ALK5抑制剂对转化生长因子-β1（TGF-β1）致视网膜色素上皮细胞纤维化的干预作用

目的　探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞向成纤维细胞转化的影响，及活化素受体样激酶5（activated receptor kinase 5，ALK5）抑制剂（SB-431542）对这一影响的干预作用。方法　体外培养人RPE细胞，随机分为对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1+SB-431542处理组、SB-431542处理组。对照组不做任何处理，其余三组分别用10 μg·L^-1 TGF-β1、10 μg·L^-1 TGF-β1+30 μmol·L^-1 SB-431542、30 μmol·L^-1 SB-431542处理细胞24 h。MTT法检测各组RPE细胞增殖率；划痕实验观察各组处理后0 h、12 h、24 h RPE细胞迁移情况；免疫荧光法检测各组细胞ALK5蛋白的分布和表达；Western blot法检测各组ALK5、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ，ColⅠ）以及纤维粘连素（fibronectin，FN）蛋白的表达。结果　与对照组相比，TGF-β1作用于RPE细胞24 h后，可改变RPE细胞表型，使其呈成纤维细胞样外观，并明显促进RPE细胞增殖和迁移。10.0 g·L^-1 TGF-β1作用24 h后RPE细胞增殖率为对照组的（1.33±0.08）倍，30 μmol·L^-1 SB-431542作用24 h后RPE细胞增殖率为10.0 g·L^-1 TGF-β1处理组的（67.77±6.78）%。经TGF-β1作用24 h后RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达显著上调，分别是对照组的（3.69±0.37）倍、（1.76±0.05）倍、（2.58±0.18）倍、（1.86±0.11）倍、（1.74±0.08）倍；SB-431542可逆转TGF-β1诱导的ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白表达上调，分别是TGF-β1处理组的（67.73±5.15）%、（71.71±3.50）%、（79.87±0.05）%、（63.59±3.16）%、（83.07±2.31）%，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　TGF-β1可促进RPE细胞增殖、迁移，向成纤维细胞转化，并能显著上调RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达；SB-431542可通过抑制TGF-β1的作用而抑制RPE细胞的纤维化。     

白藜芦醇对碱烧伤小鼠角膜纤维化反应的抑制作用

目的　探索白藜芦醇（RSV）对碱烧伤小鼠角膜纤维化反应的抑制作用。方法　选取SPF级、健康6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠48只,按照随机数字表法分为正常对照组、模型组和RSV组,每组16只。模型组和RSV组小鼠右眼建立角膜碱烧伤模型,左眼不做任何处理。RSV组小鼠用2 g·L^-1RSV溶液滴眼,模型组小鼠用相同剂量的羟丙基-β-环糊精溶液滴眼,连续滴眼 21 d。正常对照组小鼠不做碱烧伤和滴眼干预。碱烧伤后21 d,裂隙灯显微镜观察各组小鼠角膜混浊情况,对角膜混浊程度进行评分;通过HE染色观察各组小鼠角膜组织结构变化;采用免疫荧光染色观察各组小鼠角膜组织中α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和Ⅲ型胶原纤维蛋白α1链（COL3A1）的表达;利用Western blot检测各组小鼠角膜组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）、α-SMA、COL3A1蛋白相对表达水平。结果　碱烧伤后21 d,RSV组小鼠角膜混浊评分为（2.25±0.89）分,明显低于模型组［（3.25±0.71）分］,差异有统计学意义（P=0.026）。HE染色结果显示,模型组小鼠角膜基质中细胞增多,给予RSV干预后细胞相对减少。免疫荧光染色结果显示,RSV组小鼠角膜组织中α-SMA和COL3A1的表达均弱于模型组。Western blot检测结果显示,RSV组小鼠角膜组织中TGF-β1（0.60±0.17）、α-SMA（0.27±0.05）、COL3A1（0.49±0.21）蛋白相对表达水平均显著低于模型组［TGF-β1（1.48±0.50)、α-SMA(0.55±0.18)、COL3A1(1.32±0.87）］,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　在小鼠角膜碱烧伤中,RSV可以有效抑制角膜组织中TGF-β1的表达及肌成纤维细胞的活化,减少COL3A1沉积,从而抑制角膜的纤维化反应,进而减轻角膜混浊程度。     

不同浓度多西环素对碱烧伤大鼠角膜中转化生长因子β1和基质金属蛋白酶9表达的影响

目的　探讨不同浓度多西环素对碱烧伤大鼠角膜中转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）表达的影响及其调节作用。方法　SD大鼠右眼制备成角膜碱烧伤模型，随机分为对照组、0.5 g·L^-1多西环素组和1.0 g·L^-1多西环素组，每组15只。3组分别于造模后每天给予20 μL眼液溶媒、0.5 g·L^-1多西环素、1.0 g·L^-1多西环素滴眼至观察期末。于碱烧伤后第3天、第7天、第14天对角膜混浊程度进行评分，并行RT-PCR和ELISA检测角膜组织中TGF-β1、MMP-9 mRNA和蛋白的表达情况。结果　与对照组相比，碱烧伤后第7天、第14天，0.5 g·L^-1多西环素组［（2.80±0.45）分、（2.20±0.45）分］和1.0 g·L^-1多西环素组［（2.00±0.00）分、（0.60±0.55）分］角膜混浊程度评分降低，且1.0 g·L^-1多西环素组更低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。碱烧伤后第3天、第7天、第14 天，0.5 g·L^-1多西环素组、1.0 g·L^-1多西环素组TGF-β1 mRNA及蛋白表达量均较对照组低，且1.0 g·L^-1多西环素组表达更低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。碱烧伤后第3天、第7天，0.5 g·L^-1多西环素组、1.0 g·L^-1多西环素组MMP-9 mRNA及蛋白表达均较对照组低，且1.0 g·L^-1多西环素组表达更低，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　多西环素可下调碱烧伤大鼠角膜中TGF-β1和MMP-9的表达，促进角膜愈合，并呈一定程度的剂量依赖性。     

转化生长因子-β诱导视网膜色素上皮细胞增殖中NLRP3炎症小体的表达及意义

目的　探讨转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）刺激下Nod样受体蛋白3（nod-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体在视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）增殖中的表达变化及意义。方法　利用TGF-β刺激RPE细胞增殖模拟增生性玻璃体视网膜病变模型，随机分为空白对照组（Sham组）和TGF-β诱导RPE细胞增殖组（TGF-β组），TGF-β组再根据浓度（0.5 μg·L^-1、2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1、12.5 μg·L^-1）分组。利用MTT 微量酶比色法检测RPE细胞增殖情况；Western blot观察NLRP3蛋白的表达变化；利用标准ELISA试剂盒检测白细胞介素（interleukin，IL)-1β和 IL-18表达情况。结果　与Sham组比较，0.5 μg·L^-1 TGF-β组RPE细胞增殖不明显，差异无统计学意义（P>0.05），但NLRP3、IL-1β和 IL-18表达明显提高（均为P<0.01）；2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1和12.5 μg·L^-1TGF-β组RPE细胞增殖明显，NLRP3、IL-1β和 IL-18表达均提高（均为P<0.05）；与0.5 μg·L^-1 TGF-β组相比，2.5 μg·L^-1、10.0 μg·L^-1和12.5 μg·L^-1TGF-β组RPE细胞增殖显著增加，NLRP3、IL-1β和 IL-18表达均下降，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　不同浓度TGF-β诱导RPE细胞增殖中NLRP3炎症小体表达变化不同，两者可能相互调控影响RPE细胞增殖，在增生性玻璃体视网膜疾病发生发展中具有重要的作用。     

转化生长因子-β（TGF-β）空间动态分布的角膜基质创伤修复体外三维培养体系的构建

目的　研究构建模拟角膜基质创伤修复过程中转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）空间动态分布的体外三维培养系统。方法　从新鲜牛眼中分离角膜基质细胞，用含体积分数10％胎牛血清（fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12培养基进行培养，而后构建Pellet体外三维培养模型进行培养。将Pellet分为有透析袋组和无透析袋组，置入Transwell小室系统上下室中培养48 h后换液，上室为0.50 μg·L^-1TGF-β1+0.25 μg·L^-1TGF-β2+体积分数10％FBS，下室为体积分数10％FBS，分别于培养后72 h观察Pellet培养模型的形态变化并采用Real-time PCR法分别检测2组上下室Pellet中α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纤维连接蛋白（fibronectin，FN）、Ⅰ型胶原（collagen Ⅰ，Col Ⅰ）和Col Ⅲ mRNA相对表达量。结果　培养后72 h Pellet均呈团状生长。有透析袋组Transwell小室系统上、下室α-SMA mRNA表达量分别为1.595±0.025、1.148±0.009，FN mRNA表达量分别为1.090±0.011、0.844±0.015，Col Ⅰ mRNA表达量分别为1.445±0.035、1.165±0.008，Col Ⅲ mRNA表达量分别为1.726±0.031、1.314±0.020，Col Ⅲ/Col Ⅰ比值分别为1.126±0.019、0.957±0.013，上下室各项指标比较差异均有统计学意义（均为P=0.000）。无透析袋组Transwell小室系统上、下室α-SMA mRNA表达量分别为1.363±0.018、1.360±0.002，FN mRNA表达量分别为0.946±0.017、0.952±0.012，Col Ⅰ mRNA表达量分别为1.261±0.011、1.258±0.029，Col Ⅲ mRNA表达量分别为1.459±0.027、1.462±0.033，Col Ⅲ/Col Ⅰ比值分别为1.157±0.029、1.163±0.090，上下室各项指标比较，差异均无统计学意义（均为P>0.05）。无透析袋组上室细胞中α-SMA、FN、Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的相对表达量与有透析袋组上室、有透析袋组下室比较，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。无透析袋组下室细胞中α-SMA、FN、Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的相对表达量与有透析袋组上室、有透析袋组下室比较，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　Transwell小室系统与透析袋相结合可构建模拟TGF-β空间动态分布的体外三维培养系统。     

PPAR-γ受体激动剂罗格列酮对兔准分子激光角膜切削术后角膜上皮下雾状混浊的影响

目的　探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）激动剂罗格列酮对兔准分子激光角膜切削术（photorefractive keratectomy，PRK）术后角膜上皮下雾状混浊（haze）的影响。方法　选取普通级新西兰大白兔64只（64眼），随机分为28 μmol·L^-1罗格列酮组、14 μmol·L^-1罗格列酮组、1 g·L^-1二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）+生理盐水组、单纯PRK组，每组16只（16眼）。均行右眼PRK手术，术后分别给予28 μmol·L^-1罗格列酮、14 μmol·L^-1罗格列酮、1 g·L^-1DMSO+生理盐水滴眼，单纯PRK组未作任何特殊处理。术后各组用裂隙灯观察并比较角膜上皮愈合情况；分别于PRK术后7 d、28 d比较各组haze情况并行眼前节照相；每组分别于PRK术后7 d、28 d分批处死8只兔，取角膜行免疫组织化学法比较各组转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）的表达。结果　PRK术后角膜上皮愈合时间组间差异无统计学意义（P＞0.05）；PRK术后7 d、28 d，各组haze分级及TGF-β1、α-SMA、MMP-2的表达情况，组间差异均有统计学意义（均为P＜0.05），其中28 μmol·L^-1罗格列酮组haze最轻，14 μmol·L^-1罗格列酮组其次，明显轻于1 g·L^-1 DMSO+生理盐水组及单纯PRK组，除1 g·L^-1DMSO+生理盐水组及单纯PRK组组间差异均无统计学意义（均为P＞0.05）外，其余组间两两比较差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　PPAR-γ受体激动剂罗格列酮对兔PRK术后haze有抑制作用，呈浓度依赖性，可能由TGF-β1/Smad通路介导。     

视网膜色素上皮细胞 LncRNA MEG3在不同葡萄糖浓度下的表达情况及对VEGF和 TGF-β1表达的影响

目的　探讨长链非编码RNA母系表达基因3（LncRNA MEG3）在不同浓度葡萄糖下表达情况及对血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β1（TGF-β1）表达的影响。 方法　按照不同浓度d-葡萄糖培养ARPE-19细胞,随机分为5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组、30 mmol·L^-1d-葡萄糖组。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测各组ARPE-19细胞LncRNA MEG3、VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平。ARPE-19细胞转染PCDNA-MEG3及PCDNA-NC质粒,建立LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞及转染空质粒的ARPE-19细胞。以含30 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM分别培养以下各组ARPE-19细胞:LncRNA MEG3过表达ARPE-19细胞(O组);转染空质粒的ARPE-19细胞（NC组）;加入PBS的正常ARPE-19细胞(G组);同时以含5 mmol·L^-1d-葡萄糖的DMEM培养正常ARPE-19细胞（C组）;以上各组细胞培养24 h后,采用RT-qPCR法及Western blot法检测各组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白的相对表达水平。 结果　与5 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组和30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与15 mmol·L^-1 d-葡萄糖组比较,30 mmol·L^-1 d-葡萄糖组ARPE-19细胞LncRNA MEG3相对表达水平降低,VEGF mRNA、TGF-β1 mRNA相对表达水平升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与G组和NC组比较,O组ARPE-19细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白、TGF-β1 mRNA和TGF-β1蛋白相对表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论　高糖下调ARPE-19细胞LncRNA MEG3的表达,上调VEGF和 TGF-β1的表达。LncRNA MEG3过表达降低高糖诱导的VEGF和 TGF-β1表达的升高。LncRNA MEG3可能通过抑制VEGF和 TGF-β1的表达调节糖尿病视网膜病变的发展。     

丹酚酸A（Sal A）对H2O2诱导的氧化应激损伤人晶状体上皮细胞增殖、凋亡、超微结构及炎症反应的作用

目的　探讨丹酚酸A（salvianolic acid A,Sal A）对H₂O₂诱导的氧化应激损伤人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLEC）增殖、凋亡、超微结构及炎症反应的作用。方法　将HLEC SRA01/04细胞传代培养后,用不同浓度（50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、800 μmol·L^-1）H₂O₂处理培养24 h,通过MTT法检测细胞存活率,筛选H₂O₂最佳作用浓度,作为细胞模型组使用浓度。对照组细胞用正常完全培养液培养。Sal A干预组将细胞先在含50 μmol·L^-1 Sal A培养液中预孵育24 h,后加入最佳作用浓度H₂O₂继续培养24 h。而后采用MTT法检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,电镜观察细胞超微结构,Western blot检测各组细胞炎症相关蛋白IL-1β、IL-18、TNF-α的表达情况。结果　MTT法检测结果显示不同浓度H₂O₂（50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、800 μmol·L^-1）处理组细胞存活率分别为61.26%±3.35%、47.81%±2.63%、29.53%±2.54%、21.47%±2.26%、14.97%±1.82%,各浓度处理组细胞存活率和对照组相比,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。其中,100 μmol·L^-1 H₂O₂处理组细胞存活率最接近半数致死量,故选择100 μmol·L^-1 H₂O₂作为氧化应激损伤模型浓度用于后续实验。Sal A干预组细胞存活率为82.54%±3.07%,比100 μmol·L^-1 H₂O₂模型组明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术检测结果显示,对照组细胞凋亡率为4.06%±0.41%,H₂O₂模型组细胞凋亡率为20.52%±3.29%,Sal A干预组细胞凋亡率为12.35%±1.48%,H₂O₂模型组和Sal A干预组细胞凋亡率差异有统计学意义（P<0.05）。电镜观察结果显示H₂O₂诱导产生了明显的细胞超微结构损伤,线粒体、内质网数目减少,分泌颗粒减少,胞核体积缩小,可见少数细胞核内异染色质增多甚至聚集成块状。Sal A预处理后,细胞损伤的超微结构出现一定程度改善,如细胞形态较规则,细胞器线粒体、内质网数目增多,空泡数量减少,染色质分布基本均匀。Western blot检测结果显示,H₂O₂引起的氧化损伤会显著提高IL-1β、IL-18、TNF-α表达,Sal A可以在一定程度上降低IL-1β、IL-18、TNF-α的表达。结论　Sal A可以有效增加H₂O₂诱导的氧化应激损伤HLEC的增殖,抑制细胞凋亡,减小细胞超微结构损伤性改变,降低IL-1β、IL-18、TNF-α表达。     

缓激肽对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导视网膜色素上皮细胞发生上皮间充质转化的影响

目的　制作增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transformation,EMT）细胞模型,研究缓激肽（bradykinin,BK）对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞发生EMT的影响,并探讨BK对PVR的影响机制。方法　体外培养人RPE细胞株ARPE-19细胞,采用不同浓度转化生长因子-β1（transforming growth factor- β1,TGF- β1）分别作用于ARPE-19细胞24 h、48 h,于倒置显微镜下观察细胞形态变化;采用CCK-8检测细胞增殖情况,确定TGF-β1浓度及作用时间;利用Western blot和细胞免疫荧光检测EMT标志蛋白E-钙黏素、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和波形蛋白（Viminten）表达情况;细胞划痕实验、Transwell实验检测细胞迁移能力。同时采用Western blot检测TGF/Smad通路下游pSmad3和Smad7的表达。结果　TGF- β1刺激ARPE-19细胞后可以成功诱导EMT体外细胞模型。当TGF-β1浓度为10 μg·L^-1、作用时间为48 h时,细胞增殖最明显。BK在TGF- β1诱导的EMT中可以降低α-SMA、Viminten的表达,升高E-钙黏素的表达并且降低细胞迁移能力。这些影响能被BK-2受体拮抗剂HOE-140逆转。TGF-β1诱导ARPE-19细胞发生EMT时,pSmad3表达量升高;TGF-β1刺激前给予BK刺激,pSmad3表达量减少;加入BK前预敷HOE-140,然后给予TGF-β1刺激,BK作用减弱,pSmad3表达量升高。Smad7表达趋势与pSmad3表达趋势相反。结论　10 μg·L^-1 TGF-β1可导致ARPE-19细胞发生EMT。BK通过TGF-/Smad信号通路上调Smad 7的表达、下调pSmad 3的表达,从而逆转TGF-β1诱导的EMT。提示BK可能是一种新的、有效的治疗PVR的方法。     

氧化损伤对视网膜色素上皮细胞三联组氨酸核苷结合蛋白1（HINT1）表达的影响

目的　探讨过氧化氢（hydrogen peroxide,H₂O₂）诱导人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞氧化损伤对三联组氨酸核苷结合蛋白1（histidine triad nucleotide binding protein 1,HINT1）表达的影响。方法　将人ARPE-19细胞系分别用0 μmol·L^-1 H₂O₂（对照组）、50 μmol·L^-1 H₂O₂、100 μmol·L^-1 H₂O₂、200 μmol·L^-1 H₂O₂、400 μmol·L^-1 H₂O₂、600 μmol·L^-1 H₂O₂ 6个浓度梯度处理。采用Live/Dead荧光双染法和MTT法分别检测细胞活力和增殖能力;采用Western blot检测RPE细胞内BAX、BCL-2以及HINT1的表达水平。结果　H₂O₂处理6 h后,对照组及50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1及600 μmol·L^-1 H₂O₂组RPE细胞死亡率分别为（0.35±0.11）%、（2.03±0.87）%、（3.76±1.41）%、（12.17±1.26）%、（17.69±2.24）%、（25.22±0.59）%,RPE细胞死亡率呈剂量依赖性升高（P<0.05）。H₂O₂作用后对照组及50 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1、600 μmol·L^-1 H₂O₂组RPE细胞生存率分别为（40.72±2.71）%、（37.75±0.62）%、（35.30±0.68）%、（34.10±0.74）%、（33.61±0.71）%、（31.05±1.41）%,RPE细胞增殖明显减少（P<0.05）,具有剂量-效应关系。随着H₂O₂浓度的增加,BAX蛋白表达逐渐上升（P<0.01）,而抗凋亡BCL-2蛋白表达则逐渐下降（P<0.01）,BAX/BCL-2比值相比对照组分别升高1.85倍（50 μmol·L^-1 H₂O₂组）、2.35倍（100 μmol·L^-1 H₂O₂组）、2.86倍（200 μmol·L^-1 H₂O₂组）、3.97倍（400 μmol·L^-1 H₂O₂组）、8.50倍（600 μmol·L^-1 H₂O₂组）;HINT1在H₂O₂处理的RPE细胞中以剂量依赖性方式逐渐下降（P<0.01）,分别下降0.78倍（50 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.59倍（100 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.45倍（200 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.42倍（400 μmol·L^-1 H₂O₂组）、0.38倍（600 μmol·L^-1 H₂O₂组）。结论　H₂O₂氧化损伤诱导RPE细胞活力显著减弱,细胞凋亡相关蛋白BAX表达升高;同时,细胞中HINT1表达下调,表明HINT1可能通过影响细胞凋亡参与年龄相关性黄斑变性的发生,为其药物作用的潜在靶点。     

淫羊藿总黄酮含药血浆对雄兔干眼泪腺上皮细胞凋亡模型Caspase-3、Caspase-8 mRNA表达的影响

目的　观察淫羊藿总黄酮含药血浆对雄兔干眼泪腺上皮细胞Caspase-3、Caspase-8 mRNA表达的影响。方法　取61只健康无眼疾1月龄雄性新西兰大耳白兔，随机取1只雄兔泪腺，培养泪腺上皮细胞，取第3代泪腺上皮细胞用于实验。60只雄兔随机分成淫羊藿总黄酮10.0倍组、5.0倍组、2.5倍组和空白对照组，通过MTT法确定后续干预细胞的含药血浆的浓度。将所培养第3代泪腺上皮细胞随机分为淫羊藿总黄酮治疗组、含雄激素培养对照组和空白组（DMEM/F12低糖培养基中分别加入含淫羊藿总黄酮血浆、10^-6 mol·L^-1丙酸睾酮和空白血浆）。干预48 h后各组均加入H₂O₂继续培养60 min诱导细胞凋亡，采用RT-PCR法检测各组细胞凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8 mRNA的表达。结果　MTT实验显示应选取淫羊藿总黄酮2.5倍组作为干预细胞含药血浆的浓度。淫羊藿总黄酮10.0倍组、5.0倍组、2.5倍组和空白对照组兔血浆中朝藿定A浓度分别为120.5 μg·L^-1、65.7 μg·L^-1、21.9 μg·L^-1、0 μg·L^-1，淫羊藿苷浓度分别为130.8 μg·L^-1、45.3 μg·L^-1、18.9 μg·L^-1、0 μg·L^-1。淫羊藿总黄酮治疗组、含雄激素培养对照组、空白组的Caspase-3 mRNA相对含量分别为0.35±0.07、0.68±0.18、1.00±0.19，Caspase-8 mRNA相对含量分别为0.27±0.21、0.72±0.10、1.00±0.15。空白组Caspase-3、Caspase-8 mRNA的表达均高于含雄激素培养组，空白组和含雄激素培养组均高于淫羊藿总黄酮治疗组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　淫羊藿总黄酮能够下调雄兔干眼泪腺上皮细胞Capase-3、Capase-8 mRNA的表达，这可能是其治疗干眼的关键机制之一。     

TGF-β2刺激人Tenon囊成纤维细胞生物学行为改变及表达整合素连接激酶(ILK)的研究

目的 探讨转化生长因子β2(transforming growth factor beta 2,TGF-β2)对体外培养的人Tenon囊成纤维细胞(human Tenon fibroblasts,HTFs)生物学行为及表达整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)的影响.方法 组织块贴壁法培养原代HTFs,免疫荧光染色鉴定波形蛋白和角蛋白.MTT法检测不同浓度TGF-β2对HTFs细胞的促增殖作用,RT-PCR检测TGF-β2作用前后α-平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)、ILK mRNA的表达,Western Blot检测α-SMA、ILK、E-cadherin蛋白的表达,细胞免疫荧光染色检测α-SMA、E-cadherin蛋白的表达.结果 MTT检测结果显示,TGF-β2作用48 h、72 h,5.0 μg· L-1及10.0 μg· L-1诱导下的OD值显著高于0.1μg·L-1、1.0 μg·L-1组及空白对照组(均为P＜O.05),5.0 μg·L-1及10.0 μg·L-1作用48 h及72 h的OD值显著高于24 h(均为P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,5.0μg·L-1TGF-β2诱导48 h后,α-SMA mRNA及ILK mRNA水平和空白对照组相比明显上调,差异均有统计学意义(均为P＜0.05).Western Blot检测结果显示,ILK、α-SMA及E-cadherin在空白对照组和5.0 μg· L-1TGF-β2处理组均有表达,但TGF-β2能够明显上调三者的表达,5.0 μg·L-TGF-β2处理48 h组与空白对照组差异均有统计学意义(均为P＜0.05).细胞免疫荧光染色结果显示,TGF-β2处理组α-SMA、E-cadherin均有荧光表达,其中oα-SMA表达在细胞质中,而E-cadherin在细胞质和细胞核中均有表达.结论TGF-β2可以诱导体外培养HTFs增殖,转分化及黏附性增强,同时促进ILK的高表达,提示ILK在青光眼术后瘢痕化过程中可能也起到一定作用.     

地塞米松对脂多糖诱导人视网膜色素上皮细胞炎症损伤及NLRP3/Caspase-1通路的影响

目的　探究地塞米松（Dex）对脂多糖（LPS）诱导人视网膜色素上皮（HRPE）细胞炎症损伤及核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）通路的影响。方法　体外培养ARPE-19细胞株,MMT法检测不同浓度Dex处理细胞24 h、48 h、74 h对LPS诱导ARPE-19细胞存活率的影响,确定Dex最佳处理浓度和时间。ARPE细胞随机分为:正常对照组（NC组）、LPS组（5 mg·L^-1 LPS）、Dex组（0.20 mol·L^-1 Dex）、Dex+LPS组（0.20 mol·L^-1 Dex+5 mg·L^-1 LPS）,RT-qPCR检测各组细胞肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量,ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达水平,Western blot检测NLRP3、Caspase-1蛋白表达水平。结果　同一时间点,与NC组比较,LPS组ARPE-19细胞存活率均显著降低（均为P<0.05）,且随着Dex浓度增加,细胞存活率呈先升高后下降的趋势;0.20 mol·L^-1 Dex作用LPS诱导的ARPE-19细胞24 h时细胞存活率为(90.77±5.73)%,接近NC组,因此选用0.20 mol·L^-1Dex作用24 h用于后续实验。NC组与Dex组间TNF-α、IL-1β、IL-6、NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达量差异均无统计学意义（均为P＞0.05）。与NC组、Dex组比较,LPS组、Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6、 NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著升高,且Dex+LPS组TNF-α、IL-1β、IL-6 、NLRP3、Caspase-1 mRNA及蛋白表达水平均显著低于LPS组（均为P<0.05）。结论　Dex可能通过抑制NLRP3/Caspase-1通路减轻LPS诱导的HRPE炎症损伤。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对视网膜色素上皮细胞增殖及相关因子表达的影响

目的　研究表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞增殖及相关因子表达的影响。方法　体外培养人RPE细胞,设阴性对照组,40 mg·L^-1、 80 mg·L^-1、 160 mg·L^-1 EGCG 3个浓度药物处理组。利用MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期,实时荧光定量PCR检测细胞周期素依赖性激酶抑制因子P21和P27 mRNA的表达,Western blot检测色素上皮衍生因子受体（pigment epithelium derived factor receptor,PDGFR-α)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB）和IκB蛋白的表达情况。结果　MTT实验结果显示,40 mg·L^-1、80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG药物处理组随着作用时间的延长,对人RPE细胞的增殖抑制作用也逐渐增强;随着药物浓度的增加,EGCG的增殖抑制作用也增强（均为P<0.05）。160 mg·L^-1 的EGCG 在72 h的细胞增殖抑制率达到81.11%。随着EGCG浓度的增加,培养的人RPE细胞中G1期和G2期细胞比例减少,S期细胞比例增加,80 mg·L^-1、160 mg·L^-1EGCG药物处理组S期细胞比例与阴性对照组相比增加极显著（均为P<0.05）。EGCG对细胞周期的影响作用具有明显的剂量依赖性。与阴性对照组相比,80 mg·L^-1、160 mg·L^-1EGCG药物处理组细胞内的P21和P27 mRNA表达均有不同程度的升高（均为P<0.05）;40 mg·L^-1 EGCG药物处理组与阴性对照组相比,P27 mRNA表达也增高（P=0.015）,而P21 mRNA表达增高不明显（P=0.824）。P21和P27 mRNA表达量与EGCG浓度呈明显量效依赖关系（均为P<0.05）。Western blot结果显示,40 mg·L^-1、80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG作用人RPE细胞后,NF-κB蛋白表达随着浓度的增加而减少,各药物处理组与阴性对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。80 mg·L^-1、160 mg·L^-1 EGCG亦能够抑制人RPE 细胞IκB蛋白和PDGFR-α蛋白表达,与相应阴性对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。EGCG对人RPE细胞内PDGFR-α、NF-κB和IκB的蛋白表达抑制作用呈明显的浓度依赖性（均为P<0.05）。结论　EGCG可以有效地抑制人RPE细胞的增殖,其机制可能与EGCG将人RPE细胞阻滞于S期,上调P21及P27 mRNA表达,下调PDGFR-α、NF-κB和IκB蛋白表达有关。     

槲皮素对N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导损伤的视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

目的　探讨槲皮素对N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）诱导的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell,RGC）损伤的保护作用及其机制。方法　将小鼠RGC随机分为对照组,NMDA组,NMDA+1 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1槲皮素处理组,槲皮素处理组,NMDA+槲皮素+茴香霉素（anisomycin,ANISO）处理组,NMDA+槲皮素+P79350处理组。NMDA组细胞加入100 μmol·L^-1的NMDA作用24 h,NMDA+1 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1槲皮素处理组则在NMDA作用前分别加入相应浓度槲皮素预处理2 h,槲皮素处理组只加入10 μmol·L^-1槲皮素处理,NMDA+槲皮素+ANISO处理组和NMDA+槲皮素+P79350处理组在NMDA和槲皮素处理后分别加入25 μg·L^-1的ANISO和50 μmol·L^-1的P79350处理。随后利用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）试剂盒检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡率,酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞培养上清液中活性氧（reactive oxygen species,ROS）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和一氧化氮（nitric oxide,NO）水平,RT-PCR检测细胞中神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase,nNOS）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）mRNA表达,Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK）、磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）和p-JNK蛋白表达水平,Caspase-3活性试剂盒检测Caspase-3活性。结果　与对照组比较,NMDA组细胞活性、SOD、Bcl-2 mRNA表达水平降低,LDH,ROS,MDA,NO,iNOS mRNA、nNOS mRNA、Bax mRNA和蛋白表达水平,Caspase-3活性,p-JNK蛋白表达水平,p-p38 MAPK蛋白表达水平,细胞凋亡率均升高（均为P<0.05）。相比于NMDA组,NMDA+槲皮素处理组则提高细胞活性和SOD水平,上调Bcl-2 mRNA和蛋白表达,降低LDH、ROS、MDA和NO,下调iNOS mRNA、nNOS mRNA、Bax mRNA和蛋白,p-JNK蛋白以及p-p38 MAPK蛋白表达,并降低Caspase-3活性和细胞凋亡率（均为P<0.05）。ANISO和P79350抵消槲皮素的作用。结论　槲皮素通过JNK/p38 MAPK信号通路防止NMDA诱导的RGC损伤。     

KIF11通过激活Wnt/β-catenin通路调控高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞损伤

目的　探究KIF11在高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞（HRMECs）损伤中的作用和机制。方法　将正常培养的HRMECs随机分成四组:正常组（给予5 mmol·L^-1葡萄糖）、高糖组（给予30 mmol·L^-1葡萄糖）、高糖+si-NC组（转染100 nmol·L^-1 si-NC后给予30 mmol·L^-1葡萄糖）、高糖+si-KIF11组（转染100 nmol·L^-1 si-KIF11后给予30 mmol·L^-1葡萄糖）。Real-time PCR检测各组HRMECs的KIF11、VEGF和HIF-1α mRNA表达,Western blot检测KIF11、VEGF、HIF-1α和Wnt/β-catenin通路相关蛋白（β-catenin、cyclin D1和c-Myc）表达,CCK-8法检测细胞活力,Transwell检测迁移细胞数目。通过LiCl激活Wnt/β-catenin通路进一步确证KIF11是否通过该通路发挥作用。结果　与正常组相比,高糖组中HRMECs细胞活力增加,迁移细胞数增多,KIF11、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白水平以及β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白表达均上调（均为P<0.05）;与高糖组相比,高糖+si-KIF11组中HRMECs细胞活力降低,迁移细胞数减少,KIF11、VEGF和HIF-1α mRNA和蛋白水平以及β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白表达均下调（均为P<0.05）;而高糖+si-NC组中上述指标与高糖组相比差异均无统计学意义（均为P>0.05）。与高糖+si-KIF11组相比,高糖+si-KIF11+LiCl组HRMECs细胞活力增加,迁移细胞数增多,VEGF和HIF-1α蛋白表达上调（均为P<0.05）。结论　KIF11在高糖诱导的HRMECs中表达上调,下调其表达可通过抑制Wnt/β-catenin通路缓解高糖诱导的HRMECs损伤。     

过表达低氧诱导因子-1α（HIF-1α）对体外培养人视网膜血管内皮细胞增殖、炎症反应及血管生成的影响

目的　检测过表达低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α）对体外培养人视网膜血管内皮细胞（human retinal capillary endothelial cell,HREC）增殖、炎症反应及血管生成的影响。方法　将体外培养HREC转染人工合成的pEGFP-HIF-1α重组载体,并采用荧光定量PCR检测转染前后HREC中HIF-1α的表达变化。采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）、酶联免疫吸附实验（ELISA）和Western blot分别检测过表达HIF-1α对HREC增殖、炎症反应及血管生成的影响。结果　体外转染pEGFP-HIF-1α可显著增加HREC中HIF-1α mRNA 和蛋白表达。过表达HIF-1α可显著促进HREC增殖,HREC转染pEGFP-HIF-1α后24 h、48 h及72 h A值分别为:0.34±0.04、0.57±0.04、0.83±0.05,而HREC转染pEGFP-C1后24 h、48 h及72 h A值分别为:0.26±0.03、0.44±0.04、0.61±0.04,两者相比差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。过表达HIF-1α可显著增加HREC中肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）-α、白细胞介素（interleukin,IL）-1β及IL-6的蛋白表达水平,TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白表达分别为（2.63±0.57）ng·L^-1、（1.94±0.41）ng·L^-1、（5.32±0.83）ng·L^-1,而转染pEGFP-C1后HREC中TNF-α、IL-1β及IL-6蛋白表达分别为（1.20±0.34）ng·L^-1、（0.66±0.27）ng·L^-1、（1.89±0.60）ng·L^-1,两者相比差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。过表达HIF-1α可显著增加HREC中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白表达,转染pEGFP-HIF-1α后细胞VEGF蛋白的表达为6.72±0.96,而转染pEGFP-C1后细胞VEGF蛋白的表达为2.31±0.47,两者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论　过表达HIF-1α可促进体外培养HREC增殖、炎症反应及血管的生成。     

甘草查尔酮A对过氧化氢致视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的　研究甘草查尔酮A（licochalcone A,LCA）对过氧化氢（H₂O₂）致视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGC）损伤的保护作用,为LCA在青光眼治疗方面的应用提供初步的实验依据。方法　体外培养RGC-5细胞,随机分为对照组（正常培养基培养）、H₂O₂组（培养基中加入200 μmol·L^-1 H₂O₂）、LCA组（培养基中除加入200 μmol·L^-1 H₂O₂外,还分别加入10 μmol·L^-1、20 μmol·L^-1、40 μmol·L^-1的LCA溶液）,CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Western blotting检测各组细胞中Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平,ELISA法检测各组细胞中丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性。结果　CCK-8法检测结果显示,10 μmol·L^-1、20 μmol·L^-1和40 μmol·L^-1LCA组的细胞存活率分别为（63.7±5.4）%、（78.8±6.3）%和（72.3±6.9）%,与H₂O₂组的（54.3±3.9）%相比,20 μmol·L^-1 LCA组增殖最显著（P＜0.05）。流式细胞术检测结果显示,10 μmol·L^-1、20 μmol·L^-1和40 μmol·L^-1LCA组细胞凋亡率分别为（21.1±1.9）%、（12.3±1.3）%和（14.8±2.0）%,与H₂O₂组的（29.3±2.0）%比较,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。Western blotting检测结果显示,与H₂O₂组比较,不同浓度LCA组Bcl-2蛋白的表达均增加,Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表达均降低,差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。ELISA法检测结果显示,与H₂O₂组比较,不同浓度LCA组RGC-5的丙二醛含量均降低,但超氧化物歧化酶活性均显著增加（均为P＜0.05）。结论　LCA能缓解H₂O₂诱导的RGC损伤,其作用机制可能与抑制细胞凋亡和氧化应激有关。     

miR-29a抑制H2O2诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤

目的　探究miR-29a在H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞氧化损伤中的作用和机制。方法　使用不同浓度（0 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、200 μmol·L^-1、300 μmol·L^-1、400 μmol·L^-1）的H₂O₂处理人晶状体上皮细胞HLE-B3,以确定后续实验中H₂O₂使用的浓度。将HLE-B3细胞随机分成4组:对照组、H₂O₂组、H₂O₂+模拟物对照组和H₂O₂+miR-29a模拟物组,CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）含量,Real-time PCR检测miR-29a和Bcl2修饰因子（Bcl2 modifying factor,BMF）、Bcl2拮抗/杀伤因子1（Bcl2-antagonist/killer 1,BAK1） mRNA表达,Western blotting检测BMF和BAK1蛋白表达。结果　HLE-B3细胞活力随着H₂O₂浓度的增加而降低,呈现剂量依赖性,后续实验H₂O₂浓度选择200 μmol·L^-1。与对照组相比,H₂O₂组中miR-29a的表达（0.56±0.12）下调,细胞活力［（59.67±10.09）%］和SOD含量［（52.97±6.64）U·mL^-1］降低,细胞凋亡率［（40.30±4.76）%］和ROS水平［（299.52±43.95)%］增加,BMF和BAK1 mRNA和蛋白表达均上调,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与H₂O₂组相比,H₂O₂+miR-29a模拟物组中miR-29a的表达（4.49±0.55）上调,细胞活力［（92.83±8.09）%］和SOD含量［（84.03±6.31）U·mL^-1］增加,细胞凋亡率［（18.74±2.48）%］和ROS水平［（143.13±21.32）%］降低,BMF和BAK1 mRNA和蛋白表达均下调,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;与H₂O₂组相比,H₂O₂+模拟物对照组上述指标变化均不大,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　上调miR-29a可促进H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞的细胞增殖、抑制细胞凋亡、减少氧化损伤,这些作用可能与BMF和BAK1的表达下调相关。