脐血造血干细胞不同温度长期冻存效果的实验研究

目的通过观察在不同温度条件下长期冻存的效果,以探讨脐血造血干细胞适宜的保存时间。方法以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,分别采用-80℃冰箱直接冻存和程控降温-196℃液氮冻存,冻存前及冻存3、6及12个月后,应用全自动血细胞分析仪测定脐血单个核细胞(MNC)计数,台盼蓝拒染法显微镜下计数细胞存活率及流式细胞仪测定CD34 细胞计数。结果在-80℃冰箱冻存3个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较差异均无显著性。冻存6个月后,脐血台盼蓝拒染率较冻存前差异有显著性(P<0.05)。冻存12个月后,脐血各项指标较冻存前差异均有显著性,其中台盼蓝拒染率差异存在非常显著性(P<0.01)。在-196℃液氮冻存3、6及12个月后,脐血MNC计数、台盼蓝拒染率及CD34 细胞计数冻存前后比较均无显著差异。结论以终浓度为5%二甲基亚砜(DMSO)、3%羟乙基淀粉(HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂,脐血造血干细胞在-80℃冰箱中可以有效保存3个月,6个月后存在部分细胞损害,此时的脐血不适合作干细胞移植。脐血经程控降温-196℃液氮冻存12个月后,造血干细胞仍保存完好,适宜长期保存。     

-80℃条件下不同细胞浓度外周血干细胞冻存效果的实验观察

目的　观察不同细胞浓度外周血干细胞在 - 80℃条件下的冻存效果。方法　采用一种简便的 - 80℃干细胞冻存方法 ,其干细胞保护剂终浓度为 5 %二甲基亚砜 (DMSO) ,3%羟乙基淀粉 (HES)和 4 %人血白蛋白 (HSA) ,不经程序降温 ,直接 -80℃冰箱冻存外周血干细胞 ,并在不同时相点 (冻存后 1、3、6、9、1 2个月 )对推荐细胞浓度组 (1 .3～ 3.9)× 1 0 7/ml、调整细胞浓度组 (8.0～ 2 9.9)× 1 0 7/ml和高细胞浓度组 (30 .1～ 70 .1 )× 1 0 7/ml的外周血干细胞的细胞活性进行检测 ,观察台盼蓝拒染率和MNC、CFU GM、CD34+ 细胞的回收率。结果　 3组干细胞活性在 1 2个月内无明显下降 ;干细胞冻存后 9个月期间 ,3组冻存细胞的台盼蓝拒染率 ,MNC回收率、CFU GM回收率、CD34+ 细胞回收率都在 80 %以上。冻存 1 2个月中 ,3组在冻存后同一时间相互比较无统计学差异 (P >0 .0 5 ) ,说明该 - 80℃干细胞冻存方法适用于不同浓度的细胞液 ,短期内具有良好的冻存效果。结论　5 %DMSO、3%HES和 4 %HAS作为干细胞冷冻保护剂直接 - 80℃冰箱冻存外周血干细胞的方法能有效地保护不同浓度细胞液的外周血干细胞活性 ,适当地提高细胞保存时的浓度 ,减少回输量 ,可避免因干细胞冻存而引起的副作用     

-80℃简易冻存外周造血干细胞临床应用观察

目的:探索一种简便易行、安全有效、成本低的干细胞的冻存方法。方法:6份外周造血干细胞以1640培养液和二甲基亚砜、10%白蛋白作保护剂在-80℃条件下直接冻存,检测冻存前后外周血干细胞的活性、单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数及回收率。结果:冻存前后外周血干细胞活性、MNC和CD34+细胞的数量及回收率满足移植要求,输注后造血均重建。结论:1640培养液和二甲基亚砜、10%白蛋白作保护剂在-80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法。     

-80℃冻存外周血造血干细胞的应用研究

目的:探求一种操作简便实用、造血干细胞回收率和存活率高、成本低的外周血造血干细胞的冻存方法。方法:CP-1和5%白蛋白作保护剂在?80℃条件下直接冻存,并检测冻存前后外周血干细胞的活性,单个核细胞(MNC)和CFU-GM、CD34 细胞的回收率。结果:冻存前后外周血干细胞活性,单个核细胞(MNC)和CFU-GM、CD34 细胞的回收率无明显差异(P>0.05),输注后造血均重建。结论:CP-1和5%白蛋白作保护剂在?80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周血干细胞冻存方法,具有广泛的临床推广价值。     

人外周血造血干细胞低温保存方法的实验研究

目的：观察－196℃程控降温冻存方法和－80℃直接冻存方法中单用二甲基亚砜（DMSO）与DMSO加羟乙基淀粉（HES)两种浆存保护剂对人外周血造血干细胞体外冻存的效果。方法：对5例经Cs-3000Plus血细胞分离机分离所得的外周血单个核细胞分别加入10％DMSO和5％DMSO加6％HES冻存保护剂。并分别以－196℃程控降温冻存方法和－80℃直接冻存方法保存15d，以快速复温法复苏细胞，检测冻存前后细胞活率及有核细胞、CD34^ 细胞、粒单系集落形成单位（CFU－GM）、红系集落形成单位（CFU－E）回收率。结果：在－196℃程控降温冻存方法时，单用DMSO和DMSO加HES两组在细胞活率、有核细胞回收率、CD34^ 细胞回收率、CFU－E回收率方面差别无显著性意义；在－80℃直接冻存方法时，MDSO加HES组有核细胞回收率、CFU－E回收率高于单用DMSO组。结论：－196℃程控降温冻存时10％DMSO和5％DMSO加6％HES两种冻存保护剂均可有效应用于外周血造血干细胞保存；一80℃直接冻存方法适合5％DMSO加6％HES冻存保护剂，也可有效用于外周血造血干细胞保存。     

新改良外周血造血干细胞冷冻技术的临床应用观察

目的为临床自体造血干细胞移植提供一种简单易行、安全有效、成本低廉的干细胞冻存方法。方法 10份外周造血干细胞以二甲基亚砜、自体血浆作保护剂在-80℃条件下直接冻存,冻存前后检测外周血干细胞的活性、单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数及回收率。结果冻存前后外周血干细胞活性单个核细胞(MNC)数和CD34+细胞数及回收率满足移植要求,输注后造血均重建。结论二甲基亚砜、自体血浆作保护剂在-80℃条件下直接冻存干细胞是一种简便、可靠、安全、成本低的外周造血干细胞冻存方法。     

当归多糖对脐血造血细胞的抗冷冻损伤作用

目的：探讨当归多糖（APS）对脐血造血细胞的抗冷冻损伤作用.方法：采用细胞计数法比较羟乙基淀粉（HES）、明胶、淋巴细胞分离液（Ficoll）分离脐血单个核细胞（MNC）的回收率.应用细胞计数法、台盼蓝拒染法、集落形成实验和流式细胞术,检测冻存1,3,6mo脐血MNC的生物学活性,将脐血MNC与不同浓度APS共培养24h后冻存,1mo后复苏,观察APS对脐血MNC抗冷冻损伤的作用.结果：HES法、明胶法的MNC回收率均大于85%,显著高于Ficoll法（50.00±4.00）%（P〈0.05）;冻存1,3,6mo组MNC,CFU-Mix,CD34＋细胞回收率及台盼蓝拒染率差异均无显著性,且脐血MNC的损伤与冻存时间不相关.APS50,100,200,400mg/L不同浓度APS组MNC,CFU-Mix回收率和台盼蓝拒染率除APS400mg/L组下降外,其余各组明显上升（P〈0.05）;各组组间CD34＋细胞回收率差异无显著性.结论：APS可有效提高脐血造血细胞的抗冷冻损伤能力.     

深低温冻存对SLE患者外周血CD34+ 阳性细胞活性的影响

目的探讨深低温冻存对系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血CD34^＋细胞活性的影响。方法ClinMACS磁性分选系统分选CD34^＋细胞。采用5％二甲基亚砜,6％羟乙基淀粉和4％人血白蛋白作冷冻保护剂,-80℃直接冻存。观察不同时相复温后的细胞台盼兰拒染率、CFU—GM计数以及移植后造血恢复时间。结果SLE患者与正常人脐血CD34^＋细胞冻存后1～90d,细胞活性无明显差异。SLE患者与非自身免疫性疾病患者同样方法冻存造血干细胞,移植后造血恢复特征相似。结论-80℃深低温保存对SLE患者造血干细胞活性无影响。     

海藻糖对脂肪细胞冻存后存活率的影响

目的：探讨海藻糖作为冻存保护剂对脂肪组织冻存后存活率的影响。方法：抽吸成年女性腹部或大腿脂 肪颗粒,经离心纯化后,分3组：海藻糖组、胎牛血清+10%DMSO组、生理盐水组。于–196 ℃下冻存3个月后,用HE 染色、葡萄糖转移法、肌酸激酶法检测脂肪细胞存活情况。结果：海藻糖组及胎牛血清+10%DMSO组脂肪细胞活性 均高于生理盐水组(P<0.05);海藻糖组与胎牛血清+10%DMSO组脂肪细胞活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论：海 藻糖作为冻存保护剂能明显保持冷冻脂肪细胞活性,脂肪组织冷冻保存3个月后可用于临床移植。     

脐血造血干细胞冻存和纯化的研究

为观察脐血造血干细胞—80℃保存以及脐血CD34~ 细胞的纯化效果,采用-80℃深低温冰箱冻存脐血干细胞,结果表明保存1个月脐血单个核细胞(MNC)数量、锥虫蓝拒染率、粒一单祖细胞集落(CFU—GM)数回收率分别为85.17％±5.38％、91.67％±3.22％、60.50％±4.42％。保存1、3、6个月动态观察3项指标除锥虫蓝拒染率1个月与6个月外均无显著性差异{均P>0.05)。用Isolex50免疫磁珠分离系统,可从脐血中获得高纯度CD34~ 细胞。上述研究为脐血造血干细胞移植的临床应用提供了实验依据。     

-80℃冰箱非程控降温冻存脐血造血干细胞

目的:为脐血造血干细胞(CBHSC)的冻存建立简便、经济且有效的方法。方法:采用5％二甲基亚砜(DMSO)加6％羟乙基淀粉(HES)为冷冻保护剂,不用程控降温装置,直接置CBHSC于-80℃冰箱中冻存1～6个月。结果:冻存6个月后,单个核细胞(MNC)、粒-单系造血祖细胞(CFU-GM)和CD_(34)~+细胞的回收率及台盼兰拒染率分别为(91.6±1.8)％,(83.1±15.6)％,(88.2±1.8)％,(77.7±2.0)％。结论:这种简便、经济的方法能很好地保存CBHSC的造血潜能,因此,能为脐血移植冻存CBHSC。     

脐带血造血干细胞的采集、浓缩与低温冷冻保存

目的 :探讨脐带血造血干细胞库建立中的脐带血采集、分离、低温冻存的方法。方法 :自 1997年 7月至2 0 0 0年 7月已冻存经过HLA配型的脐带血 (cordblood ,CB) 3 74 4份。CB采自经检查符合要求的足月顺产或剖宫产新生儿 ,经 (citratephosphateadeninedextnse ,CPD A)抗凝 ,用密闭式血袋采集法采集。采集后置于室温保存 ,18h内处理。用羟乙基淀粉 (hydroxythylstarch ,HES)沉降后一次分离方法去除绝大多数红细胞及大部分血浆。采用以二甲亚砜 (dimethylsulfoxide ,DMSO)为主的冷冻保剂 ,冷冻保存CB。DMSO的终质量分数为 10 %。经序控降温后 ,置于 - 196℃液氮中保存。结果 :分析了 3 74 4份冻存CB ,平均采集量为 (93± 2 2 )ml(45～ 198ml)。浓缩后平均体积为 (3 8± 8)ml(3 0～ 60ml) ;浓缩前后有核细胞数 .浓缩前平均有核细胞数为 11.2× 10 8± 5 .3× 10 8(4.5× 10 8～ 4 5 .1× 10 8) ;采用HES沉降一次离心浓缩去除红细胞后的平均有核细胞数为 9.7× 10 8± 4 .6× 10 8(3 .1× 10 8～ 3 0 .5× 10 8) ;平均有核细胞回收率为 79%。质控检测 4 0份标本细胞活率为 88.2 % ,CFU GM回收率和CD3 4 +细胞计数分别为 97.6%和 86.4 %。结论 :本研究采用的CB采集、冻存及造血干细胞和病原生物检测的方法是安     

FL,TPO对人脐带血CD34+细胞体外增殖的影响

[目的]研究Flt-3配体（FL）及血小板生成素（TPO）在无血清培养体系中对人脐带血CD34＋细胞体外增殖的影响．[方法]采用无血清液体培养法，分别用FL，TPO，FL加TPO作用于体外短期培养脐带血CD34＋细胞，利用其计数及集落分析方法评价增殖效果．[结果]分别用FL，TPO，FL加TPO刺激增殖后，人脐带血细胞总数分别增加2．50，5．00，10．10倍，FL加TPO组细胞总数明显高于FL，TPO组；CD34＋细胞分别增殖0．90，1．26，1．61倍；集落总数分别增加2．07，2．27，7．37倍，造血祖细胞CFU-GM产率分别提高3．53，2．40，9．95倍，FL加TPO组产率高于其他组，BFU-E产率分别提高1．45，2．25．6．90倍．[结论]在短期无血清液体培养体系中，FL，TPO对人脐带血CD34＋细胞均具有增殖作用，且两者具有协同作用．     

Transwell培养体系中人AGM区基质细胞支持脐血CD34+细胞造血

[目的]探讨Transwell系统中人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐带血造血干/祖细胞的造血能力长期维持及扩增的作用.[方法]采用免疫磁珠方法分离人脐带血CD34 细胞,接种于底层铺有人AGM区基质细胞的Transwell培养板的Inserts中,非接触共培养7～35 d,每星期取样检测细胞总数,用半固体培养基分析CFU-C及HPP-CFU集落形成数,流式细胞术检测CD34 、CD34 CD38-细胞百分率.[结果]在Transwell中非接触共培养条件下,人AGM区基质细胞培养体系较胚胎躯干基质细胞和无饲养层培养体系对有核细胞总数、CFC和CD34 细胞均具有明显的扩增作用,共培养14 d的CD34 、CD34 CD38-造血干/祖细胞均获得峰值扩增(2.62±0.8和2.15±1.04,P<0.05),而MNC总数和CFC均在21 d获得最大扩增(32.5±4.3和4.2±0.6倍,P<0.05).克隆分析发现CFU-Mix、CFU-GM、BFU-E在共培养4～5星期后均仍然可见.原始祖细胞HPP-CFC在3星期也得到2.23倍的扩增,较空白及hFT对照组均有显著性差异(P<0.05),并在共培养35 d后仍可见HPP-CFU集落形成.[结论]人AGM区基质细胞hAGM-S3/hAGM-S4均具有造血支持作用,在非接触共培养条件下中可长期维持脐血中造血干/祖细胞的多系造血能力和高增殖潜能达21～35 d,对脐血CD34 /CD34 CD38-细胞数也有一定程度的扩增作用.     

-80℃冰箱降温-液氮冻存脐血造血干细胞

为脐血造血干细胞 (CBHSC)的冻存建立简便有效的方法 ,采用 5 %二甲基亚砜 (DMSO)加 6 %羟乙基淀粉 (HES)为冷冻保护剂 ,不用程控降温装置 ,直接置CBHSC于 -80℃冰箱中降温 ,次日移至液氮液中保存 1周、1个月、3个月、6个月。结果冻存 6个月后 ,单个核细胞 (MNC)、粒 -单系造血祖细胞 (CFU -GM )和CD+34 细胞的回收率及MNC的台盼蓝拒染率分别为 90 .5± 1.7% ,87.6± 19.5 % ,91.9± 2 .9% ,75 .8± 1.8%。认为这一简便的方法能很好地保存CBHSC的造血潜能 ,因此它能为脐血移植冻存CBHSC。     

脐血造血细胞的冷冻保存方法的比较

目的 :比较程控降温和 - 70℃冰箱直接保存脐血造血细胞对细胞活性的影响及免疫磁珠分离法对细胞生物学活性的影响。方法 :用密度梯度离心法分离出脐血中单个核细胞后 ,采用联合冷冻保护剂经程控降温后存放于液氮和直接存放于 - 70℃冰箱两种方法冷冻保存一个月 ,从细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率等方面比较这两种冷冻方法的优劣。另外 ,用免疫磁珠分离法正性分选脐带血中CD34+细胞 ,流式细胞仪计数分选前后的CD34+细胞的纯度及回收率 ,并分别进行分选前后的细胞培养。结果 :细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率在冷冻的两组间差异不显著。用免疫磁珠分选后CD34+细胞纯度达 88.3% ,回收率为 4 6 .2 % ,分选后的CD34+细胞比分选后CD34 细胞的细胞活力及集落形成能力明显要高。结论 :两种方法均可对脐血造血细胞进行保存。免疫磁珠分选法能够提供高纯度的造血干细胞 ,其分选过程不会影响细胞的活力及集落形成能力 ,为CD34+细胞分选和移植的临床应用提供实验依据     

脐血造血细胞的冷冻保存方法的比较

目的：比较程控降温和－70℃冰箱直接保存脐血造血细胞对细胞活性的影响及免疫磁珠分离法对细胞生物学活性的影响。方法：用密度梯度离心法分离出脐血中单个核细胞后，采用联合冷冻保护剂经程控降温后存放于液氮和直接存放于－70℃冰箱两种方法冷冻保存一个月，从细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率等方面比较这两种冷冻方法的优劣。另外，用免疫磁珠分离法正性分选脐带血中CD34＋细胞，流式细胞仪计数分选前后的CD34细胞的纯度及回收率，并分别进行分选前后的细胞培养。结果：细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率在冷冻的两组间差异不显著。用免疫磁珠分选后CD34＋细胞纯度达88.3%，回收率为46.2%，分选后的CD34＋细胞比分选后CD34－细胞的细胞活力及集落形成能力明显要高。结论：两种方法均可对脐血造血细胞进行保存。免疫磁珠分选法能够提供高纯度的造血干细胞，其分选过程不会影响细胞的活力及集落形成能力，为CD34＋细胞分选和移植的临床应用提供实验依据。     

脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的分离及功能特征的比较

目的分离成人外周血、脐血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞,并检测其功能,以了解脐血CD4^＋CD25^＋T细胞的特性。方法应用免疫磁珠分选法从健康成人外周血、脐血淋巴细胞中分离纯化CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞。应用流式细胞术检测分离纯度,胎盘蓝染色检测细胞存活率;RT-PCR技术检测CD4^＋CD25^＋、CD4＋CD25-T细胞中Foxp3的mRNA的表达;体外增殖实验检测其对CD4＋CD25-T细胞的免疫抑制作用。结果 MACS分离的CD4^＋CD25^＋T细胞、CD4＋CD25-T细胞纯度达（92.7±1.6）%、（90.3±1.2）%,细胞存活率达（95.3±2.1）%;体外经抗CD3、CD28单克隆抗体刺激培养的脐血及成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞同时得到扩增,而且高表达Foxp3;CD4^＋CD25^＋T细胞能有效的抑制效应T细胞的增殖,当效靶比为1︰1时,其抑制效应T细胞的作用最强,成人外周血抑制率为（81.36±1.61）%、脐血抑制率为（90.74±2.43）%。结论脐血和成人外周血CD4^＋CD25^＋T细胞是一群具有免疫抑制功能的调节性T细胞,与成人外周血相比,培养后的脐血CD4^＋CD25^＋T细胞比成人外周血有更强的免疫抑制功能。     

脂质体介导Bcl-2反义寡核苷酸对胆管癌细胞株QBC939的作用

目的：观察Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（ASODN）对人胆管癌QBC939细胞的作用及对Bcl-2蛋白表达的影响。方法：脂质体LipofectamineTM2000介导Bcl-2 ASODN转染QBC939细胞,应用台盼篮拒染实验检测细胞存活率、克隆形成实验检测克隆形成率、Western blot检测Bcl-2蛋白表达。结果：Bcl-2 ASODN转染后Bcl-2蛋白免疫印迹条带光密度显著低于对照组（P<0.01）;台盼篮拒染实验和克隆形成实验均显示Bcl-2 ASODN可以部分抑制QBC939细胞增殖,经ASODN作用,细胞的存活率和克隆形成率均显著低于对照组（P<0.05）。结论：Bcl-2 ASODN通过封闭人胆管癌QBC939细胞bcl-2基因表达抑制人胆管癌QBC939细胞的增殖。     

脐血间充质干细胞对脐血单个核细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血源间充质干细胞（mesenchymal stem cells derived fromumbilical cord blood,UCB—MSCs）联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞（umbilical cord blood mononuclear cells,UCB—MNCs）体外扩增的支持作用。方法从脐血中培养出UCB—MSCs,检测其表面抗原,并以此作为滋养层细胞,将UCB—MNCs接种于无血清培养体系中培养10d,检测有核细胞总数（MNCs）、CD34^＋．CD133^＋细胞数、集落形成单位数（CFU）和（G—M＋S）期细胞含量的变化。结果从脐血分离、培养出UCB—MSCs,稳定表达CD29、CD105和CD44,不表达CD34和CD133。外源性细胞因子及UCB—MSCs均支持UCB—MNCs的扩增,但以细胞因子联合UCB—MSCs组效果最好（P〈0．05）。结论从脐血中能成功分离培养出间充质干细胞,并完成细胞表型的初步鉴定。外源性细胞因子联合UCB—MSCs可有效扩增UCB—MNCs。