骨髓间充质干细胞的生物学特性及其向心肌样细胞的分化

【目的】体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),分析其生物学特性;5-氮胞苷(5-Azacytidine,5-aza)定向诱导其向心肌细胞分化。【方法】采用体外密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志;用含有5-aza(10μmol/L)的培养液培养第二代MSCs24h,诱导其向心肌细胞分化;诱导4周后采用免疫荧光技术检测心肌细胞特异性标志物Connexin 43和TroponinⅠ的表达。【结果】体外分离培养的细胞形态主要为纺锤形和长梭形,细胞表面抗原CD29、CD44表达为阳性,CD34、CD45表达为阴性;经5-aza诱导后细胞表达心肌细胞特异蛋白Connexin 43和TroponinⅠ。【结论】MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞,体外经5-aza诱导可以定向分化为心肌样细胞。MSCs为心血管疾病的治疗提供了种子细胞。     

心肌条件培养液对体外骨髓间充质干细胞向心肌细胞诱导分化的影响

目的:观察心肌培养液中可溶性细胞因子对体外骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞诱导分化过程的影响;方法:10 μmol/L 5氮胞苷(5-aza)诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化后,实验分为两组:5-aza诱导组常规培养基培养,5-aza诱导 心肌条件培养组以1∶1混合的心肌条件培养液培养,观察与比较两组细胞形态,免疫细胞化学法和western blot技术分析心肌特异蛋白表达.结果:5-aza组细胞排列紊乱,5-aza诱导 心肌条件培养组细胞呈集落样排列,可见肌管形成,自诱导2周开始两组均见肌钙蛋白I(troponin I)阳性细胞,而troponin I、结蛋白(desmin)、连接蛋白-43(connexin-43)在诱导2周开始表达,3、4周达高峰,各时间点两组蛋白表达没有明显差异;结论:心肌条件培养液对心肌细胞的体外分化过程没有促进作用,但是可以加强体外诱导生成的心肌样细胞之间的有机排列.     

不同诱导条件对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的:已证实骨髓间充质干细胞体内移植能改善心脏功能,但其机制尚不清楚。观察不同诱导条件对骨髓间充质干细胞体外分化为心肌样细胞的影响。方法:实验于2005-05/2006-04在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。①实验材料:健康供体骨髓(自愿捐赠),孕16周水囊引产胎儿(胎儿家属同意捐赠)。②实验方法:取健康供体骨髓,采用淋巴细胞分离液并结合骨髓间充质干细胞贴壁特性分离细胞。取第4代骨髓间充质干细胞进行诱导实验,分为生物诱导组和化学诱导组。生物诱导组分别采用胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞直接混合培养、胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞间接混合培养及胚胎心肌细胞匀浆液诱导培养,化学诱导组用5,10,15μmol/L5-aza分别处理12,24,48h进行诱导。③实验评估:采用免疫细胞荧光染色法检测胞浆中的肌节肌动蛋白。结果:①骨髓间充质干细胞只有在其与胚胎心肌细胞直接混合培养时,才能分化为心肌样细胞,而在其他生物诱导模型下却未见其分化为心肌样细胞。②化学诱导组骨髓间充质干细胞经免疫细胞荧光染色鉴定后,均未见胞浆中有肌节肌动蛋白表达,证实经5-aza诱导处理后,未见骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞。结论:①胚胎心肌细胞可诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞,机械因素是促进骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞必不可少的因素之一。②骨髓间充质干细胞经5-aza诱导是否分化为心肌样细胞未能获得证实。     

骨形态蛋白2诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的 观察骨形态蛋白2体外诱导骨髓间充质干细胞(BMMSCs)定向分化为心肌样细胞的作用.方法 采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs,取第4代BMMSCs进行诱导:骨形态蛋白2组(BMP-2,终浓度为10 μg/L),空白对照组.诱导24h后更换常规培养液继续培养4周.倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化,免疫荧光染色法鉴定诱导后BMMSCs中心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的表达,Western Blot检测诱导2周和4周后Cx43以及cTnI的表达量,流式细胞计数法计算心肌样细胞诱导分化率.结果 原代培养的BMMSCs 2周形成集落,呈梭形或星形.传代细胞体积变大,诱导后细胞呈长梭形,呈一致性生长,并出现肌岛样结构.免疫荧光染色结果显示诱导后BMMSCs表达cTnI.Western Blot检测结果提示诱导后Cx43以及cTnI均明显增多,4周组明显高于2周组.流式细胞计数法显示:BMP-2组心肌样细胞诱导率为(17.9±0.8)％.结论 骨形态蛋白2可在体外诱导大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化率高.     

P53抑制剂诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的研究P53特异性抑制剂对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,取第4代骨髓间充质干细胞分为对照组(CON)和P53特异性抑制剂(PFT-α)组。观察骨髓间充质干细胞诱导前后细胞形态变化,流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面抗原及诱导后心肌样细胞分化率,免疫荧光法检测诱导后cTnI、CX-43表达,Western Blot法测定诱导后cTnI、P53、P21蛋白表达情况。结果原代培养的骨髓间充质干细胞2周形成集落,传代诱导后细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。流式细胞仪测定骨髓间充质干细胞表面抗原CD44阳性表达率为(89.98±1.29)%,CD45阳性表达率为(2.14±0.22)%。心肌样细胞鉴定结果显示:诱导后1周,空白对照组未见cTnI和CX-43免疫荧光表达,PFT-α组少量表达cTnI和CX-43;诱导后4周时,可见空白对照组少量表达cTnI和CX-43,PFT-α组强表达cTnI和CX-43。WesternBlot检测诱导1周时PFT-α组cTnI表达与对照组比较,有统计学差异(P<0.01)。诱导后4周,PFT-α组cTnI表达与对照组比较,有统计学差异(P<0.01)。两组cTnI表达量4周与1周比较有统计学差异(P<0.05)。诱导1周时,PFT-α组几乎不表达P53蛋白,PFT-α组与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。诱导4周时,PFT-α组与对照组比较有统计学差异(P<0.05)。PFT-α组诱导4周时P53、P21表达量与1周时比较均有统计学差异(P<0.05)。心肌细胞分化率结果显示,诱导4周时,PFT-α组与空白对照组比较有统计学差异(P<0.01)。结论通过P53特异性抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

目的:目前在5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化领域中,对用于诱导的细胞代次选择不一。实验选择第2,9代骨髓间充质干细胞,观察比较经5-氮胞苷体外诱导后其各自向心肌细胞分化过程中心肌特异性肌钙蛋白cTnT和早期分化基因的表达。方法:实验于2005-07/2007-07在天津中医药大学病理三级实验室完成。①实验方法:清洁级Wistar雄性大鼠,脱颈处死后取双侧股骨、胫骨,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞进行原代培养。去掉原代细胞瓶内的培养液,D-Hank’s液冲洗去除血清,胰蛋白酶 乙二胺四乙酸消化,制备单细胞悬液,按1∶3传代。用10μmol/L的5-氮胞苷分别诱导第2,9代骨髓间充质干细胞,诱导4周,并设立未加诱导剂的阴性对照。②实验评估:倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况及形态变化;免疫组织细胞化学法检测心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达,胞浆出现棕黄色颗粒状物质为阳性;嵌合荧光法检测心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量。结果:①细胞形态学观察:5-氮胞苷诱导前细胞生长较快,诱导后死亡细胞较多且生长较慢。诱导后2,3,4周,第9代骨髓间充质干细胞无论在形态和细胞活力方面均优于第2代。②心肌特异性肌钙蛋白cTnT的表达:5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌特异性肌钙蛋白cTnT阳性表达率明显高于第2代(22.42±9.97),(11.22±5.62)%,P<0.05,阴性对照无阳性表达。③心肌早期基因的表达:反转录-聚合酶链反应结果显示,5-氮胞苷诱导4周后,第9代骨髓间充质干细胞心肌早期基因NKx2.5、GATA-4、Desmin、α-actin的相对表达量均明显高于第2代(P<0.05)。结论:经5-氮胞苷诱导后,骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白cTnT及4种心肌早期基因,证实其能够向心肌细胞分化,且传至第9代时向心肌细胞分化的能力要强于第2代。     

虫草多糖体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞样细胞☆

背景:如何促进骨髓间充质干细胞向肝细胞完全意义上的转化,以便更有效改善病变肝组织的结构和功能将成为未来相关研究的重中之重。目的:探讨虫草多糖在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞样细胞的可行性。方法:采用贴壁法培养Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,实验分3组对骨髓间充质干细胞进行诱导分化,虫草组培养液中加虫草多糖进行诱导,终末质量浓度为0.15g/L;阳性对照组培养液中加肝细胞生长因子和表皮生长因子联合诱导,质量浓度分别为20μg/L和10μg/L;空白对照组仅用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液。结果与结论:分离纯化的骨髓间充质干细胞经流式细胞仪检测显示CD34阴性表达,CD44阳性表达。诱导分化7d时虫草组及阳性对照组细胞出现甲胎蛋白表达,14d时表达增强,28d时表达减弱,阳性对照组甲胎蛋白阳性率高于虫草组;诱导分化7d时阳性对照组细胞角蛋白18出现表达,14d时表达增强,虫草组则在14d时出现表达,而后持续。诱导分化7d时虫草组及阳性对照组白蛋白表达阴性,14d时出现阳性。诱导分化14d时虫草组及阳性对照组细胞糖原染色阳性,28d时表达减弱。空白对照组结果皆为阴性。结果可见虫草多糖可以在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞样细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外培养增殖过程及分化为心肌样细胞后的致瘤性实验

背景:人骨髓间充质干细胞在长期体外培养传代过程中,可突变为肿瘤干细胞,且移植后在体内能够形成恶性肿瘤,具有多向恶性分化特征,如畸胎瘤等.目的:探讨应崩白体血清培养的人骨髓间充质干细胞在体外增殖过程中及其诱导分化为心肌样细胞后的潜在致瘤性.设计、时间及地点:细胞学体外观察及体内植入实验,于2007-11/2008-04在河南省肿瘤医院干细胞实验室完成.材料:非恶性肿瘤的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者骨髓3 mL和外周静脉血50 mL.近交系BALB/C清洁级雌性小鼠12只,随机分为骨髓间充质干细胞组、心肌样细胞组、空白对照组,4只/组.方法;分离的人骨髓间充质干细胞从第2代开始,用自体血清培养并传至第9代.取生长良好的第6代细胞,加入10 μmol/L 5-氮杂-2′-脱氧胞苷向心肌样细胞定向诱导40 d.将经或未经诱导的骨髓间充质干细胞制成单细胞悬液,调整浓度至3.0×1010L-1,吸取0.2 mL分别接种于骨髓间充质干细胞组、心肌样细胞组小鼠皮下,空白对照组注射等量含胎牛血清的DMEM/F12培养液,40 d后留取活检组织.主要观察指标:流式细胞仪检测第1,3,6,9代细胞表面抗原CD34,CD44,CD45,HLA-DR的表达,测定细胞周期,并进行染色体核型分析,光镜下观察诱导后免疫组化结果.TRAP ELISA法检测端粒酶活性.Western blotting法分析c-myc和p16基因的表达.结果:第1,3,6,9代人骨髓间充质干细胞在自体血清体外培养过程中生长状态良好,数量充足,表面抗原标志CD44呈阳性,CD34,CD45及HLA-DR均呈阴性,80%以上细胞处于G0/G1期,正常二倍体分裂象＞90%,染色体核型正常,诱导后细胞Vimentin呈阳性表达,且表达心肌特异性标记Desmin,Troponin T.第3,6,9代人骨髓间充质干细胞及诱导后的心肌样细胞端粒酶活性分别呈弱阳性、阳性,但差异无显著性意义(P＞0.05),且c-myc和p16蛋白表达亦无明显差异.结论:人骨髓间充质干细胞在体外用自体血清培养可满足临床需要,数量充足,生长良好,无核型变异,定向诱导能分化为心肌样细胞.植入动物体内后无肿瘤发生,且端粒酶活性和c-myc,P16基因的表达无显著改变.     

骨形态发生蛋白2体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:目前研究者尝试使用各种细胞因子、中药单体和组织裂解液等诱导剂作用于其分化过程,用以修复梗死的心肌组织。目的:探索骨形态发生蛋白2在大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中的作用。方法:分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞。应用含有骨形态发生蛋白2的培养基定向诱导培养(对照组为普通培养基培养)72h,其后换用普通培养基继续培养4周。结果与结论:初分离的细胞经纯化培养后,显示CD29阳性、CD34阴性,符合骨髓间充质干细胞的特征,生长曲线显示各代细胞生长规律相近。经骨形态发生蛋白2体外诱导培养后,细胞形态狭长,排列紧密、方向一致。分化后的细胞均阳性表达C-TnI、C-TnT、desmin、α-sarcomericactin和P38MAPK。空白对照组则基本不表达以上蛋白。提示骨形态发生蛋白2可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外定向分化为心肌样细胞,是骨髓间充质干细胞体外心肌分化的一种新的有效诱导剂。     

骨形态发生蛋白2与P53抑制剂PFT-α联合诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的 观察骨形态发生蛋白2（BMP-2）与P53抑制剂PFT-α体外联合诱导骨髓间充质干细胞（BMMSCs）定向分化为心肌样细胞的作用.方法 采用密度梯度离心法分离大鼠BMMSCs,取第4代BMMSCs分四组诱导：（1）空白对照组,仅用完全培养基诱导;（2）骨形态发生蛋白2组（BMP-2,终浓度10 μg/L）;（3）P53抑制剂组（PFT-α,终浓度20 μmol/L）;（4）BMP-2联合PFT-α组（BMP-2＋ PFT-α,终浓度分别为10 μg/L与20 mol/L）.24h后换为普通培养液继续培养4周.用倒置相差显微镜观察细胞的形态学改变,免疫细胞化学法鉴定诱导后心肌样细胞中心肌特异标志物性肌钙蛋白Ⅰ （cTnⅠ）的表达,流式计数法计算诱导后心肌样细胞诱导率.结果 原代BMMSCs 10 d形成集落,呈星形或梭形.传代后细胞体积变大,诱导4周后细胞呈长梭形,生长趋于一致性,出现肌岛样结构.免疫细胞化学结果显示诱导4周后BMMSCs表达心肌特异性蛋白cTnⅠ.流式计数法结果显示：空白对照组、BMP-2组、PFT-α、BMP-2联合PFT-α组心肌样细胞诱导率分别为（1.4±0.3）％、（17.1±1.2）％、（28.2±1.0）％、（39.9±1.7）％,BMP-2联合PFT-α组心肌样细胞诱导分化率高于BMP-2组与PFT-α组（P＜0.01）.结论 BMP-2联合PFT-α可在体外诱导大鼠BMMSCs定向分化为心肌样细胞,其诱导分化率明显高于单纯BMP-2或单纯PFT-α诱导.     

Ca2＋信号介导红景天苷促进小鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的定向分化

背景：大量文献报道具有抗氧化作用的传统中药单体能促进骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化,红景天苷作为红景天的有效成分,具有较强的抗氧化功效。目的：探讨红景天苷影响小鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞定向分化的分子机制。方法：体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞达80%融合后,设立3组,空白对照组加入细胞完全培养液,诱导组、阳性对照组分别在其基础上加入20mg/L红景天苷、0.1mg/L神经生长因子,培养12h,采用RT-PCR和Westernblot法检测诱导后神经细胞相关基因和蛋白的表达。取诱导组细胞,分别加入含EGTA（细胞外Ca2＋螯合剂）、Nifedipine（L型Ca2＋通道阻断剂）、LY294002（IP3受体阻断剂）作用12h,进行生物学信号传导通路检测。结果与结论：①诱导组可见神经元特异性烯醇化酶、β-TubulinⅢ和Nurr1mRNA的表达,阳性对照组上述基因的表达丰度均低于诱导组,空白对照组未见上述基因的表达;各组GFAPmRNA表达丰度均极低,诱导组c-fosmRNA呈高丰度表达。②与阳性对照组比较,诱导组能明显促进骨髓间充质干细胞神经元特异性烯醇化酶蛋白的表达;空白对照组无神经元特异性烯醇化酶蛋白的表达。③EGTA,Nifedipine,LY294002分别阻断细胞外Ca2＋、L型Ca2＋通道、IP3受体后,神经元特异性烯醇化酶和Nurr1基因、蛋白的表达均显著下调。结果证实红景天苷能使骨髓间充质干细胞定向分化为神经细胞,其生物学信号的传导与Ca2＋信号有密切关系,IP3依赖的Ca2＋信号途径是实现信号传导的重要方式之一。     

骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

目的研究5-氮胞苷（5-Aza）对培养人骨髓间充质干细胞（MSCs）的作用,并对分化后的心肌样细胞进行鉴定。方法采用密度梯度离心法分离到骨髓单个核细胞（MB-MNC）,用含200ml／L胎牛血清的低糖型DMEM培养液进行培养。采用差速贴壁法纯化MSCs,用流式细胞仪检测细胞表面抗原。以5-Aza诱导第3代MSCs 24h后,继续培养。于培养的第4周,采用免疫细胞化学方法检测肌系特异性标记抗原结合蛋白（nesmin）,RT-PCR检测心肌早期转录因子GATA-4和心肌特异性蛋白肌钙蛋白T（cTnT）。结果MSCs经5-Aza诱导分化后表达Desmin、GATA-4和cTnT,未经诱导的同培养天数的MSCs中均呈未见表达。结论MSCs经5-Aza诱导后可以表现心肌样细胞特征。     

肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞表达及分泌肝细胞生长因子

背景：有研究表明,肿瘤坏死因子α可以刺激骨髓间充质干细胞发挥免疫抑制功能,并促进骨髓间充质干细胞表达肝细胞生长因子。目的：观察肿瘤坏死因子α刺激大鼠骨髓间充质干细胞是否可以促进肝细胞生长因子的表达及分泌。方法：全骨髓贴壁法分离、纯化 SD 大鼠骨髓间充质干细胞,传代至第三四代使用。以 100 μg/L 肿瘤坏死因子α预刺激骨髓间充质干细胞 5 h 后弃去培养基,换上新鲜培养基作为实验组,以正常培养的骨髓间充质干细胞为空白组。采用倒置相差显微镜观察细胞形态;流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞表面标记物 CD29、CD34、CD44、CD45 的表达;RT-PCR 、Western blot 检测细胞肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白表达;ELISA 测定细胞上清液中肝细胞生长因子水平。结果与结论：获得的骨髓间充质干细胞形态均一,呈典型的旋涡样生长。骨髓间充质干细胞表达 CD29＋99.45%,CD34-97.91%、CD44＋99.52%、CD45-98.42%;骨髓间充质干细胞中肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白与上清液中肝细胞生长因子表达量呈时间依赖性增加,实验组肝细胞生长因子 mRNA 及蛋白与上清液中肝细胞生长因子的表达量明显高于空白组（P 〈 0.01）。说明肿瘤坏死因子α刺激骨髓间充质干细胞可以有效促进肝细胞生长因子的表达及分泌。     

MTT法检测黄芪和丹参对人乳腺干细胞体外增殖的影响

目的：文献报道黄芪和丹参均可诱导间质干细胞向神经细胞分化。实验以乳腺癌患者乳腺再生为最终目的，通过MTT比色法分析不同剂量黄芪和丹参对体外分离培养的乳腺成体干细胞增殖的影响。 方法：实验于2006—0912007—09在吉林大学公共卫生学院放射生物实验室完成。①对象：女性非家族性乳腺癌癌旁病理证实为正常的乳腺组织取自吉林大学第一医院乳腺外科，共24例，患者年龄29-45岁，对治疗及实验均签署知情同意书。②实验方法：取切除的正常乳腺组织，去除血管及脂肪，剪碎至1．0mm’块，组织块消化培养传代后应用免疫磁珠分离收集MUC^-、ESA^＋标记的细胞，即乳腺成体干细胞，按1×10^8L^-1。密度接种于96孔培养板，无血清培养48h后更换培养基，设立4组：空白对照组不加任何药物；黄芪注射液组分为25，50，100，200mI几4个亚剂量；丹参注射液组分为12．5，25，50，100mL/L 4个亚剂量；黄芪＋丹参复合注射液组分为（25＋12．5），（50＋25），（100＋50），（200＋100）mL/L 4个亚剂量。③实验评估：各组加入对应药物后培养72h，加入5g/L MTT溶液20μL，再加入二甲基亚砜振荡溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度值，分析乳腺干细胞的增殖情况。 结果：①乳腺细胞形态观察：乳腺组织原代培养后形成腺上皮细胞和肌上皮细胞。②乳腺干细胞增殖检测：黄芪注射液以50mL/L为界，剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强（P〈0．01），达200mL/L时产生抑制作用（P〈0．05）。丹参注射液剂量在12．5～100mL/L范围内变动时，均能够促进乳腺成体干细胞的增殖（P〉0．05）。黄芪与丹参复合注射液以（100＋50）mL/L为界，复合剂量越小对乳腺成体干细胞的促增殖作用越强（P〈0．01），且复合用药效果好于单独用药，当剂量达到（200＋100）mL/     

持续 Wnt 信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖简

背景：如何提高胚胎干细胞诱导效率、促进胚胎干细胞源造血干细胞体外增殖成为目前急需解决的课题。目的：以外源性Wnt3a作为诱导剂,激活培养中的小鼠胚胎干细胞Wnt/β-catenin信号通路,观察该通路的激活是否促进胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化。方法：用外源性wnt3a（100μg/L）持续作用ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d,通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量,QRT-PCR检测Wnt下游靶标基因的表达量来确定经典Wnt/β-catenin信号通路是否被激活,然后采用单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化,流式细胞仪检测造血发育相关表面标志CD34＋/Sca-1＋,同时以QRT-PCR法检测造血相关基因的表达情况。结果与结论：ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经wnt3a（100μg/L）连续培养21 d后发现β-catenin蛋白在细胞内积累;Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加,可见经典 Wnt/β-catenin 信号通路有被激活;单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化的过程中检测到CD34＋/Sca-1＋细胞含量在14 d时占总细胞量高达20.2%,而对照组的仅占11.9%。造血相关基因骨形态发生蛋白4、FLK2及CD34的表达量均增加,而Smad5的表达则明显受到抑制。说明Wnt3a持续作用可激活Wnt/β-catenin信号通路,并促进ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的定向分化。     

P53特异性抑制剂PFT-α诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：最新研究表明,P53可通过阻断P53-P21蛋白通路,显著提高干细胞分化率。而5-氮杂胞苷主要通过激活P53-P21蛋白通路,抑制细胞增殖,导致细胞凋亡。目的：观察P53特异性抑制剂PFT-α对大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法：分离SD大鼠骨髓间充质干细胞进行培养、传代,取第4代细胞分为4组,正常对照组、PFT-α组、5-氮杂胞苷组及PFT-α＋5-氮杂胞苷组。结果与结论：原代培养的骨髓间充质干细胞传代诱导后细胞体积变大,呈长梭形,排列趋一致。当PFT-α浓度≤20μmol/L时,能减少骨髓间充质干细胞凋亡。心肌样细胞鉴定结果显示,诱导后4周时,可见正常对照组少量表达肌钙蛋白Ⅰ和CX-43,其余3组均强表达。心肌细胞分化率结果显示,诱导4周时,PFT-α组和5-氮杂胞苷＋PFT-α组显著高于5-氮杂胞苷组。Western Blotting检测结果示,诱导1周时,5-氮杂胞苷组P53、P21表达最强,PFT-α组几乎不表达;诱导4周时,5-氮杂胞苷组、PFT-α组、PFT-α＋5-氮杂胞苷组P53、P21表达明显高于正常对照组。PFT-α组、PFT-α＋5-氮杂胞苷组内诱导4周时P53、P21表达量均高于1周时表达。提示通过P53抑制剂PFT-α阻断P53-P21蛋白通路,能显著减少骨髓间充质干细胞凋亡,促进其增殖,且能诱导其向心肌样细胞分化。     

骨髓间充质干细胞对CD117^＋心脏干细胞分化过程中转化生长因子βⅢ型受体表达的影响

背景：骨髓间充质干细胞能够促进心肌细胞、血管生成。减轻心肌重构、改善心功能。但其旁分泌作用能否能够通过影响转化生长因子βⅢ型受体促进CD117^＋心脏干细胞的分化尚不清楚。目的：观察骨髓间充质干细胞对CD117^＋心脏干细胞分化过程中转化生长因子3型受体表达的影响。设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2008-02/2009-02在新华医院完成。材料：新生大鼠,体质量5-8g,用于心脏干细胞分离培养：4周龄SD大鼠,体质量200-250g,用于骨髓间充质干细胞培养。方法：分离大鼠心肌组织进行植块培养,体外磁珠分离培养大鼠心脏干细胞,免疫荧光鉴定其表型为CD117^＋。将获得的CD117^＋心脏干细胞吹打制成单细胞悬液,无血清同步化24h,PBS冲洗3次,加入DMEM／F12培养基,接种至破明胶包被的6孔板。实验分为对照组和共培养组,对照组用心肌球培养液诱导分化的心脏干细胞。共培养组用Transwell小室避免细胞融合建立心脏干细胞与骨髓间充质干细胞共培养体系。主要观察指标：①倒置显微镜下观察心脏干细胞生长情况。（2）Westernblot检测CD117^＋心脏干细胞向心肌细胞系分化过程中培养第1,3,5,7天心肌钙蛋白T、缝隙连接蛋白43、转化生长因子βⅢ型受体和smad2及其磷酸化程度的改变。结果：①植块培养和磁珠分离法结合分离出CD117心脏干细胞,传代后心脏干细胞分散生长,细胞略小于普通心肌细胞。②诱导分化后第5,7天,共培养组心肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的表达高于对照组（P〈0．05）;诱导分化后第1—7天,转化生长因子βⅢ型受体的表达均高于对照组（P〈0．05）：同时,磷酸化smad2／smad2的值也高于对照组（P〈0．05）。结论：骨髓间充质干细胞旁分泌作用能够促进CD117^＋心脏干细胞内心肌钙蛋白T,缝隙连接蛋白43和转化生长因子βⅢ型受体的表达,并提高了smad2蛋白的磷酸化程度。     

Plenti6.3/V5-TERT慢病毒载体的构建并成功建立永生化大鼠骨髓间充质干细胞系的研究

目的 为实现慢病毒感染后可用抗生素筛选TERT基因稳定整合的骨髓间充质干细胞,首先对pCI-neo-TERT质粒进行了改造和构建.方法 将pCI-neo-TERT酶切后得到TERT片段,并进行PCR扩增,将得到的TERT片段连入Plenti6.3/V5,酶切鉴定载体构建正确后,将改造和构建载体分别与辅助质粒psPAX2、pMD2.G共转染HEK-293T包装细胞,收获病毒上清并感染靶细胞,使用相应抗生素筛选细胞,验证抗性基因的插入.结果 成功构建了重组慢病毒载体Plenti6.3/V5-TERT,通过调整病毒上清的用量可以使靶细胞达到很高的感染效率;用相应抗生素筛选细胞证明了抗性基因的表达.结论 我们成功构建了慢病毒载体Plenti6.3/V5-DEST-TERT,从而使病毒感染后用抗生素筛选稳定整合TERT的骨髓间充质干细胞成为可能.     

黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景：黄芪甲苷和丹参酮Ⅱa是传统中医药治疗心肌缺血的有效成分,是否可参与骨髓间充质于细胞向心肌样细胞分化的过程呢？目的：观察黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化作用的影响。方法：应用M丌法分别测定黄芪甲苷和丹参酮Ⅱa的最大无毒浓度,确定两者联合诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的剂量。将分离纯化的骨髓间充质干细胞分5组进行诱导：黄芪甲苷组、丹参酮Ⅱa组、丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组、5-氮胞苷组、空白对照组,ELISA方法观察体外诱导后骨髓间充质干细胞缝隙连接蛋白43和肌钙蛋白表达变化。结果与结论：诱导后丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组、丹参酮Ⅱa、黄芪甲苷、5-氮胞苷组肌钙蛋白、缝隙连接蛋白43表达水平均高于正常对照组（P〈0．01）,丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组高于丹参酮Ⅱa、黄芪甲苷组（P〈0。01）。丹参酮Ⅱa＋黄芪甲苷组与5-氮胞苷组缝隙连接蛋白43表达水平差异无显著性意义（P〉0．05）。结果提示黄芪甲苷联合丹参酮Ⅱa可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞方向转化,而其联合作用高于单一成分的作用。