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目的:构建针对人microRNA—194过表达及抑制表达的慢病毒表达载体,寻找与探讨感染人骨肉瘤细胞系SO-SP-9607和U2-os的最佳步骤和方法。方法:利用PcR方法调取相应目的基因进行酶切,经电泳回收后与目的基因进行连接,产物转化细菌感受态细胞,对克隆进行PcR鉴定和测序对比分析后,构建相应microRNA—194过表达及抑制表达慢病毒表达载体;在人骨肉瘤细胞系SO-SP-9607和U2—os转染及筛选过程中,根据不同阶段及浓度设定相应实验组,并设相应对照组。倒置显微镜观察转染效率,筛选情况,进行比较。结果:PCR及测序结果证实重组慢病毒表达质粒构建正确。过表达及抑制表达重组慢病毒的滴度分别为15×10^8TU/ml及4×10^8TU/ml。感染复数(multiply of infection,MOI)值测定,实验组及对照组转染效率无明显差异,获得MOI值及感染时间数据。通过新的综合设计,经筛选后获得转染效率满意的目的克隆细胞。结论:成功构建了microRNA—194过表达及抑制表达慢病毒表达载体,并通过新的综合考虑设计,对人骨肉瘤细胞系SO-SP-9607和U2-os进行转染和筛选后,可较快和较高效率获得满意目的细胞。 相似文献
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目的:构建miR-513a-5p慢病毒过表达载体,转染人骨肉瘤细胞株,观察miR-513a-5p对人骨肉瘤细胞放疗敏感性的影响。方法:PCR法扩增人miR-513a-5p基因,克隆入pLentis-CMV-GFP-MCS-PGK-PURO载体获得重组质粒pLentis-miR513a,双酶切鉴定并测序后将正确的重组质粒和对照质粒转染293FT细胞制备慢病毒,分别转染骨肉瘤HOS和U2OS细胞,qRT-PCR法及荧光显微镜鉴定转染结果。克隆形成实验、MTT法检测miR-513a-5p高表达HOS和U2OS细胞在X射线照射下细胞存活情况。结果:双酶切及测序结果确定成功构建miR-513a-5p慢病毒载体pLentis-miR513a。qRT-PCR结果提示,转染骨肉瘤细胞株后miR-513a-5p表达显著升高。克隆形成实验结果显示miR-513a-5p高表达后骨肉瘤细胞在X射线照射下细胞增殖减慢。MTT结果提示miR-513a-5p高表达骨肉瘤细胞经X射线照射后细胞存活减少。结论:成功构建了miR-513a-5p慢病毒载体,建立了高效稳定表达miR-513a-5p的骨肉瘤细胞株,高表达miR-513a-5p能显著增加X射线照射后骨肉瘤细胞的放疗敏感性。 相似文献
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背景与目的:微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性的非编码小分子RNA,其主要通过与靶mRNA作用抑制转录后的翻译。miR-96是在多类肿瘤细胞中高表达的小RNA分子。本研究旨在检测miR-96在骨肉瘤组织中的表达,并研究其在骨肉瘤细胞的增殖、细胞周期及凋亡中的意义。方法:运用TagMan MGB探针法检测40例骨肉瘤组织及对应的骨组织中miR-96的表达;应用反义技术降低骨肉瘤细胞(U2-OS和MG-63)中miR-96的表达;采用MTT比色法检测细胞增殖的改变;应用流式细胞技术检测骨肉瘤细胞细胞周期和凋亡情况。结果:在40例骨肉瘤组织中,62.5%(25/40)的骨肉瘤组织miR-96表达明显高于对应骨组织(P<0.05);反义miR-96转染骨肉瘤细胞U2-OS和MG-63后,miR-96的表达明显降低,U2-OS和MG-63骨肉瘤细胞生长受到明显抑制,其生长主要停滞在G0/G1期,而S期和G2/M期细胞的比例下降。另外,降低miR-96的表达,U2-OS和MG-63骨肉瘤细胞早期凋亡明显增加。结论:miR-96在骨肉瘤组织中表达明显上调,降低其表达能明显抑制U2-OS和MG-63骨肉瘤细胞的生长,并诱导细胞早期凋亡增加,miR-96可能成为骨肉瘤基因表达调控的新靶点。 相似文献
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目的:构建miR-21慢病毒表达载体,感染多发性骨髓瘤(MM)细胞U266,建立稳定表达miR一21的U266细胞系。方法:以has—miR-21前体序列pre—miR-21为模板,设计并合成引物,进行PCR扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒LV—anti中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,所构建载体命名为LV—anti—miR-21-MOI。再进行miR-21基因慢病毒LV—anti—miR-21的包装及病毒滴度测定,将慢病毒颗粒以最适滴度感染MM细胞株U266,通过Aldefluor流式分选出带有目的基因和空载病毒的细胞,用real—timePCR检测感染效率。结果:目的基因与慢病毒载体连接成功。慢病毒LV—anti—miR-21浓缩后的病毒滴度约为1.0×108TU/ml。慢病毒成功感染目标细胞U266,转染效率达90%以上。real—timePCR检测,U266/LV—anti—miR-21慢病毒MOI20组和MOI40组miR-21表达量分别为0.69±0.03和0.51±0.05较U266/un组(1.08±0.05)下降了38.9%和54.9%,差异有显著统计学意义(P〈0.05)。结论:成功构建了miR-21慢病毒表达载体,并建立U266-miR-21稳定转染细胞系。为进一步研究miR-21的功能及作用机制奠定了基础。 相似文献
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目的:探讨miR-186对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响,并探讨其可能机制.方法:实时荧光定量PCR检测骨肉瘤细胞HOS、U2-OS、Saos-2及成骨细胞NHOst中miR-186表达,并运用人工合成的miR-186模拟片段及对照scramble mimic转染至人骨肉瘤HOS及U2-OS细胞内,运用实时荧光定量PCR检测转染后细胞中miR-186的表达水平;分别运用CCK-8法、流式细胞检测技术及Transwall体外侵袭实验检测过表达miR-186对HOS及U2-OS细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响;运用Westem blotting及实时荧光定量PCR检测miR-186过表达对细胞中垂体瘤转化基因1(pituitary tumor transforming gene 1,PTTG1)的蛋白及mRNA表达水平的影响.结果:骨肉瘤细胞中miR-186呈现低表达;转染人工合成的miR-186片段可上调HOS及U2-OS细胞中miR-186的表达;miR-186过表达组细胞的增殖能力较scramble组明显下降(P<0.01),转染组HOS[(16.9±2.1)% vs(10.4±1.6)%,P<0.05]及U2-OS[(22.6±2.9)% vs (14.1±2.2)%,P<0.05]细胞的凋亡比例明显高于scramble组,转染组HOS及U2-OS细胞的穿膜数明显低于scramble组(P<0.01);转染组细胞中PTTG1的蛋白及mRNA表达水平均明显下降(P<0.01),而scramble组无明显变化(P>0.05);结论:miR-186能够抑制骨肉瘤细胞的增殖及侵袭并促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制PTTG1表达相关. 相似文献
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人miR-34a真核表达载体的构建及其表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建人miR-34a的真核表达载体,并使其在骨肉瘤SOSP-9607细胞中表达.方法:从人骨肉瘤SOSP-9607细胞基因组DNA中用PCR法扩增出miR-34a的前体序列,并引入酶切位点和保护碱基,双酶切后定向插入真核表达载体pcD-NA3.1(+)中,构建miR-34a真核表达载体pcD-NA-miR34a,然后进行菌落PCR、酶切和测序鉴定.同时用构建好的载体pcDNA-miR34a转染骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞,筛选miR-34a稳定表达细胞系,用Northern blot及real time RT-RCR法鉴定pcD-NA-miR34a可于真核细胞中过表达miR-34a的生物学特性.结果:成功构建了人miR-34a真核表达载体pcDNA-miR34a.pcDNA-miR34a可于骨肉瘤SOSp-9607细胞中上调miR-34a的表达,获得了miR-34a高表达骨肉瘤细胞系.结论:miR-34a的真核表达载体可在骨肉瘤细胞SOSP-9607细胞中有效表达,为进一步研究miR-34a在骨肉瘤中的功能及基因调控机制奠定了实验基础. 相似文献
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目的:探讨不同miR-153干预对骨肉瘤细胞系MG-63侵袭能力的影响。方法:培养骨肉瘤细胞MG-63并随机分为miR-153过表达组、miR-153沉默表达组及阴性对照组,依次分别转染miR-153 mimic、miR-153 inhibitor及空白对照质粒;Real-time PCR检测转染后细胞中miR-153表达以确定细胞模型构建成功;Real-time PCR和Western blot检测转染后细胞中侵袭相关蛋白ROCK1和ROCK2的表达;Transwell侵袭实验检测转染后细胞侵袭能力的变化;理论预测miR-153与ROCK1/ROCK2的靶向结合作用。结果:相比于阴性对照组,miR-153过表达组、miR-153沉默表达组MG-63细胞内miR-153表达水平分别上调和下调,细胞模型构建成功;Real-time PCR和Western blot结果显示,相比于阴性对照组,miR-153过表达组、miR-153沉默表达组MG-63细胞内侵袭相关蛋白ROCK1和ROCK2的mRNA表达变化不明显而蛋白表达水平分别降低和增高;Transwell侵袭实验结果显示上调及沉默miR-153后,MG-63细胞侵袭能力分别下降和增强;Targetscan生物学软件理论预测miR-153与ROCK1/ROCK2同时存在结合位点。结论:不同miR-153干预可明显影响骨肉瘤细胞MG-63的侵袭能力,而这种影响可能通过miR-153-ROCK1/ROCK2途径实现。 相似文献
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目的 探讨miR-361-5p对骨肉瘤细胞放射敏感性的影响及其可能的下游调控机制。方法 构建放射抵抗的骨肉瘤细胞系HOS-R,利用RT-qPCR检测miR-361-5p在HOS和HOS-R细胞中的表达情况;上调或下调miR-361-5p表达、敲低FoxM1,以克隆形成实验和流式细胞术检测miR-361-5p对HOS-R细胞存活率和细胞凋亡率,通过双荧光素报告基因实验和蛋白免疫印迹实验检测miR-361-5p与FoxM1的靶向关系。构建FoxM1过表达载体,采用克隆形成实验和流式细胞术检测miR-361-5p通过FoxM1对骨肉瘤细胞放射敏感性的影响。结果 RT-qPCR检测结果显示,miR-361-5p在HOS-R细胞中低表达。克隆形成实验和流式细胞术检测结果显示,过表达miR-361-5p可显著降低HOS-R细胞的生存率,增加其细胞凋亡率,与敲低FoxM1结果相反。双荧光报告基因实验证实miR-361-5p靶向负性调控FoxM1表达,FoxM1可逆转miR-361-5p对细胞HOS-R放射敏感性的促进作用。结论 miR-361-5p可负调控FoxM1,并影响骨肉瘤细胞的放射敏感性。 相似文献
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目的:胸大肌皮瓣是头颈部术后缺损常用的修复皮瓣,但由于它的臃肿常导致术后较高的并发症发生。本文将介绍我院采用胸大肌皮瓣去脂、原位皮片植皮在鼻咽癌放疗后颈部复发术后皮肤缺损修复中的应用。方法:对2007年1月-2012年1月就诊中山大学肿瘤防治中心的8例鼻咽癌根治性放疗后颈部复发侵犯颈部皮肤及皮下组织患者,采用胸大肌皮瓣去脂、原位皮片植皮修复颈部大面积皮肤及皮下组织缺损。常规取胸大肌皮瓣,切除皮瓣的皮肤及皮下脂肪,从切除的皮肤中获取表皮和真皮层植皮在胸大肌上,打包7天。结果:皮瓣大小6cm×9cm-6cm×15cm,常规测量切除的皮下脂肪厚度,平均15.13mm(n=8)。所有皮瓣及移植皮片均存活良好,所有患者对术后供区、受区外观满意。结论:本方法简便易行,创伤小,成活率高,改善胸大肌皮瓣臃肿的同时修复了颈部皮肤缺损,不仅能恢复功能,还有较好的外形。 相似文献
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Growth inhibition and sensitization to cisplatin by zoledronic acid in osteosarcoma cells 总被引:4,自引:0,他引:4
Benassi MS Chiechi A Ponticelli F Pazzaglia L Gamberi G Zanella L Manara MC Perego P Ferrari S Picci P 《Cancer letters》2007,250(2):194-205
Since osteosarcoma is a drug-resistant disease, the aim of the present study was to explore the possible interest of therapeutic approaches including nitrogen-containing biphosphonate zoledronic acid using osteosarcoma cell lines with different genetic backgrounds. Parental p53+/pRb+ U2-OS, p53-mutant U2-OS (U2-OS/175) and p53−/pRb− SAOS were sensitive to zoledronic acid with no significant differences in IC50 values. Analysis of cell cycle distribution revealed a time-dependent shifting of U2-OS cells towards G2 phase with cell cycle arrest in G2 phase at 96 h of exposure to the compound. Conversely, U2-OS/175 and SAOS cells responded to treatment with transient cell accumulation in S phase up to 48–72 h, respectively. Cell lines were exposed to increasing concentrations of cisplatin alone or combined with sub-toxic doses of zoledronic acid. A growth inhibitory effect was seen after combined treatment in U2-OS, otherwise resistant to cisplatin up to 100 ng/ml. Zoledronic acid did not efficiently sensitized U2-OS/175 and SAOS to cisplatin, thereby suggesting that different behavior may depend on p53 mutation. This data was confirmed in U2-OS cells where p53 expression was downregulated by RNA interference. Present findings indicate occurrence of sensitization to cisplatin by zoledronic acid in wild-type p53 osteosarcoma cells but not in p53-null cells nor in cells expressing a dominant-negative form of p53, supporting that wild-type p53 is required for synergistic interaction of cisplatin and zoledronic acid. 相似文献
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目的构建并鉴定Nodal基因的RNA慢病毒表达载体,探讨Nodal基因对胃癌及血管生成的作用。方法针对Nodal mRNA设计siRNA,构建慢病毒质粒,测序鉴定质粒构建成功。将构建的慢病毒质粒及包装质粒共转染293T细胞,鉴定慢病毒包装成功,并测定其滴度。将慢病毒转染人胃腺癌细胞株MKN-45,通过qPCR检测Nodal基因表达。流式细胞仪检测细胞凋亡。Cellomics仪观察人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管生成。结果通过测序显示,插入Nodal基因RNAi序列正确。包装后测定病毒滴度达(5.0×10~8)TU/ml,qPCR检测提示RNA干扰病毒转染MKN-45细胞株后,Nodal基因表达水平显著下降。干扰后胃癌细胞凋亡率明显上升(P<0.05),干扰Nodal基因对血管生成无显著影响(P>0.05)。结论成功构建了人Nodal基因的RNAi慢病毒表达系统。干扰Nodal基因显著增加胃癌细胞凋亡。 相似文献
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背景与目的:维甲酸诱导基因G(retinoic acid-induced gene G,RIG-G)是从急性早幼粒细胞性白血病细胞系NB4细胞中克隆出的肿瘤抑制基因。我们通过调控基因(Tet-on)系统构建受强力霉素(doxycycline,DOX)诱导RIG-G基因表达的A549细胞系,并观察其对A549细胞增殖的作用。方法:采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术扩增RIG-G基因片段,利用LR重组系统构建pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒载体,对该慢病毒载体和Tet-on慢病毒载体包装和病毒滴度测定后,感染A549细胞;采用有限稀释法筛选稳定株;使用细胞免疫荧光和蛋白[质]印迹法(Western blot)鉴定RIG-G基因受DOX调控表达的效果;CCK-8试验检测细胞增殖能力。结果:成功构建pLenti6/TO/V5-GIM-RIG-G慢病毒载体,包装后测得其活性滴度为1.0×108 TU/mL;慢病毒经Tet-on包装后物理滴度为4×109 VP/mL;RIG-G蛋白成功地在慢病毒感染后的A549稳定株中合成和表达,并且受DOX的诱导调控。RIG-G蛋白表达成功后,A549细胞的增殖与对照组相比显著降低(1.168±0.107 vs 2.099±0.162,P<0.05)。结论:本研究成功建立了RIG-G基因可调控表达的A549稳定株;RIG-G蛋白对A549的增殖有抑制作用。 相似文献