牛视网膜微血管内皮细胞的培养及鉴定

目的 探讨牛视网膜微血管内皮细胞(BREC)的体外选择性培养和鉴定方法.方法 采用含0.075%胶原酶和0.03%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液(PBS)培养基选择性培养BREC.细胞鉴定采用经Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色细胞鉴定内皮细胞.结果 通过选择性培养获得的BREC纯度达98%以上,并能连续稳定传代.BREC早期聚集在微血管碎片周围,呈片状鹅卵石样单层生长,存在接触性抑制.经Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色可见胞质内棕色的免疫沉积物反应呈阳性.结论 本研究所采用的细胞培养方法可获得稳定生长与传代的较高纯度的视网膜微血管内皮细胞,简单、经济易操作.可为糖尿病视网膜病变等微血管病变研究提供可靠的(体外)试验方法.     

人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养

目的:建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、鉴定的高效方法.方法:胰酶消化法从脐静脉获得HUVEC,观察其形态并传代培养,检测其摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AcLDL)的情况,传3代流式榆测内皮细胞特异性表达.结果:消化分离的细胞呈小圆形且聚集成团;2h细胞开始贴壁,呈条索状;7d细胞增多呈漩涡样生长;此后细胞继续增多接近融合,呈铺路石样改变.流式检测细胞高表达血管内皮细胞特异性标志CD144、vWF、CD31,部分表达CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达.镜下发现贴壁细胞原代、第5代摄取Dil-AcLDL,胞浆呈现红色荧光,提示为有活性的内皮细胞.结论:利用胰酶消化法能从人脐静脉获得大量内皮细胞,体外培养后能成功增殖传代.     

肾上腺毛细血管内皮细胞的克隆纯化及鉴定

为建立一种在体外能够繁殖、传代、生物特性稳定的毛细血管内皮细胞(MEC)的克隆培养方法，利用新生小牛肾上腺对MEC进行体外分离，克隆培养；采用过氧化物酶标记的链霉亲和素(SP)法，对已克隆纯化的MEC进行Ⅷ因子相关抗原的免疫组化鉴定。结果表明，体外分离培养的牛肾上腺MEC呈长梭形或多角形，胞核清晰，呈卵圆形，细胞大小均匀，形态基本一致；细胞在体外连续传24代后细胞生长缓慢，形态改变；Ⅷ因子相关抗原的免疫组化染色后呈阳性反应。结论：本研究的成果可为肿瘤及其相关治疗的研究提供支持。     

脑微血管内皮细胞培养技术的研究进展

脑微血管内皮细胞作为构成血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的主要结构基础,由于其特殊的细胞膜转运系统和细胞间的紧密连接,从而在中枢神经系统中的血管内外物质交换中发挥着重要的作用。因其与脑缺血、脑水肿等脑血管疾病的病理过程有着密切的关系,因此体外培养脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)为研究脑血管疾病提供了一种新的方法。该文通过对国内外相关文献进行检索,综合了国内外近年来的研究,依次从大鼠脑微血管内皮细胞的分离、纯化、培养等几个方面,探讨了脑微血管内皮细胞的体外培养技术,为脑微血管内皮细胞的体外研究提供基础。     

MSCs分离培养及定向分化为血管内皮细胞的研究

目的建立分离和培养大鼠骨髓源间充质干细胞（MSCs）的方法及定向分化为血管内皮细胞诱导条件的优化。方法淋巴细胞分离液（比重1．077g／m1）密度梯度离心法分离单个核细胞（MNC），在含10％胎牛血清L—DMEM培养基中培养，并传代扩增MSCs；选取状态较稳定的第4代细胞，分别用含10％胎牛血清和2％胎牛血清的诱导液（终浓度为10ng／mlVEGF、2ng／mlbFGF的DMEM培养液）继续培养，于第7、14天用流式细胞术分析CD34的表达情况，免疫组化法观察FVⅢ的表达情况。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs，细胞呈均一的成纤维细胞样，流式细胞术分析MSCs结果显示，CD34阳性率为1．01％、CD29阳性率为97．32％；诱导14d后免疫组织化学法检测FVⅢ的表达，10％和2％胎牛血清诱导体系细胞的阳性率分别为12．21％和91．43％。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs；就诱导效果而言，2％胎牛血清诱导体系明显好于10％胎牛血清诱导体系，说明低浓度的胎牛血清更有利于MSCs向血管内皮细胞分化。     

804细胞外间质对体外培养牛角膜内皮细胞增殖的影响

目的 研究细胞外间质对牛角膜内皮细胞增殖的影响。方法 以８０４Ｇ细胞外间质作为牛角膜内皮细胞培养的基础，用免疫荧光分析结合素α６的表达，并测定酸性磷酸酶活性分析牛角膜内皮细胞增殖。结果 生长于８０４Ｇ细胞外间质上的牛角膜内皮细胞结合素α６表达增加，酸性磷酸酶活性明显高于对照组。结论 ８０４Ｇ细胞外间质可促进体外培养的牛角膜内皮细胞增殖。     

牛主动脉内皮细胞乙酰胆碱激活蛋白介导的胸内钙离子变化

目的：研究主动脉内皮细胞乙酰胆碱激活蛋白（EPA）介导胞内钙离子变化的特征,并探讨培养牛主动脉内皮细胞EPA功能的变化。方法：以Fluo-3,Frua-2为荧光探针,采用共聚焦和荧光光度法测定内皮细胞[Ca^2 ]。结果：Ach能够引起体外培养6代以内内皮细胞[Ca^2 ]i的增加;Ach能够引起体外培养6代以内内皮细胞[Ca^2 ]i信号表现为瞬时性单次或连续2次的钙振荡,具有异时性和快速耐受的特点。未观察到烟碱和其它M受体激动剂引起的[Ca^2 ]i变化。Ach对胞内[Ca^2 ]i浓度的作用以原代细胞增加最为明显,但随培养时间的延长,此效应逐渐减弱,至13代后无效应。结论：血管内皮细胞乙酰胆碱激活蛋白激活能介导胞内钙离子的增高,经培养后EPA功能丧失。     

色素上皮衍生因子对高糖中小鼠视网膜毛细血管周细胞凋亡的影响

目的探讨外源性色素上皮衍生因子(PEDF)对体外高糖培养的小鼠视网膜毛细血管周细胞凋亡的影响。方法在体外培养的小鼠视网膜毛细血管周细胞无血清达氏修正依氏培养基(DMEM)中加入不同浓度葡萄糖(5.5、40、50 mmol/L),并加入浓度为1 g/L的PEDF 1μl,于4 d后检测不同糖浓度中小鼠视网膜毛细血管周细胞凋亡情况。结果未加PEDF组高糖浓度组与对照组相比,凋亡率差异有统计学意义(P<0.01),且糖浓度与周细胞凋亡率呈正相关(P<0.01)。加PEDF的糖浓度5.5 mmol/L组,周细胞凋亡率为(7.5±1.5)%,与未加PEDF的对照组(9.6±0.6)%差异无统计学意义(P=0.139)。未加PEDF高糖浓度组(40、50 mmol/L),呈现出典型的细胞凋亡特征,周细胞凋亡率为(34.8±4.6)%和(41.2±2.2)%。加PEDF高糖浓度组,周细胞凋亡率分别为(17.5±1.7)%和(19.5±3.7)%。2组相比,凋亡率差异有统计学意义(P<0.01)。结论外源性色素上皮衍生因子可有效抑制周细胞的凋亡,细胞凋亡是糖尿病视网膜病变中毛细血管周细胞早期丧失的一种方式。本研究为临床治疗糖尿病视网膜病变提供一定的理论依据。     

视网膜中央静脉阻塞与循环内皮细胞计数的相关性

视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlusion,CRVO)是一常见的高致盲视网膜血管性疾病,可严重影响患者生活质量。其临床治疗学、发病机制及其他各相关因素方面已日益成为研究的焦点。     

体外培养人眼结膜上皮细胞

目的探索体外分离培养人眼结膜上皮细胞的方法。方法用组织块培养法培养人眼结膜上皮组织，分别种植于培养皿及处理过的羊膜上，培养2周，观察结膜上皮细胞的生长特性。结果接种在培养皿的结膜上皮约6 d组织块之间可融合成膜状，细胞为单层上皮细胞。接种在羊膜上的结膜组织生长较慢，约2周组织块之间可互相连接，融合成膜状，细胞为复层上皮细胞。免疫组化鉴定，结膜上皮细胞CK13染色阳性。结论组织块培养法是人眼结膜上皮细胞培养的较好方法，种植在羊膜上可获得复层上皮细胞。     

分子印记技术在毛细管电色谱手性分离中的应用

分子印记技术是制备具有预定选择性分离介质的有效途径，其应用于毛细管电色谱(CEC)手性分离具高效及独特功用。综述分子印记技术的基本原理及其在CEC中的应用模式和实例。     

毛细管电泳法拆分肾上腺素手性对映体

目的：采用毛细管区带电泳法（Capillary Zone Electrophoresis,CZE）,利用β-环糊精（β-cyclodextrin,β-CD）和羟丙基-β-环糊精（Hydroxypropyl-β-cyclodextrin,HP-β-CD）作为手性添加剂,拆分肾上腺素（Epinephrine）手性对映体,并检测市售盐酸肾上腺素注射液的手性状况。方法：通过对缓冲液体系、酸碱性以及β-CD和HP-β-CD的比较研究,得到优化的分离条件,即50mmol/L的Tris-H3PO4（用磷酸调pH为2.42）,含40mmol/L的HP-β-CD,二极管阵列检测器检测,监视波长214nm,分离电压30kV,分离温度25℃,分离时间15min,压力进样5s。结果：肾上腺素（（±）-Epinephrine）手性对映体在HP-β-CD体系中获得了完全的拆分,而β-CD对其没有拆分效果。检测发现市售的盐酸肾上腺素注射液为单一手性化合物。结论：毛细管区带电泳结合HP-β-CD手性添加剂可以有效的拆分肾上腺素手性对映体,并可作为检测产品纯度的有效方法。     

人毛乳头细胞培养基的改进

目的:改进人毛乳头细胞(DPC)培养基,以便在体外快速、高效地获得人DPC.方法:用含100 ml/L胎牛血清(FCS)的DMEM和改进的DPC培养基(DPCM)培养人DPC.观察比较人DPC在两种培养基中的形态学和生物学特点.结果:人DPC在DPCM上的生长状况明显优于含100 mL/L FCS的DMEM,而且细胞传代次数可达18-20代.结论:DPCM较含100 mL/L FCS的DMEM,对DPC具有更显著地刺激生长的作用,是人DPC较好的培养基.     

高效毛细管电泳法拆分氧氟沙星对映体及其分析

目的：采用羧甲基-β-环糊精（CM-β-CD）为手性选择剂,建立测定氧氟沙星中对映体含量的毛细管电泳方法.方法：采用未涂层石英毛细管（50cm×50 μmn,41 cm）,在30 mmol·L-1的NaH2PO4缓冲溶液中加入（CM-β-CD）手性选择剂,调节不同的pH,分离电压为30 kV,得到优化的分离条件,在优化的分离条件下,对氧氟沙星对映体含量测定方法进行方法学验证,并采用该方法对3批样品进行检测.结果：在pH 4.0,30 mmol·L-1的NaH2PO4缓冲溶液,1.0％ CM-β-CD,分离电压为30 kV条件下,左氧氟沙星和右氧氟沙星线性范围为0.025 ～0.200 mg·ml1（r=0.999 3和0.999 2）,左氧氟沙星和右氧氟沙星的回收率分别为97.6％和97.8％,RSD分别为2.0和2.7％（n=9）.结论：羧甲基-β-环糊精对氧氟沙星有很高的对映体选择性,达到很好的分离效果.在不需要左、右氧氟沙星单纯对照品情况下,用于左氧氟沙星和右氧氟沙星的鉴别和含量测定.该方法重复性好,简便、快捷.     

肿瘤坏死因子对正常和Graves病甲状腺细胞生长的调节

研究肿瘤坏死因子（TNF－α）在正常和Graves病（GD）甲状腺生长调节中的作用。方法：采用GD和甲状腺腺瘤旁正常组织,以细胞单层培养及非同位素标记的细胞增殖分析法,检测不同浓度TNF－α对甲状腺细胞生长功能的影响。结果：TNF－α对基础状态下正常甲状腺细胞的生长无明显调节作用,但剂量依赖性地抑制TSH对此类细胞增殖的刺激效应。在10－2～102ng／ml的浓度区间,TNF－α不影响GD甲状腺细胞基础及TSH诱导的生长功能。结论：TNF－α在甲状腺稳态和甲状腺肿大的发病机理中发挥重要作用。     

兔眼玻璃体腔注射万古霉素的视网膜毒性研究

目的探讨玻璃体腔注射万古霉素后视网膜组织结构的变化过程。方法将48只新西兰白化兔随机分为4组,每组12只(24眼)。1、2、3组玻璃体腔内分别注入0．1 mL万古霉素溶液,浓度分别为1、2、5 mg/0．1 mL;对照组注射生理盐水0．1 mL。手术后观察眼底改变,第1、4、7、14天取眼球,在光学显微镜及透射电镜下观察视网膜组织结构变化。结果对照组及1 mg组眼底检查、光镜和电镜检查未见异常;2 mg组眼底检查未见异常,第7天时光镜和电镜下可见视网膜结构改变;5 mg组1-14 d各项检查均可见明显视网膜破坏。结论玻璃体腔注射2 mg以上(含2 mg)万古霉素可引起视网膜组织结构改变,1 mg是较为安全的眼内注射剂量。     

大鼠腹主动脉平滑肌细胞培养及鉴定

目的 培养、鉴定大鼠腹主动脉平滑肌细胞.方法 采用组织贴块法分离培养大鼠腹主动脉平滑肌细胞,胰蛋白酶消化传代,相差显微镜及即用型SABC免疫组化染色试剂盒进行细胞鉴定.结果 平滑肌细胞呈梭形或长梭形生长,透射电镜可见细胞的胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝和与之相连的致密体.高倍镜下可见胞质内大量棕色、与细胞长轴平行的纤...     

大鼠骨髓基质干细胞体外分离、纯化、培养的实验研究

目的：探讨Wistar大鼠骨髓基质干细胞（ BMSCs）体外分离、纯化、培养的方法。方法对5周龄Wistar大鼠予1%戊巴比妥钠（0.006 ml/g）行腹腔麻醉,成功后于大鼠双侧后肢股骨、胫骨提取BMSCs,用贴壁培养法分离、纯化、培养BMSCs,观察细胞形态变化及绘制细胞生长曲线了解其生长、传代、扩增特性,并应用流式细胞仪检测细胞表面标志物行细胞鉴定。结果应用贴壁培养法分离、纯化、培养的大鼠BMSCs增殖迅速、生长曲线良好,经细胞表面标志物检测证实为BMSCs,且细胞具有很好的均一性（96.36%）。结论贴壁培养法能够很好地分离、纯化、培养大鼠BMSCs,并且获得的细胞具有很强的增殖能力,取第3~6代细胞用于实验研究最为合适。     

人前列腺癌细胞原代培养及纯化培养的体外药敏试验

目的：建立人前列腺癌细胞体外药敏实验．指导临床前列腺癌化疗。方法：收集前列腺癌组织标本,进行原代培养及纯化培养．获得前列腺癌细胞。接种96孔板,给予1xppC多西他赛（DOC）、羟基喜树碱（HCPT）、顺铂（DDP）、依托泊苷（VP-16）、阿霉素（ADM）和丝裂霉素（MMC）处理,采用CCK-8法观察上述化疗药物对前列腺癌细胞的抑制率。结果：前列腺癌细胞对于上述化疗药物的敏感性依次是：DOC〉HCPT〉VP-16〉DDP〉ADM〉MMC。在本实验条件下前列腺癌细胞原代培养成功率为78．1％（50／64）,纯化培养成功率为65．6％（42／64）。原代培养平均耗时（16±4．2）天（n=50）,纯化培养平均耗时（53±12．6）天（n=42）。纯化培养的前列腺癌细胞对化疗药物的敏感性高于原代培养的细胞。结论：原代培养前列腺癌细胞药敏实验操作简便,成功率高,耗时短,与纯化培养药敏结果相关性好,可以用于指导前列腺癌的临床治疗。