应用焦磷酸测序法检测MEG3基因在急性髓系白血病中的甲基化状态

目的检测MEG3基因启动子区在急性髓系白血病(AML)患者骨髓细胞中的甲基化状态,并探讨其在AML中的临床意义。方法以54例初诊AML患者骨髓细胞标本为研究对象,11例缺铁性贫血患者骨髓细胞标本、10例健康人外周血标本为对照。常规提取DNA并用亚硫酸氢盐处理。然后用PCR扩增目标序列,采用焦磷酸测序法检测MEG3基因甲基化状态。结果 (1)MEG3基因的高甲基化状态与AML患者的年龄、性别、白细胞总数、血红蛋白量、血小板计数等指标及临床分型间均未发现显著相关性。(2)AML患者低甲基化5例,高甲基化49例,高甲基化的比例为90.7%(49/54);缺铁性贫血患者对照组低甲基化6例,高甲基化5例,高甲基化的比例为45.5%(5/11);而在正常人对照组低甲基化10例,无高甲基化者,高甲基化的比例为0%;AML患者甲基化状态明显高于另外两组,差异有统计学意义(P<0.05),缺铁性贫血患者对照组与正常人对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MEG3基因启动子区的异常甲基化与急性髓系白血病的发生有关,对诊断、评价AML有一定意义。     

焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子甲基化方法的建立

目的：建立基因启动子甲基化的焦磷酸测序检测方法,为基因启动子甲基化标志物的检测奠定基础。方法：从正常人全血中提取基因组DNA。采用复合巢式PCR的方法扩增目的基因,克隆构建对照标准品质粒。使用甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子CpG岛的5个甲基化位点,双脱氧测序验证。将阳性和阴性对照标准品质粒PCR扩增产物按不同比例混合后进行焦磷酸测序,检测每个点的甲基化程度,制作校正曲线。结果：构建了甲基化特异性焦磷酸测序阴性对照和阳性对照标准品。经焦磷酸测序检测后,阴性对照标准品甲基化程度为0％,阳性对照标准品甲基化程度为100％,与双脱氧测序结果一致。经对混合样品检测,甲基化频率符合线性关系,线性相关性大于0.99,斜率约为1,并且所有位点的标准偏差约为1％。结论：成功构建了甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2启动子区域甲基化阳性对照和阴性对照标准品质粒。建立了甲基化特异性焦磷酸测序检测基因启动子甲基化的方法。     

大鼠Ins1基因启动子区域DNA甲基化状态的研究

目的:研究大鼠Ins1(Insulin 1)基因启动子在各种组织中DNA甲基化的状态及在转化分化过程中甲基化的变化情况,为从表观遗传学方面研究Ins1基因表达调控的机制奠定基础。方法:通过RT-PCR检测大鼠胰岛、大鼠胰岛素瘤细胞(INS-1)及大鼠肝干细胞(WB)中Ins1基因的表达情况。采用重亚硫酸盐测序法分析这三种细胞位于转录起始位点上游400 bp的Ins1基因启动子区域DNA甲基化的状态,并用焦磷酸测序法分析大鼠肺、脾、皮肤、小肠、脂肪和肝脏组织的甲基化状态及WB细胞转入PDX1慢病毒后甲基化的变化情况。结果:大鼠胰岛和INS-1细胞中Ins1基因高表达,启动子区域的甲基化程度非常低,而在大鼠肺、脾、皮肤、小肠、脂肪、肝脏组织和WB细胞中Ins1基因不表达,启动子区域的甲基化程度很高,当WB细胞转入PDX1慢病毒后可使Ins1基因启动子区域的甲基化程度降低。结论:Ins1基因的表达受甲基化调控,PDX1单个转录因子虽可降低Ins1基因甲基化程度但并不能使其完全去甲基化并表达Ins1基因。     

甲基化芯片筛选结核感染相关基因及后续验证

目的 筛选活动性结核患者DNA甲基化水平显著变化的基因并进行验证。 方法 ①纳入年龄与性别匹配的9例活动性结核患者、3例潜伏性结核患者和3例健康对照,将人血中单个核细胞DNA与芯片杂交,比较结核组与健康组的甲基化差异基因,并对差异基因进行GO功能和Pathway功能分析,以及与表达芯片进行联合分析;②收集年龄与性别匹配的活动性结核与健康对照各60例,分别提取全血DNA,使用焦磷酸测序方法对甲基化芯片预测出的结核病相关基因（TLR1、TLR2、TLR4）进行甲基化程度检测。 结果 ①活动性结核患者与健康对照对比,大部分呈现甲基化下调状态,GO分析和Pathway分析结果显示,甲基化差异基因的功能主要富集在白细胞分化、凋亡、自噬、细胞因子调节及炎症反应等与结核密切相关的生物过程中;②待验证的3个基因TLR1、TLR2、TLR4包含10个CpG位点,其中TLR1基因的CpG1位点（P<0.001）呈现高甲基化状态,TLR4基因的CpG2位点（P=0.012）呈现低甲基化状态。 结论 在结核分枝杆菌感染过程中存在基因组DNA的甲基化状态改变,以低甲基化变化为主。其中TLR1基因呈现高甲基化状态,TLR4呈现低甲基化状态,提示上述基因可能在结核病的发生发展过程中具有一定的作用。     

焦磷酸测序法和Sanger测序法检测丙型肝炎病毒基因分型的方法学比较

目的探讨焦磷酸测序法检测丙肝分型在临床应用中的准确性和敏感性,评价其方法的优缺点。方法收集100 例丙肝患者的血浆标本,分装相同的2 份,通过焦磷酸测序法和Sanger 测序法分别进行丙型肝炎病毒基因分型的检测,对两种测序方法的结果进行比较。结果焦磷酸测序法和Sanger 测序法检测HCVRNA基因分型时,100 例标本中,92例结果一致,8例结果不一致,一致率为92%。其中,HCV-RNA病毒载量>1×104 IU/ml 有80 例,其测序结果完全一致为100%,HCV-RNA 病毒载量<1×104 IU/ml 有20 例,其中焦磷酸测序共检测20 例,Sanger测序法共检测14 例,12 例结果相同。结论焦磷酸测序法检测丙型肝炎病毒基因分型,不仅结果准确可靠,而且与Sanger 测序法比较,其敏感性更高。此外,焦磷酸测序还可以进行定量分析。     

焦磷酸测序法鉴定临床常见病原菌

目的 建立高效的焦磷酸测序鉴定临床常见病原菌的方法.方法 在细菌16S rRNA的V1及V3可变区两端保守序列设计PCR扩增通用引物及焦磷酸测序引物,PCR扩增后焦磷酸测序测定V1及V3可变区序列,测序结果与数据库比对判断细菌种属.结果 在4 h内完成96株细菌的鉴定,所有菌株鉴定结果与常规鉴定结果一致.结论 焦磷酸测序技术可以用于临床分离菌株的鉴定,且具有费用相对低廉、高通量、鉴定能力强等优点.     

结核感染相关差异基因的甲基化芯片筛选及验证

目的应用甲基化芯片筛选活动性结核患者DNA甲基化水平显著变化的基因。方法①甲基化芯片筛选:纳入9例活动性结核患者、3例潜伏性结核患者和3例健康对照（年龄与性别均匹配）,分别提取人全血单个核细胞DNA并进行亚硫酸盐转化,与Illumina HD 450K Infinium MehtylationBeadChip芯片杂交,比较3组间甲基化差异基因,进行聚类分析,检测甲基化差异片段（DMRs）,对差异基因进行GO和KEGG pathway功能富集分析并与表达芯片进行联合分析,筛选结核感染相关差异基因,用于大样本验证。②大样本验证:收集活动性结核患者与健康对照各60例（年龄与性别均匹配）,分别提取人全血DNA并进行亚硫酸盐转化,使用焦磷酸测序方法对甲基化芯片预测出的结核病相关基因（IFNGR2、PTPN6、CRK1、ATP6V0B、WIF1、DKK1和SFRP1）进行甲基化程度检测;RT-PCR方法进行上述基因mRNA表达检测。结果活动性结核患者与健康对照相比,呈现低甲基化改变的片段占绝大部分,大部分的DMRs位于基因主体区域,其次为转录起始位点上游区域,DMRs分布最少的区域为3′UTR区。GO与Pathway功能富集结果显示,甲基化差异基因的功能主要富集在白细胞分化、凋亡、细胞因子调节及炎症反应等与结核病密切相关的生物过程中。待后续验证的7个结核病相关甲基化差异基因IFNGR2、PTPN6、CRK-1、ATP6V0B、WIF1、DKK1和SFRP1包含32个CpG位点,其中,16个CpG位点显示出统计学差异（P<0.05）,分布于6个基因:PTPN6、WIF1、CRK1、SFRP1、DKK1、IFNGR2。发生高甲基化的基因为PTPN6,发生低甲基化的基因为WIF1、CRK1、SFRP1、DKK1、IFNGR2。SFRP1和CRK-1基因mRNA表达在活动性结核患者中显著升高。结论在结核感染过程中存在基因组DNA的甲基化状态改变,且以低甲基化变化为主。SFRP1基因和CRK-1基因mRNA在结核组中表达上调。SFRP1和CRK-1在结核病发病过程中的作用不可忽视。     

大规模并行焦磷酸测序技术简介

在后基因组时代,基因研究的焦点已经转移到每个人的基因组,因此迫切需要高通量的测序方法。近几年,出现了基于焦磷酸的新测序方法——大规模并行焦磷酸测序技术。在这项技术中,双链DNA首先被片段化,每单个寡核苷酸链分子结合到磁珠支持物上,用乳液PCR对结合的片段进行扩增。扩增后的片段-磁珠复合物被分别置于光纤芯片上的皮升级反应容器中。然后将DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷二磷酸酶等反应试剂加入到反应容器,经过聚合、硫酸化、氧化即可产生强度与结合的核苷酸数目线性相关的光信号,每个反应容器发出的光就能被探测到。利用这项技术在4.5h内可测序2000万～3000万碱基对,准确度达到99%或更高,并且无需在细菌体内进行亚克隆。大规模并行焦磷酸测序开启了个体化基因组学的新时代。     

DNA甲基化的分析与状态检测

DNA甲基化是指由甲基转移酶介导，以S-腺苷-L广甲硫氨酸为甲基供体，在胞嘧啶5位碳原子上加入一甲基基团，使之变成5甲基胞嘧啶的化学反应。DNA甲基化是最常见的复制后调节方式之一，在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用^[1]，与某些肿瘤和遗传病的发生密切相关^[2]。DNA甲基化的分析检测将成为相关肿瘤和遗传病的分子诊断手段。近年来，DNA甲基化检测技术有了很大的发展和完善。在此，按DNA甲基化检测的目的对DNA甲基化分析检测的技术方法的原理和特点作简要综述。     

DNA甲基化检测技术进展及经验总结

DNA甲基化作为一种表观遗传学元件,参与正常细胞的发育分化、基因组印记、X染色体失活和染色质重构等生命过程,在肿瘤演进中亦发挥重要作用。为满足不断深入的研究需求,DNA甲基化检测技术得到了较快的发展,检测的灵敏度和特异度不断提高,并逐步从个别位点向高通量检测发展。该文综述了目前常用的DNA甲基化分析方法,并简要总结了其在应用中的关键点和经验。     

DNA甲基化的生物学意义及其检测方法

DNA甲基化是基因表达调控中一种常见而又重要的机制，参与细胞分化与增殖、生物体老化、肿瘤发生等多种重要生命活动。文章简要叙述了DNA甲基化异常的病理学意义，分类介绍了目前主要的甲基化检测方法。希望对相关领域的研究有所助益。     

DNA甲基化与结直肠癌

DNA甲基化是肿瘤常见的表观遗传学改变,是一种在原核和真核生物基因组中常见的复制后修饰,参与体内多种重要的生理过程,同时在肿瘤的发生和发展中也起着重要的作用。近年来,DNA甲基化成为表观遗传学研究的热点,一些甲基化事件可望成为早期诊断结直肠癌的重要分子靶标,因此对结直肠癌DNA甲基化进行深入研究,对于结直肠癌的临床早期诊断、治疗和预防都具有重要的指导意义。现就结直肠癌中的DNA甲基化研究进展作简要综述。     

DNA甲基化在原发免疫性血小板减少症作用机制中的研究

原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)是以血小板减少伴或不伴皮肤黏膜出血为主要临床表现的一组疾病[1],主要与体液及细胞免疫介导的血小板破坏过多、巨核细胞成熟障碍或血小板生成不足有关[2],目前其发病机制尚未完全明了.许多研究表明,DNA甲基化在ITP中起到一定作用[3].现就DNA甲基化在ITP作用机制中的研究作一综述,以期从表观遗传学的角度探讨ITP的发病机制,为ITP的防治提供新的理论依据.     

DNA甲基化的相关研究进展

DNA甲基化是真核生物表观遗传学中一种重要的基因表达调控方式,是一种酶催化的修饰过程。其是在DNA甲基转移酶催化下,将甲基基团转移到胞嘧啶的5位碳原子上,使之转变成5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程。在人类和其他哺乳动物中,此修饰过程通常发生在5'-Cp G-'二核苷酸的胞嘧啶上。大量相关研究表明,DNA甲基化与人类疾病密切相关。     

DNA甲基化与肿瘤的相关研究进展

表观遗传学改变是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化,如DNA甲基化和组蛋白修饰等。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下,将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基团共价结合到CpG二核苷酸的胞嘧啶5碳位上的过程。目前CpG岛异常高甲基化所致抑癌基因转录失活以及整个基因组异常低甲基化所致原癌基因的激活,已经成为肿瘤研究中的热点问题。     

骨髓增生异常综合征DNA甲基化研究进展

骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome,MDS）是一组异质性克隆性血液系统恶性肿瘤。近年来研究发现,骨髓增生异常综合征相关基因异常甲基化在MDS的发生、发展、药物反应及预后中扮演者非常重要的角色。文章就骨髓增生异常综合征中的基因异常甲基化及去甲基化治疗研究进展进行综述。     

肝癌DNA甲基化的研究进展

肝癌的发生同其他人类肿瘤一样,都是由表观遗传学异常和基因改变共同引起,DNA甲基化是表观遗传学上研究最为深入的一种机制。在肝癌的发生发展过程中,抑癌基因等肿瘤相关基因的高甲基化和整个基因组水平的低甲基化起着重要作用,肝癌的甲基化研究对肝癌的早期诊断和病情预后的监测及其防治具有重要意义。在此对肝癌DNA甲基化特征及其临床意义进行阐述。     

DNA甲基化与非小细胞肺癌临床关系研究进展

DNA甲基化与肿瘤临床关系是目前肿瘤分子生物学研究的热点。研究显示,DNA甲基化是非小细胞肺癌(NSCLC)诊断、分期及治疗预后特异性较强的标识物。NSCLC患者血清或呼吸道分泌物DNA甲基化检测标本易于获取,无需切取活体组织,检验技术实用方便,对NSCLC的临床及预后具重要意义。     

DNA甲基化羟化酶TET1的研究进展

TET1作为TET蛋白家族的一员,是一种α-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶,能转化5-甲基胞嘧啶(5m C)为5-羟甲基胞嘧啶(5hm C),从而启动DNA去甲基化程序。TET1既能对胚胎干细胞分化基因保持沉默,又能使其多能性基因保持激活,这种双管齐下的调控方式保持了胚胎干细胞自我更新能力和多能性潜力。TET1与肿瘤、精神疾病及白血病等疾病密切相关,因此TET1的研究对于拓展DNA去甲基化、胚胎干细胞基因调控及探求临床疾病治疗新靶向具有潜在价值。