黑果枸杞水提取物抑制UVB辐射后HaCaT细胞凋亡及p16、p53蛋白表达

目的:明确黑果枸杞水提取物对中波紫外线(UVB)辐射引起的HaC aT细胞凋亡及p16、p53蛋白表达的影响。方法:体外培养HaC aT细胞,分为对照组、UVB组、UVB+黑果枸杞水提取物组,UVB照射剂量为30 mJ/cm2,黑果枸杞水提取物浓度为2 mg/mL。流式细胞仪检测各组UVB照射12 h后Western blot检测各组HaC aT细胞p16、p53蛋白的表达水平。结果:与对照组(6.12±1.19)%比较,UVB组HaC aT细胞凋亡率为(74.89±3.90)%、UVB+黑果枸杞水提取物组为(57.52±2.93)%,差异有统计学意义(P0.05)。对照组p16和p53蛋白水平为0.1±0.03和0.21±0.07,UVB组为0.28±0.06和0.5±0.04、UVB+黑果枸杞水提取物组为0.15±0.025和0.25±0.01,差异均有统计学意义(Ps0.05)。结论:黑果枸杞水提取物可抑制UVB引起的HaC aT细胞凋亡以及p16、p53蛋白表达。     

柴达木黑果枸杞花青素对中波紫外线照射后体外培养人皮肤成纤维细胞衰老的保护作用及机制研究

目的：研究柴达木黑果枸杞花青素对中波紫外线（UVB）照射后体外培养人皮肤成纤维细胞（HSF）衰老的保护作用及衰老相关基因p53、p21、微RNA(miR)-34c和沉默信息相关调节因子（SIRT）1 mRNA表达水平的影响。方法：取对数生长期的HSF，分为对照组、UVB照射组，柴达木黑果枸杞花青素低剂量组（0.1 g/L）、柴达木黑果枸杞花青素中剂量组（0.5 g/L）和柴达木黑果枸杞花青素高剂量组（1.0 g/L）。UVB照射前24 h用不同浓度的柴达木黑果枸杞花青素预处理HSF。UVB照射后72 h,β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色法检测衰老细胞比例，定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）法检测细胞中衰老相关基因p53、p21、miR-34c及SIRT1 mRNA的表达水平。结果：与对照组相比，UVB照射组细胞SA-β-gal染色阳性率及p53、p21、miR-34c和SIRT1 mRNA表达水平均升高（P<0.05）。与UVB照射组相比，柴达木黑果枸杞花青素（0.1 g/L、0.5 g/L和1.0 g/L）组细胞SA-β-gal染色阳性率，p53、p21、miR-3...     

中波紫外线对HaCaT细胞核因子-κB和p53表达的影响

目的研究中波紫外线(UVB)对HaCaT细胞核因子-κB(NF-κB)和p53表达的影响。方法以60mJ/cm2的UVB照射HaCaT细胞后8h、16h和24h,采用real time PCR和western blot等技术检测NF-κB和p53的表达情况。结果 1与未处理组相比,UVB照射HaCaT细胞8h、16h和24h后,NF-κB mRNA水平升高程度分别为27%、32%和42%,p53 mRNA水平升高程度分别为13%、20%和28%;2未处理组HaCaT细胞NF-κB和p53蛋白的表达水平分别为0.3989±0.04802和0.3018±0.03605,UVB照射8h、16h和24h后,二者的表达均随时间延长而升高,NF-κB为0.4283±0.0195、0.5976±0.0401和0.8255±0.0214,p53为0.3925±0.0244、0.4595±0.0362和0.5811±0.0482,差异有统计学意义(P0.05)。结论 UVB可致HaCat细胞中NF-κB和p53表达水平升高。     

EGCG对中波紫外线诱导HaCaT细胞p53基因和蛋白表达的实验研究

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对中波紫外线(UVB)照射诱导永生化角质形成细胞株-HaCaT细胞的p53 mRNA和p53蛋白表达的影响。方法:以一定剂量UVB照射HaCaT细胞,并以200μg/mL EGCG处理照射后的HaCaT细胞,分别用RT-PCR法和Western blot方法检测各处理条件下p53 mRNA和/或p53蛋白的表达水平。结果:30 mJ/cm2的UVB照射后HaCaT细胞的p53 mR-NA和p53蛋白表达逐渐增加,4 h达到峰值,4 h后随照射剂量增加而增加,24 h后有所恢复;加入EGCG可下调UVB诱导的表达作用。结论:UVB照射对HaCaT细胞p53 mRNA和p53蛋白的诱导表达有时效性与量效性,EGCG可下调UVB照射的这种诱导作用。     

RNA干扰p53基因对中波紫外线诱导的早衰和光致癌相关基因表达的影响

【摘要】 目的 探讨RNA干扰p53基因对中波紫外线（UVB）诱导的人皮肤成纤维细胞（HSF）早衰和光致癌相关基因表达的影响。 方法　利用已构建成功的RNA干扰抑制p53表达的HSF细胞系,加以反复多次亚毒性剂量UVB照射,衰老相关的β半乳糖苷酶（SA β-gal）染色法检测细胞衰老,定制实时定量PCR芯片,检测多种光致癌发生相关基因的表达,包括：参与细胞衰老通路的p53、p21、p19、p16、pRb,衰老相关基因纤维结合素（FN）、骨结合素（ON）、平滑肌22（SM22）,p53依赖的细胞凋亡相关基因bax和bcl-2,UVB诱导的癌基因缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）以及负性调控p53的人双微球蛋白2基因（hdm2）。使用SPSS10.0软件对各组间数据进行配对t检验。 结果　抑制p53表达的HSF经UVB照射后SA β-gal活性（19.70% ± 0.85%）较照射前（12.77% ± 0.81%）有所增加（t = 6.45,P ＜ 0.05）,但显著低于正常HSF经UVB照射后（50.48% ± 5.30%,t = 7.86,P < 0.05）,与正常HSF组（18.50% ± 0.45%）差异无统计学意义（t = 2.57,P > 0.05）。基因检测结果表明,抑制p53表达可抑制衰老基因p21、p19、FN、ON、SM22等的表达,但p16通路并不受之影响,在UVB作用下,p16、pRb的表达显著增加,分别上调。抑制p53的表达可使抑凋亡基因bcl-2上调及促凋亡基因bax下调,癌基因HIF-1α、VEGF、hdm2表达明显增加。UVB照射对这些基因表达改变无明显影响。 结论　抑制p53表达能够延缓UVB诱导的早衰。UVB诱导的早衰具有p53依赖的相关肿瘤抑制作用。     

中波紫外线对HaCaT细胞凋亡、细胞周期变化及p16、c-myc蛋白表达的影响及阿魏酸干预作用研究

目的观察传统中药川芎的有效成份阿魏酸(ferulic)对中波紫外线(UVB)辐射引起的人表皮角质形成细胞系HaCaT细胞凋亡、细胞周期及对p16、c-myc蛋白水平变化的影响,以探讨其光保护作用与机制。方法培养HaCaT细胞,以不同剂量UVB和200mg/mL浓度的阿魏酸处理细胞,以流式细胞仪检测0、30、60和90mJ/cm~2的UVB照射后24h细胞周期和凋亡率变化;以Western blot方法检测30mJ/cm~2UVB照射后p16、c-myc蛋白的表达水平。结果UVB照射诱导HaCaT细胞产生凋亡,凋亡率呈UVB剂量增加而升高;30mJ/cm~2剂量下细胞可出现明显S期阻滞,但高剂量时S期细胞数量相对下降;照光后p16、c-myc蛋白水平均增高。加入阿魏酸处理可抑制UVB引起的上述改变。结论阿魏酸可明显抑制UVB引起的凋亡与细胞周期阻滞以及p16、c-myc蛋白表达。     

柴达木枸杞多糖对UVB诱导人HaCaT细胞氧化损伤及凋亡相关蛋白的影响

目的观察枸杞多糖对中波紫外线(UVB)辐射后人角质形成(HaCaT)细胞的氧化损伤及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)表达的影响。方法超声辅助水提法制备枸杞多糖(LBP)粉末,体外培养HaCaT细胞,随机分为空白对照组、UVB照射组(UVB 30m J/cm~2辐射40min)、UVB+LBP组(UVB 30m J/cm~2辐射40min+LBP 1mg/m L),照射前12h加入LBP,照射结束后继续培养20h,倒置显微镜观察细胞形态;MTS法检测各组细胞吸光度值(A值);酶生化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力、过氧化氢酶(CAT)活力和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量和丙二醛(MDA)含量;Western blot法测定各组细胞p38MAPK,caspase-8,caspase-3和Bcl-2的表达水平。结果与对照组相比,UVB照射组细胞形态明显异常,漂浮的死细胞明显增多;与UVB照射组相比,UVB+LBP组细胞的形态趋于正常,漂浮的死细胞明显减少。UVB照射组较对照组细胞吸光度(A值)明显降低(P0.05);UVB+LBP组细胞吸光度较UVB照射组明显升高(P0.05)。UVB照射组SOD活力、CAT活力、GSH-Px含量较对照组降低,MDA含量较对照组升高(P0.05);UVB+LBP组细胞SOD活力、CAT活力、GSH-Px含量较UVB照射组升高,MDA含量较UVB照射组降低(P0.05)。UVB照射组p38MAPK,caspase-8,caspase-3蛋白表达量明显高于对照组,Bcl-2表达量明显低于对照组(P0.05);与UVB照射组相比,UVB+LBP组HaCaT细胞p38MAPK,caspase-8,caspase-3表达水平降低,Bcl-2表达水平升高(P0.05)。结论枸杞多糖可抑制UVB辐射后HaCaT细胞的氧化损伤,并下调p38MAPK,caspase-8,caspase-3及上调Bcl-2的表达水平。     

中波紫外线照射对表皮朗格汉斯细胞p53蛋白磷酸化表达的影响

目的：研究皮肤朗格汉斯（Langerhans）细胞（LC）在不同剂量中波紫外线（UVB）照射前、后p53蛋白磷酸化水平的差异。方法：联合采用密度梯度离心和免疫磁珠的方法分离纯化LC,将LC分为实验组和对照组,实验组分别接受30、60和90mJ／cm^2 UVB辐射,辐射后4h提取总蛋白,采用Western—blotting法检测各组细胞中p53蛋白及磷酸化p53蛋白的表达量,并比较两者之间的差异。结果：接受UVB辐射后,皮肤LC中p53蛋白表达基本无变化,而p53蛋白磷酸化水平显著升高,差异具有统计学意义,并呈剂量依赖性。结论：UVB辐射可刺激p53蛋白磷酸化,并呈剂量依赖性,进而诱导p53蛋白活化,发挥其下游功能。     

UVB诱导人皮肤成纤维细胞的氧化应激损伤研究

目的 观察人皮肤成纤维细胞被UVB照射后的光损伤、凋亡、周期阻滞和氧化应激损伤状态,并检测氧化应激的相关信号蛋白p66Shc的表达情况。方法 用小剂量UVB多次照射培养的人皮肤成纤维细胞,以细胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）化学染色法观察细胞衰老状态,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,ELISA法检测细胞内超氧化物歧化酶活性和丙二醛的含量,并以Western印迹法检测p66Shc蛋白的表达。结果 SA-β-Gal染色显示,培养的人皮肤成纤维细胞在UVB照射后呈强阳性染色;细胞凋亡率在未照射的对照组为0.96％,UVB照射组为37％;而细胞周期检测显示,经UVB照射的人皮肤成纤维细胞大部分阻滞于G0/G1期（80.07%）。细胞内超氧化物歧化酶水平对照组为（52.35 ± 4.97） ng/g蛋白,UVB照射组为（7.81 ± 0.68） ng/g蛋白（两组比较,P < 0.01）;而丙二醛水平两组分别为（3.52 ± 0.34） ng/g蛋白和（33.91 ± 3.20） ng/g蛋白（两组比较,P < 0.05）。人皮肤成纤维细胞经UVB照射诱导后24 h,p66Shc呈弱阳性表达,48 h后表达进一步增强。结论 培养的人皮肤成纤维细胞经UVB照射后进入氧化应激增强状态。p66Shc蛋白在此过程中表达逐渐增强。     

黑果枸杞多糖对中波紫外线诱导HaCaT细胞光损伤的保护作用

目的 探讨黑果枸杞多糖对HaCaT细胞光损伤的预防作用及机制.方法 采用超声辅助水提法提取柴达木黑果枸杞中的多糖成分.体外培养的HaCaT细胞分为3组,对照组:正常培养,不做其他处理;中波紫外线(UVB)组:30 mJ/cm2 UVB照射;实验组:30 mJ/cm2 UVB照射前6h加入2 g/L黑果枸杞多糖溶液.照射1h后继续培养12h,倒置显微镜观察细胞形态,MTS法测定细胞增殖,流式细胞仪测定细胞凋亡率,酶标法检测细胞丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力,ELISA法检测上清液和细胞中白细胞介素1(IL-1)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平.结果 与对照组相比,UVB组细胞形态模糊不清,出现死亡漂浮现象;实验组细胞肿胀,但形态尚清楚.MTS结果显示,3组间细胞增殖吸光度值差异有统计学意义(F=48.88,P＜0.01),其中UVB组(1.72±0.12)显著低于对照组(2.34±0.11),实验组(2.11±0.10)又显著高于UVB组,差异均有统计学意义(P＜0.05).UVB组细胞凋亡率(82.41％±2.49％)显著高于对照组(3.98％±0.19％)和实验组(22.79％±0.97％),实验组细胞凋亡率明显高于对照组,各组间比较差异均有统计学意义(均P＜ 0.05).UVB组与对照组比较,丙二醛含量明显上升,SOD活性、谷胱甘肽过氧化物酶含量、CAT活性明显下降(均P＜0.05).同时,UVB组较对照组上清液中IL-1和TNF-oα含量及细胞中TNF-α含量均明显升高(均P＜0.05),但细胞中IL-1差异无统计学意义(P＞0.05).结论 黑果枸杞多糖对HaCaT细胞的光损伤有保护作用,其保护机制可能与减少细胞炎症物质的合成和口分泌及减少自由基有关.     

Characterization of coordinated immediate responses by p16INK4A and p53 pathways in UVB-irradiated human skin cells

While the precise mechanisms of melanoma development are unknown, recent in vivo studies have revealed that the p16(Ink4a)/Rb pathway is disrupted in melanomagenesis. Here, we characterize the role of p16/Rb in coordinating the early events in UVB-irradiated skin. Foreskins and melanoma cell cultures were irradiated with low and high acute UVB doses and examined for cell-cycle- and apoptosis-associated genes. In melanoma cells, low UVB dose upregulated p16, p53, and p21 expression levels in Malme-3M, and high UVB dose accentuated the expression of p53 and p21(Cip1/Waf1), in particular; however, in SkMel-28 cells only p16 expression was upregulated in response to UV irradiation. In HaCaT cells, high UVB dose caused dramatic increase in p53 expression followed by upregulation of p21(Cip1/Waf1) and Bax, and downregulation of Bcl-2 leading to apoptosis. In HaCaT cells, reinstatement of p16 pathway restored cell-cycle arrest in response to low dose. Foreskin organ culture experiments confirmed our in vitro cell results. These data indicate that the p53 and p16 pathways respond independently to UVB insult. The p16 pathway is favored at low doses and results in cell-cycle arrest; the p53 pathway is more responsive to higher doses and induces apoptosis depending on p53 mutation status.     

绞股蓝皂苷对光损伤BALB/c小鼠皮肤p53、p21蛋白表达的影响

目的 探讨绞股蓝皂苷（GP）抗光损伤的作用机制。方法 80只雌性BALB/c小鼠随机分为8组,每组10只,分别为：空白对照组（未加任何处理）、UVB模型组、GP组Ⅰ（先涂GP后照UVB）、GP组Ⅱ（先照UVB后涂GP）、维生素E组Ⅰ（先涂维生素E乳膏后照UVB）、维生素E组Ⅱ（先照UVB后涂维生素E乳膏）、基质组Ⅰ（先涂基质后照UVB）、基质组Ⅱ（先照UVB后涂基质）。中波紫外线（UVB）照射BALB/c小鼠建立光损伤模型,根据以上分组对光损伤小鼠皮肤进行干预。运用蛋白Western印迹法检测各组小鼠表皮中p53蛋白、p21蛋白的表达。结果 BALB/c小鼠表皮p53蛋白的表达：空白组p53蛋白（0.11 ± 0.08）与UVB模型组（0.22 ± 0.12）相比低表达,GP组Ⅰ（0.44 ± 0.23）高于空白组（P < 0.01）,GP组Ⅱ（0.48 ± 0.24）高于空白组（P < 0.01）及UVB模型组（P < 0.05）,维生素E组Ⅰ（0.49 ± 0.29）及维生素E组Ⅱ（0.50 ± 0.27）均与GP组作用相似。小鼠表皮p21蛋白的表达各组间差异无统计学意义。结论 1.5% GP乳膏抗光损伤的作用机制之一可能与上调表皮细胞中p53蛋白表达量有关。     

不同剂量中波紫外线对HaCaT细胞p62及自噬体形成关键基因Beclin-1、Atg12和Atg3的调控效应研究

【摘要】 目的 探讨不同剂量中波紫外线（UVB）照射培养的HaCaT细胞后不同时间点对p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白表达水平的调控效应。 方法 使用4.5、10和50 mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞,照射后加入新鲜培养基继续培养4 h和12 h,同时设相同处理但不照射UVB的细胞为对照细胞。另设观察组,在照射后立即（包括对照细胞）,使用含蛋白酶抑制剂E64D（10 μg/L）和胃酶抑素（10 μg/L）的培养基孵育4 h和12 h,以阻断对p62的降解。使用Western印迹法测定HaCaT细胞p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白的表达水平。 结果 50 mJ/cm2 UVB照射HaCaT细胞后4 h,p62表达水平（p62与内参的比值为0.473 ± 0.022）较对照细胞（0.246 ± 0.038）升高（t = 15.27,P < 0.05）;阻断溶酶体后,细胞新生p62的水平（0.445 ± 0.035）与阻断溶酶体的对照（0.244 ± 0.016）相比,仍为上调（t = 7.62,P < 0.05）。在4.5 mJ/cm2 UVB照射细胞后12 h,与对照（0.254 ± 0.035）相比,HaCaT细胞p62表达上调（0.497 ± 0.047,t = 22.89,P < 0.05）;阻断溶酶体后,与阻断溶酶体的对照（0.257 ± 0.025）相比,p62表达水平仍然上调（0.548 ± 0.051,t = 17.42,P < 0.05）。4.5 mJ/cm2和50 mJ/cm2 UVB照射后4 h和12 h,对照细胞和照射细胞间的Beclin-1、Atg12和Atg3的表达差异均无统计学意义（P > 0.05）,阻止溶酶体对自噬体内容物的降解也未能发现Beclin-1、Atg12和Atg3的表达差异（P > 0.05）。 结论 p62表达在不同剂量UVB照射和照射后不同时间存在差异调控,并且这种调控效应与自噬体形成可能没有生物学联系。     

Caspase-3、Survivin在UVB诱导HaCaT凋亡细胞中的表达

目的探讨Caspase-3、Survivin在UVB诱导HaCaT凋亡细胞中的作用。方法研究对象为人角质形成细胞HaCaT细胞,实验分为正常对照组、10、20、40、80 m J/cm^2中波紫外线组(UVB)。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察增殖能力;流式细胞仅(FCM)实验检测细胞凋亡;实时定量PCR、Western-blot检测细胞内的Survivin、Caspase-3表达水平。结果与正常对照组相比,NB-UVB照射组细胞增殖抑制作用及凋亡明显增强(P<0.05),并随着照射剂量的增加,其细胞凋亡作用增加。同时与正常对照组相比,不同UVB照射剂量组Caspase-3表达均增强,其表达增强程度随着照射剂量的增加而增加,与正常对照组相比,10 m J/cm^2照射组,细胞表达Survivin水平最高(P<0.05),20 m J/cm^2组Survivin表达水平下降,稍低于对照组水平,40、80 m J/cm^2组Survivin进一步下降,较对照组下降明显(P<0.05)。结论 Survivin、Caspase-3参与了UVB诱导HaCaT凋亡细胞。Survivin表达水平与UVB辐射剂量有关。     

羟氯喹及没食子酸酯对HaCaT细胞光照射的影响

目的 探讨羟氯喹和绿茶活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对中波紫外线(UVB)损伤永生化角质形成细胞株(HaCaT细胞)的保护作用及其机制。方法 采用UVB定时及定量照射培养的HaCaT细胞,分别加入羟氯喹和EGCG干预处理,以RT-PCR法检测各受试组p53、p21、c-fos基因表达水平。结果 UVB照射后可明显增加HaCaT细胞中p53,p21,c-fos mRNA表达,羟氯喹和EGCG可不同程度地下调上述基因表达水平。结论 羟氯喹和EGCG的光保护作用在HaCaT细胞可能与其抑制p53,p21,c-fos基因表达有关。     

芍药苷对UVB所致HaCaT细胞凋亡的防护作用

目的：明确芍药苷对UVB所致HaCaT细胞凋亡的防护作用。方法：将HaCaT细胞分为8组,A组：空白对照组;B组：UVB照射对照组; C～H组分别为0.25mg/L, 0.5 mg/L,1 mg/L,2.5 mg/L,5 mg/L及10 mg/L芍药苷预处理组,均照射UVB。用流式细胞术检测细胞凋亡情况,RT-PCR检测P21mRNA的表达水平。结果：B组细胞凋亡率为4.840±0.836明显高于C～G组（0.423±0.179、1.127±0.535、1.633±0.417、 2.570±0.439、3.137±0.347）（P<0.05）。 B组与H组（4.203±0.655）比较,差异无统计学意义（P >0.05）;B组P21mRNA表达为1.040±0.007明显高于C～H组（0.440±0.015、0.551±0.013、0.857±0.017、0.848±0.027、0.850±0.052、0.923±0.035）（P<0.05）。结论：芍药苷在一定浓度内（0.25 mg～5 mg/L）对UVB致HaCaT细胞的凋亡有保护作用,并能减少P21mRNA的表达。     

双氢青蒿素对UVB诱导的人皮肤HaCaT细胞凋亡的保护作用

目的:明确双氢青蒿素(DHA)对UVB诱导人皮肤HaCaT细胞凋亡的保护作用。方法:将体外培养的HaCaT细胞分为空白对照组,UVB照射组和UVB+DHA(20、40、60、80μmol/L)组,采用MTT法检测细胞系的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,RT-PCR法检测抗凋亡基因survivin和促凋亡基因caspease-3(激活型)mRNA水平,Western检测相关蛋白表达水平。结果:30 mJ/cm~2 UVB照射24 h后,UVB组和UVB+DHA(20、40、60、80μmol/L)组细胞的增殖率分别为空白对照组的(50.13±2.42)%,(60.23±2.30)%,(69.24±3.19)%,(79.37±2.47)%和(70.41±2.24)%。UVB组和UVB+60μmol/L DHA组中HaCaT细胞凋亡率分别为(46.7±3.2)%和(23.71±1.2)%。与UVB组比较,UVB+60μmol/L DHA组中HaCaT细胞caspase-3 mRNA及蛋白表达降低、survivin mRNA及蛋白表达升高。结论:DHA可抑制UVB所致HaCaT细胞的凋亡,其机制可能与survivin和caspase-3有关。