂O₂能够诱导肌管的形成,促使成肌细胞的分化。结论 活性氧可能是细胞内诱导细胞生长与分化的信号分子。     

黄杞苷对H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的保护作用

目的探讨黄杞苷对H₂O₂诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用与分子机制。方法黄杞苷(5、10、20、40、80和160μmol·L^-1)预处理SH-SY5Y细胞12 h, MTT法检测黄杞苷对H₂O₂诱导损伤后细胞活力的影响;通过氮蓝四唑(NBT)法总超氧化物歧化酶(SOD)活力检测试剂盒和总谷胱甘肽过氧化物酶(NADPH)检测试剂盒测定黄杞苷对H₂O₂诱导损伤后SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响;通过流式细胞术对SH-SY5Y细胞进行活性氧(ROS)水平的测定。黄杞苷(20μmol·L^-1)预处理SH-SY5Y细胞12 h, H₂O₂孵育6、12和24 h或用黄杞苷(5、10和20μmol·L^-1)预处理细胞12 h, H₂O₂孵育12 h,采用Western blot法分别检测Nrf...