肿瘤基因治疗的研究进展

随着生命科学的高速发展,基因治疗已经成为目前肿瘤研究中的一项热门课题。肿瘤基因治疗常用的方式有导入抑癌基因、抑制癌基因的表达、自杀基因治疗、抑制血管生成、针对一些细胞因子的基因治疗、针对耐药基因的治疗和肿瘤DNA疫苗等等。用于肿瘤基因治疗的常用载体有病毒载体和非病毒载体。相信随着科学的进步,基因治疗手段的不断革新,肿瘤的基因治疗必将拥有广阔的应用前景。     

抑癌基因PTEN的研究进展及其与乳腺癌的关系

肿瘤的发生发展是多因素、多步骤、多阶段和多基因改变的过程,癌基因和抑癌基因是受累最多的两大类型,各种关键基因的改变是人类肿瘤形成和发展的基础。第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10,PTEN）基因是近几年新发现的抑癌基因。PTEN基因是继P53基因之后人类肿瘤中最常发生异常的抑癌基因,PTEN基因正常表达可以抑制肿瘤细胞侵袭、转移和生长,该基因异常将导致蛋白表达下降甚至完全不表达。在许多肿瘤包括神经胶质瘤、子宫内膜癌、前列腺癌、肝癌和乳腺癌等都有PTEN基因的缺失和突变。PTEN基因在肿瘤组织中的作用机制成为目前研究的热点,本文对PTEN的研究进展及其与乳腺癌的关系做一综述。     

肝癌细胞的基因修饰治疗研究进展

肝癌的基因治疗是肿瘤基因治疗的研究热点之一,其治疗方案包括:肝癌的抑癌基因治疗,肝癌的反义基因治疗,肝癌的自杀基因治疗和肝癌的免疫基因治疗。利用导入肝癌细胞的各种基因干扰或破坏肝癌细胞的代谢,从而杀死肝癌细胞,这称为肝癌细胞的基因修饰,本文就这方面研究进展作一综述。一、抑癌基因抑癌基因包括Rb、P53、P16、P21、myc、nm23等。人们在抑癌基因疗法研究中开展了两方面工作:一是利用抑癌基因疗法治疗已发生的肿瘤;二     

肺癌基因治疗的研究现状

介绍肺癌基因治疗(包括抑癌基因治疗、自杀基因治疗、抗血管生成治疗、阻止癌基因表达、免疫基因治疗和修饰基因治疗)的研究现状和存在的问题。     

外源性Rb基因转染对头颈肿瘤的抑制作用

目的 探讨外源性Rb基因对头颈肿瘤的抑制作用。方法 运用携带Rb基因的复制缺陷型腺病毒转染口腔鳞癌细胞株012，观察其体内和体外的抑癌效果。结果 腺病毒表达载体可有效地将外源性Rb基因转染012细胞并使其表达。体内、体外抑瘤实验表明：导入Ad-Rb基因的肿瘤细胞，其细胞生长曲线明显受抑制，Ad-Rb基因治疗组裸鼠肿瘤生长最为缓慢，与DL312和PBS对照组比较有显著性差异（P＜0．05）。结论 腺病毒介导的外源性Rb基因可有效地转染入口腔鳞癌细胞株，并抑制其生长。     

外源性Rb基因转染对头颈肿瘤的抑制作用

目的　探讨外源性 Rb基因对头颈肿瘤的抑制作用。方法　运用携带 Rb基因的复制缺陷型腺病毒转染口腔鳞癌细胞株 0 12 ,观察其体内和体外的抑癌效果。结果　腺病毒表达载体可有效地将外源性 Rb基因转染 0 12细胞并使其表达。体内、体外抑瘤实验表明 :导入 Ad- Rb基因的肿瘤细胞 ,其细胞生长曲线明显受抑制 ,Ad- Rb基因治疗组裸鼠肿瘤生长最为缓慢 ,与 DL312和 PBS对照组比较有显著性差异 (P<0 .0 5 )。结论　腺病毒介导的外源性 Rb基因可有效地转染入口腔鳞癌细胞株 ,并抑制其生长。     

RNA干扰及其在肿瘤研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法,该技术通过双链RNA的介导,可以特异性地阻断或降低相应基因的表达。在肿瘤研究中,通过RNAi技术可以选择性地抑制人类肿瘤相关基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的生长。该技术的应用为癌症的基因治疗提供了新的方法。本文综述了小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)的生成和作用机制以及RNAi在肿瘤研究中的应用。     

基因修饰细胞介导的肿瘤治疗

肿瘤的基因治疗最终是通过基因修饰细胞介导完成的。本文就免疫基因修饰的肿瘤细胞疫苗、自杀基因或抑癌基因修饰的细胞疫苗、基因修饰的树突状细胞疫苗以及基因修饰的淋巴细胞、造血干细胞等各种基因修饰细胞在介导肿瘤治疗中的特点、作用及进展作一综述。     

基因修饰细胞介导的肿瘤治疗

肿瘤的基因治疗最终是通过基因修饰细胞介导完成的。本文就免疫基因修饰的肿瘤细胞疫苗、自杀基因或抑癌基因修饰的细胞疫苗、基因修饰的树突状细胞疫苗以及基因修饰的淋巴细胞、造血干细胞等各种基因修饰细胞在介导肿瘤治疗中的特点、作用及进展作一综述。     

RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的研究进展

RNA干扰(RNAi)技术是利用双链RNA,高效、特异性降解细胞内同源信使RNA,从而阻断特定基因表达,使细胞出现靶基因缺失的表型。与反义寡聚核苷酸技术相比,RNAi技术具有更高的特异性,是更有效的方法。目前,RNAi技术是肿瘤基因治疗领域的一个热点技术,它抑制癌基因表达及肿瘤血管生成,沉默细胞凋亡相关基因、肿瘤转移相关基因及肿瘤耐药相关基因,在肿瘤基因治疗领域显示出广阔的应用前景。     

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用.方法 用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给子前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的 基凶的表达,而乳腺上皮细胞无表达.MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优丁任一单自杀基因(P＜0.01).在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中.该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的牛长.其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01).结论 腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统.     

自杀基因CD、TK的共表达对人肺腺细胞的杀伤作用

目的 观察双自杀基因的共表达与单自杀基因单独表达对癌细胞的杀伤作用。方法 分别构建了以CMV为启动子,含单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）和／或大肠杆菌嘧啶脱氨酶（Ecoli.CD)单、双自杀基因的真核表达载体。在脂质体介导下将基因导入细胞,经G418筛选出稳定表达的克隆。用PCR、半定量RT－PCR检测各组基因的整合及表达。给予前本药物5－氟胞嘧啶（5－flurocytosine,5-Fc)和／或无环岛苷（Ganciclovir,GCV)后,用MTT法测定各围基因组细胞的存活率。结果 单、双自杀基因均在GLC－82细胞中稳定表达,双基因转染组对细胞增殖的杀伤及旁杀伤效应高于单基因组。结论 TK＋CD／5－Fc GCV的双基因共表达体系较CD／6－Fc或TK／GCV单 基因体系对细胞具有更强的杀伤作用。     

Ad-VEGF-GFP-CD/TK双自杀基因系统对大肠癌的生长抑制作用及微环境中细胞因子活性的影响

目的评价重组腺病毒介导的Ad-VEGF-GFP-CD/TK双自杀基因系统对大肠癌Balb/c小鼠移植瘤的治疗作用及其引起的相关细胞因子的变化。方法Balb/c小鼠皮下接种CT26细胞,成瘤后给予双自杀基因系统治疗,计算肿瘤体积抑瘤率的动态变化,治疗结束后检测IL-2、IL-10、TNFα、IFNγ这4种细胞因子的表达水平。结果CD/TK双自杀基因系统对大肠癌的生长抑制作用明显;治疗后小鼠4种细胞因子水平均有升高,与对照组有显著差异(P<0.05)。结论重组腺病毒介导的CD/TK双自杀基因系统对荷大肠癌Balb/c小鼠的移植瘤有明显的抑瘤作用,其所导致的细胞因子的变化可能有助于加强其抗肿瘤效应。     

胞嘧啶脱氨酶和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗肝门部胆管癌的体内外实验研究

目的:观察逆转录病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(E.coli-cytosinedeaminase,CD)基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk)基因转染肝门部胆管癌的作用。方法:在脂质体lipofectamine的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317,收集其病毒上清,转染FRH细胞,用RT-PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine,5-Fc)和(或)无环鸟苷(ganciciovir,GCV)后,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法测定转基因组及未转基因组FRH细胞存活率。在0.8cm裸鼠肝门部胆管癌模型转染入双自杀基因后,给予5-Fc500mg/kg体重,GCV100mg/kg体重,1次/d,共10d,观察肿瘤生长情况。结果:双自杀基因在FRH细胞中可稳定表达,联合使用5-Fc和GCV对靶细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-Fc或GCV。在裸鼠实验性肝门部胆管癌,实验组肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.05);双自杀基因与单自杀基因的作用有显著差异(P<0.05)。结论:逆转录病毒介导自杀基因可有效地杀死肝门部胆管癌细胞,明显抑制裸鼠肝门部胆管癌生长,双自杀基因共表达较单一自杀基因有更强的抗肿瘤作用。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应。方法：采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela／TK细胞,并将其用于体外实验。结果：载体HSV-TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示,当Hela／TK细胞数占混合细胞10％时,低浓度(10mg／L)的GCV就可将50％左右的肿瘤细胞杀死。GCV作用后的实验组Hela／TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带。结论：逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK／GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应。     

大豆异黄酮对老龄大鼠雌激素水平和子宫雌激素受体表达的影响

目的将白细胞介素2（IL-2）基因修饰树突状细胞（DC）,观察其和对胰腺癌荷瘤裸鼠的治疗作用。方法将IL-2基因转染单个核细胞来源的DC后,用于激发自体细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,检测其对CTL的增殖和人胰腺癌PC3细胞杀伤性的影响：检测CTL对荷人胰腺癌PC3细胞肿瘤裸鼠肿瘤生长情况影响和对肿瘤细胞分裂指数和端粒酶活性的影响。结果IL-2基因修饰的DC细胞所激发的CTL对胰腺癌PC-3细胞有较强的抑制作用,并能抑制荷瘤裸鼠肿瘤细胞的分裂指数和端粒酶活性。结论IL-2基因修饰DC细胞激活的CTL抗PC-3肿瘤免疫作用明显增强,能明显抑制人胰腺癌PC3细胞种植瘤的生长。     

胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV 5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。     

Killing effect of coexpressing cytosine deaminase and thymidine kinase on rat vascular smooth muscle cells

Background Vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation following arterial injury plays a critical role in a variety of vascular proliferative disorders, such as atherosclerosis and restenosis after balloon angioplasty. Herpes simplex virus-thymidine kinase (HSV-TK)/ganciclovir (GCV) and E.coli cytosine deaminase (CD)/5-fluorocytosine (5-Fc) suicide gene systems have been successfully employed in cardiovascular gene therapy, respectively. We reasoned that coexpression of both HSV-TK with CD suicide genes would lead to increased cell killing. To test this imagine, the adenoviral vectors expressing TK and/or CD genes were developed and tested on vascular smooth muscle cells. Methods Adenoviral vectors, including Ad-EF1α-CD-cytomegolovirus (CMV)-TK coexpressing both CD and TK double suicide genes, Ad-EF1α-CD and Ad-CMV-TK expressing CD and TK respectively, and control vector Ad-CMV-LacZ, were constructed and prepared with homologous recombination in RecA+E.coli cells. Integration and expression of CD and/or TK gene were identified by PCR and Western blot. Primary cultured VSMCs were infected at a multiplicity of infection (MOI) of 20 with exposure to their matching prodrugs 5-Fc and GCV. Cell mortality was measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assays. Flow cytometry analysis was used to detect cell death. Apoptotic cells were analyzed using Hoechst 33342 fluorescence dye as a DNA probe. Genomic DNA cleavage of apoptotic VSMCs was tested by agarose gel electrophoresis. Results Recombinant adenovirus expressing CD and/or TK suicide genes were successfully constructed. Both single and double suicide genes could be integrated into adenoviral genome and expressed. Cytotoxic effects of Ad-EF1α-CD-CMV-TK double suicide genes combined with 5-Fc and GCV were higher than those of Ad-CMV-TK and Ad-EF1α-CD single gene groups. The rate of cell survival was only (9±3)% in the Ad-EF1α-CD-CMV-TK group, but (37±3)% in the Ad-CMV-TK and (46±4)% in the Ad-EF1α-CD groups (P&lt;0.05). Flow cytometry analysis indicated that the killing mechanisms of the groups were different. Necrosis and apoptosis were involved in the mechanism of the double gene group. Based on the DNA stainability with Hoechst 33342, the apoptotic rates of VSMCs in the Ad-EF1α-CD-CMV-TK ［(11.0±2.1)%］ and Ad-CMV-TK ［(12.0±2.2)%］ groups were higher than those in Ad-CMV-LacZ ［(1.2±0.11)%］ and Ad-EF1α-CD ［(5.0±1.8)%］ groups (P&lt;0.05, respctively). DNA smear could be observed in both Ad-CMV-TK and Ad-EF1α-CD-CMV-TK groups after administration of prodrugs. Conclusions The killing effect on rat VSMCs mediated by adenoviral CD/TK double suicide genes is superior to that of single suicide gene. The killing mechanism of recombinant adenovirus coexpressing CD/TK double suicide genes is mainly through cytotoxic effect and apoptosis.     

MDR1启动子调控的双自杀基因靶向杀伤耐药胶质瘤细胞的研究

目的探讨多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD、TK双自杀基因系统并加前体药物丙氧鸟苷及5 氟胞嘧啶（pcDNA3.MDR1P.CDTK/GCV+5-FC）对耐药胶质瘤细胞（C6/ADR细胞）的靶向杀伤作用。方法利用脂质体介导法将含有MDR1启动子调控的CD、TK双自杀基因的真核表达载体PcDNA3.MDR1P.CD.TK转染入C6/ADR细胞（C6/ADR/CDTK），利用PCR鉴定CD、TK基因的整合，利用RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达；然后以转染了质粒pcDNA3.MDR1P.CDTK的C6细胞（C6/CDTK）和正常C6/ADR细胞作为对照，分别加前体药物，利用生长曲线、流式细胞仪、平板克隆形成等方法研究双自杀基因对耐药胶质瘤细胞生长、细胞周期及增殖的影响。结果PCR结果显示，CD、TK基因均整合入C6和C6/ADR细胞中；RT-PCR结果显示，C6/ADR/CDTK细胞中CD、TK基因有特异性表达，而C6/CDTK细胞无特异性表达。应用前体药物后，C6/ADR/CDTK细胞增殖明显受抑；C6/ADR、C6/CDTK、C6/ADR/CDTK细胞经流式细胞仪检测G1期的细胞比例分别为32.68%、47.57%、99.93%（P＜0.05，其平板克隆形成率分别为(96.7±2.1)%、(86.7±1.9)%、(16.7±0.9)%（P＜0.05）。结论pcDNA3.MDR1P.CDTK/GCV+5-FC系统对C6/ADR具有较强的靶向杀伤作用。     

VEGF启动子介导双自杀基因重组腺病毒对LoVo细胞的体外杀伤作用

目的 探讨VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因重组腺病毒(Ad-VEGFP-CDglyTK)对大肠癌LoVo细胞的体外杀伤作用.方法 分别用重组腺病毒Ad-VEGFp-CDglyTK、Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK、Ad-CMV-CDglyTK转染大肠癌LoVo细胞,给予前药5-FC、GCV,测定LoVo细胞的集落形成、细胞存活率及该治疗系统的旁观者效应.结果 与Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK相比,Ad-VEGFp-CDglyTK系统对LoVo细胞的集落形成、细胞生长均具有更强抑制作用,并可见较明显的旁观者效应.而与CMV启动子的双自杀基因相比,其作用无显著性差异.结论 VEGF启动子驱动的双自杀基因治疗系统对大肠癌LoVo细胞有确切的杀伤作用,其作用强度与强启动子CMV驱动的双自杀基因治疗系统相似.