动态张、压应力刺激下人牙周膜成纤维细胞细胞骨架变化

目的:观察不同动态张、压应力刺激下人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的变化.方法:用Forcel四点弯曲加载装置对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别施加不同动态的张、压应力(强度为1 000、2 000、4 000 μstrain,加力时间为0、1、2、4、8、12 h),经荧光倒置显微镜观察施加不同动态张、压应力后细胞形态变化,细胞骨架荧光染色强度测定分析细胞骨架F-actin表达量的变化.结果:加力后细胞骨架形态和微丝蛋白发生规律性变化;细胞F-actin荧光染色强度正常→下降→正常;细胞骨架对张、压应力作用的反应敏感程度无明显差异.结论:在一定的张、压应力范围内人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的形态结构具有一定的稳定性.     

周期性张应力作用下成骨样细胞MG-63中c-fos基因和丝状肌动蛋白相互关系的研究

目的探讨成骨样细胞MG-63中c-fos基因和细胞骨架丝状肌动蛋白（F-actin）的相互关系。方法对MG-63细胞施加周期性张应力,频率为0.5 Hz,细胞应变为2 000 μstrain,按3、6、12 h不同时间段进行加载,采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测c-fos mRNA的变化,筛选最佳加载时间点,并作为实验组和0 h组进行对比,检测在细胞松弛素D作用下c-fos mRNA和F-actin的表达变化。结果周期性张应力可以诱导c-fos mRNA的表达增加,至3 h达到峰值;在周期性张应力作用下,MG-63细胞中F-actin的结构、排列发生改变,但荧光强度无明显变化;经细胞松弛素D处理后,张应力作用下的MG-63细胞的应力纤维明显减少,F-actin荧光强度降低,c-fos mRNA表达受抑制。结论周期性张应力作用下,F-actin的量并没有明显变化,只是出现了结构上的重组,且重组的是既有的F-actin。F-actin重组是应力诱导c-fos基因高表达的一个重要环节。     

成骨细胞在机械力刺激下细胞骨架及细胞形态改变的体外研究

目的:探讨大鼠颅骨成骨细胞(OB)对机械力刺激的反应及细胞骨架F-actin的变化。方法:体外分离培养大鼠颅骨OB细胞;应用四点弯曲加力系统,对第3代细胞施加2000με的机械牵张力,加力时间分别为0h、2h、6h、12h,应用特异性荧光染料分别标记微丝蛋白F-actin和细胞核;在激光共聚焦显微镜下观察并进行形态计量学测量。应用TUNEL法进行原位凋亡检测。结果:在机械张力刺激下,OB荧光强度减弱,F-actin纤维束变得稀疏而排列紊乱;胞核轮廓模糊,并可观察到凋亡小体。定量分析表明,OB的荧光总强度、绿色荧光强度(F-actin)和红色荧光强度(胞核)均显著下降(9<0.05或P<0.01)。TUNEL检测也表明,随着加力时间延长,凋亡细胞数明显增加,但明显少于F-actin发生改变的细胞数。结论:机械牵张刺激可引起OB细胞骨架F-actin解聚和重排,并诱发部分细胞发生凋亡。     

不同流动剪切力对原代大鼠成骨细胞细胞骨架的调节作用

目的:从细胞水平探索细胞骨架在将机械应力刺激信号转导进入细胞中并产生应答反应的作用机制。方法:在建立力学刺激细胞培养系统的基础上，对体外分离培养的原代大鼠颅骨成骨细胞分别施加1．2或1．9N／m^2的流动剪切力，激光共聚焦显微镜下观察流动剪切力作用后成骨细胞细胞骨架的改变。结果:1．2N／m^2的流动剪切力作用1h后，受力细胞及其细胞突起沿流动方向一致被拉长。细胞中央微丝呈束状排列，荧光标记强度明显增强。去除剪切力继续培养24h后，细胞恢复无方向的排列，细胞脑浆微丝重新分布于细胞的周围。1．9N／m^2的流动剪切力作用1h后，受力细胞发生明显的皱缩，细胞脱落明显，脑浆微丝出现解聚消失现象。继续培养24h后，细胞形态及微丝无明显恢复。结论:细胞骨架是成骨细胞受到流动剪切力后的一个机械刺激感受体，成骨细胞受力后形态学的变化是细胞骨架应力纤维变化的结果。     

牵引成骨体外模型的建立及成骨细胞骨架的观察

目的建立模拟临床牵引成骨的体外模型，了解不同牵引强度牵引后成骨细胞骨架的改变。方法应用钛合金板材和硅橡胶薄膜研制牵引成骨体外模型，并在激光共聚焦显微镜下观察不同强度牵引成骨细胞24h后，肌动蛋白细胞骨架的原位表达，以及肌动蛋白和微管蛋白α细胞骨架蛋白蛋白质印迹凝胶电泳表达。结果建立的牵引成骨体外模型与临床应用的牵引成骨模式类似；生理性机械牵引力作用于成骨细胞24h后，肌动蛋白细胞骨架蛋白组装，沿受力方向排列；超生理性机械牵引成骨细胞24h后，肌动蛋白细胞骨架出现解聚和崩解，细胞骨架蛋白水平降低。结论牵引成骨体外模型适宜进行牵引成骨体外研究；生理性机械牵引刺激引起肌动蛋白细胞骨架的组装和重新排列，而超生理性机械牵引刺激导致肌动蛋白细胞骨架的解聚和崩解。     

碱性成纤维细胞生长因子对成骨细胞骨架蛋白作用的研究

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对成骨细胞骨架蛋白的作用。方法用含不同浓度bFGF F12培养基对成骨细胞进行24 h预孵后,将成骨细胞接种于喷砂处理的钛片上,第3天终止培养,利用激光共聚焦显微镜以及免疫荧光的方法对细胞骨架进行形态学观察以及荧光定量检测。结果成骨细胞中的微丝骨架呈纤维状,以与细胞长轴平行的方向排列。9 ng/mL和27 ng/mL bFGF预孵成骨细胞,能增加成骨细胞中细胞微丝骨架蛋白F-actin的含量。结论一定浓度的bFGF能促进成骨细胞骨架蛋白的表达。     

大鼠骨髓间充质干细胞和颅骨成骨细胞在张应力下细胞骨架的改变

目的　探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)和颅骨成骨细胞(OB)在机械张应力刺激下的反应和细胞骨架蛋白F-actin的变化。方法　体外分离培养大鼠骨髓MSCs和颅骨OB,应用四点弯曲加力系统对细胞施加2 000με 的机械张应力,加力时间分别为0 h、2 h、6 h、12 h。采用激光共聚焦显微镜观察特异性荧光染料标记的微丝蛋白 F-actin和细胞核,并用图像分析软件对细胞形态学参数进行测量。结果　MSCs和OB荧光强度减弱,F-actin纤维束稀疏,排列紊乱;胞核轮廓模糊,部分细胞可观察到凋亡小体;MSCs体积明显变小,OB体积变化不明显。定量分析表明, MSCs的细胞总面积、总荧光密度、绿色荧光(F-actin)密度均显著降低(P<0·05或P<0·01);OB的总荧光密度、绿色荧光密度和胞核红色荧光密度也显著下降(P<0·05或P<0·01)。结论　机械张应力刺激可引起MSCs和 OB细胞骨架F-actin解聚和重排,部分细胞发生凋亡;MSCs对机械力刺激的反应比OB更敏感。     

氧化应激对人成骨样细胞MG63活性的影响

目的 建立人成骨样细胞氧化应激模型,研究氧化应激对人成骨样细胞形态和增殖活力的影响.方法 用不同浓度黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(xanthine/xanthine oxidase,X/XO)的酶促反应产生的超氧阴离子自由基(O2-˙)刺激人成骨样细胞MG63,建立成骨细胞内氧化应激模型,用X/XO加黄嘌呤氧化酶抑制剂羟嘌呤醇研究其对该氧化应激模型的逆转作用.运用氧化敏感性荧光探针2'7'-二氯荧光黄双乙酸盐结合流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成,用倒置相差显微镜和MTT实验观察研究氧化应激对成骨细胞形态及增殖活力的影响.结果 X/XO处理MG63细胞后,细胞形态发生明显破坏;在相同处理时间下,X/XO浓度越高,细胞内ROS荧光强度值越高,吸光光密度(opitical density,OD)值越低,差异具有统计学意义(P<0.05),且X/XO加羟嘌呤醇联合处理组的细胞内ROS平均荧光强度较相同浓度X/XO单独处理组明显降低(P<0.05).在相同X/XO处理浓度下,随着处理时间的延长,细胞内ROS平均荧光强度逐渐增强,OD值明显降低,120 min时细胞内ROS平均荧光强度比对照组增加了345%.24 h时OD值为相同时间对照组的22.9%.结论 X/XO可导致人成骨样细胞氧化应激损伤,破坏人成骨样细胞的形态,抑制人成骨样细胞的增殖活力.X/XO抑制剂羟嘌呤醇可逆转X/XO引起的人成骨样细胞氧化损伤.     

牵张成骨矫治腭裂的激光共聚焦荧光定量分析

目的：利用激光共聚焦显微镜与计算机辅助荧光定量分析，研究牵张成骨术矫治腭裂新骨生成随时间间期不同的动态变化趋势，为临床矫治腭裂应用提供理论与实验依据。方法：以家猫20只为实验对象。其中18只动物建立人工腭裂实验模型。实验组（动物15只）：应用牵张成骨术，以0．4mm×2次／d的速率牵张整复封闭其腭部组织缺损。术后第2、4、6、8及12周前6d以四环素肌注标记（30mg／kg）后各取材3只动物，标本制片后激光共聚焦显微镜观察荧光沉积并进行计算机定量分析，结果与实验对照组（动物3只）及空白对照组（动物2只）对比。结果：实验组不同时间间期标本的荧光强度平均值及其总量，显示出明确的动态变化规律，自2周组起，成骨活动明显活跃，到4周组达到顶峰，至8、12周组逐渐减弱，但仍显著高出无明显荧光沉积的空白和试验对照组。结论：应用牵张成骨术移动骨运送盘封闭组织缺损，牵张间隙逐渐被膜内成骨新骨生成修复，恢复了骨连续性。随时间间期的延长，新骨逐渐改建成熟。成骨活动呈现短期达到高峰后，逐步减弱的动态变化规律。     

持续静压力对成骨细胞系MC3T3-E1金属蛋白酶解离素28表达的影响

目的:研究持续静压力对成骨细胞系MC3T3-E1金属蛋白酶解离素28(ADAM28)表达的影响.方法:通过自制的细胞体外加载装置,将MG3T3-E1成骨样细胞分别施加50、100、150 kPa的持续静压力1 h,再分别培养24 h、48 h后,观察细胞在形态上的相应变化,并用免疫组织化学染色的方法检测受力作用后ADAM28的染色情况.结果:细胞受力后,其ADAM28免疫组化染色强度随压力值的增大而明显降低;加压后细胞培养24h和48h两组染色强度无明显差异.结论:不同大小的静压力可以影响成骨细胞系MC373-E1上ADAM28金属蛋白酶解离素28表达强度,进而影响骨改建.     

成骨样细胞受张力作用后PGE_2含量及IGF-I表达变化

目的 观察机械张力对成骨样细胞合成PGE2和IGF-I基因表达的影响。方法 通过Flexercell细胞拉伸力学装置对人成骨样细胞Saos-2进行6％、12％和24％的拉伸应变加载实验。用放免法和Northern斑点杂交技术检测细胞受力后的PGE2水平和IGF-ImRNA表达变化。结果 三种拉伸率均能显著增加Saos-2细胞PGE2的含量。虽然6％和12％的应力作用能明显增加IGF-I的表达,但24％的力值刺激几乎对IGF-I表达无影响。结论 张应力可以促进人成骨样细胞PGE2的合成,但只有恰当大小的力值才能增加其IGF-I基因的表达。     

咬合力丧失影响大鼠牙周组织白细胞介素-6变化的研究

目的：探讨咬合力正常及丧失状态下,在鼠牙周细胞ＩＬ－６的动态表达,初探ＩＬ－６在牙周组织改建过程中的分子机理。方法：选用Ｗｉｓｔａｒ大鼠建立正常咬合力、咬合力丧失的动物模型,采用ＨＥ染色和免疫组化的方法,应用ＭＡＳ－２０００图像分析仪,对实验组和对照组各时间点牙周膜染色强度进行测量,观察其牙周形态变化以及牙周组织中ＩＬ－６蛋白表达的动态变化。结果：咬合力丧失引起牙周细胞中ＩＬ－６表达较正常咬合力时明显增强,同时观察到牙周膜结构紊乱、牙槽骨吸收。结论：咬合力丧失促使牙周组织产生ＩＬ－６明显增多且呈规律性变化,提示ＩＬ－６在咬合力影响牙周组织改建的过程中起着重要的调节作用。     

染料木黄酮对成骨细胞增殖、分化和凋亡影响的实验研究

目的研究染料木黄酮对成骨细胞增殖、分化和凋亡的影响，以阐明其对骨形成的作用机制。方法酶消化和组织块相结合培养获得原代成骨细胞，并以成骨肉瘤细胞株UMR-106细胞作对照，加入不同浓度的染料木黄酮后，流式细胞仪和噻唑蓝比色法(MTT)检测成骨细胞细胞周期比例的改变以及凋亡情况；生化法检测细胞内碱性磷酸酶含量的改变。结果流式细胞分析和MT观测结果表明：染料木黄酮促进了原代成骨细胞由G0(G1)期向S期、G2期和M期的移行过渡，从而促进了原代成骨细胞的增殖。染料木黄酮对成骨肉瘤细胞株UMR-106细胞周期无影响，但可诱导UMR-106细胞凋亡。碱性磷酸酶检测结果表明：染料木黄酮可促进原代成骨细胞的分化。结论染料木黄酮可在一定程度上促进成骨细胞的增殖和分化，诱导成骨肉瘤细胞凋亡。     

机械牵张对人成骨细胞ALP活性及I型胶原表达的影响

目的　观察机械张力对成骨细胞碱性磷酸酶 (ALP)活性和I型胶原基因表达的影响。方法　通过Flexercell细胞体外拉伸力学装置对人成骨细胞MG 6 3进行牵张加载实验 ,用生化方法和RT PCR反应检测细胞受张力刺激 6、12、2 4和 4 8h后的ALP活性和I型胶原mRNA的表达变化。结果　机械张力能明显增强MG 6 3细胞的ALP活性。I型胶原mRNA的表达在张力作用后 6～ 12h减弱 ,2 4h后表达升高 ,4 8h最高。结论　机械张力不仅能促进成骨细胞ALP的分泌活性 ,而且还能对成骨细胞胶原合成产生影响。     

Geometric organization of the extracellular matrix in the control of integrin-mediated adhesion and cell function in osteoblasts

Cell-extracellular matrix (ECM) interactions play a central role in tissue architecture and turnover. Particularly, integrin-mediated cell adhesion participates in biochemical and physical signals. The aim of this study is to investigate the importance of ECM organization for alveolar bone osteoblasts adhesion and to determine the effects on cell functions such as collagen and fibronectin production. By applying new concepts from the nanotechnology to biological systems, we have developed materials decorated with nano-patterns of peptides of the ECM arranged at a distance of 58 or 73 nm. On these surfaces, human osteoblasts from alveolar bone were cultured for 1-96 hr and examined by video and fluorescence microscopy. Protein quantification by western blotting and gene expression by RT-PCR were also performed. Good cell adhesion and spreading was observed on the 58 nm pattern after 30 min, while weak adhesion and increased motility was evident in osteoblasts on the 73 nm pattern, leading to alteration of cell shape and reduction of cell area after 24 hr. Moreover, cells on the 73 nm did not form focal adhesions and failed to organize the cytoskeleton. After 96 hr in culture, osteoblasts on the 73 nm retained intracellular collagen and produced a disorganized fibronectin network. Osteoblast adhesion and intra-and extra-cellular molecules reorganization are regulated not only by the composition but also by the structure of the extracellular environment. Our novel in vitro system makes it possible to elucidate some of the mechanisms necessary for the maintenance of tissue architecture and mechanical strength, as well as for the design of artificial materials for future clinical applications.     

不同浓度葡萄糖对MC3T3-E1细胞影响的实验研究

目的：观察不同浓度的葡萄糖对MC3T3-E1细胞增殖、分化及细胞骨架的影响,探讨高糖环境对种植体周围骨结合影响的机制。方法：实验分为5.5mmol/L、8mmol/L、12mmol/L 3组糖浓度。甲基噻唑基四唑（MTT）法测定1d,3d,5d的细胞增殖数;碱性磷酸酶（ALP）活性检测1d,3d,5d,7d的细胞分化情况;茜素红染色观察14d,21d细胞分泌钙结节的情况;激光共聚焦显微镜观察培养后12h的细胞骨架形态。结果：随糖浓度增大,细胞数量、ALP活性、钙结节数目均显著降低,差异有统计学意义（P〈0.05）;对于细胞骨架,随糖浓度增大,细胞骨架从不规则多角形逐渐向圆形毛刺状转变,肌动蛋白从清晰的网状排列逐渐变得不清晰,且杂乱排列。结论：高糖能显著抑制成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性、矿化、及细胞骨架的排列伸展。     

骨形态发生蛋白7在高糖环境下对成骨细胞分化的影响

目的:研究对于重组人骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)在持续稳定高糖环境下对成骨细胞生物学性能及成骨活性的影响。方法:细胞取小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1Subclone 14,MC3T3),分为4组:正常生理糖浓度组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)为对照组,生理糖浓度+BMP7组高糖组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)(葡萄糖浓度为25 mmol/L),高糖+BMP7组(葡萄糖浓度为25 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)。甲基噻唑基四唑(MTT)法检测不同条件培养后1 d、3 d、5 d、7 d后的细胞增殖情况,成骨诱导检测细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。罗丹明-鬼笔环肽染色后以激光共聚焦显微镜观察MC3T3细胞骨架于BMP7作用24h后的形态变化,荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测BMP7作用48 h后成骨基因特异性转录因子2(Runx2),骨钙素(osteocalcin,OCN)、碱性磷酸酶(ALP)的mRNA表达。结果:MTT实验显示25 mmol/L葡萄糖可抑制MC3T3增殖(P<0.05),加入BMP7后可提高细胞增值率(P<0.05)。并可上调高糖导致的ALP活性下降。细胞骨架观察结果显示,对照组细胞骨架成束状铺开,交织成网,较为均匀。高糖组细胞微丝解聚成团状,模糊不清。RT-qPCR结果显示BMP7可促进MC3T3细胞的ALP、OCN及Runx2(P<0.05)的表达。结论:持续稳定高糖环境能够抑制成骨细胞的增殖及ALP活性,影响细胞骨架结构,抑制成骨基因表达,添加BMP7可以在不同程度上反转该趋势,但仍较正常水平低。