转基因动物与遗传病模型

转基因动物(transgenic animals)是指通过基因转移技术，将外源基因导入受精卵或早期胚胎，使之在动物体内得以表达并能稳定遗传的一类动物。自从1979年Mintz等将SV40病毒DNA导入小鼠胚胎细胞，获得第一个带有人工导入的外源基因的嵌合体小鼠以来，转基因动物技术已渗透到各个研究领域，在人为改造物种或生物性状方面显示了广阔的应用前景，为许多基础理论的研究提供了大量的宝贵资料。     

乙型肝炎病毒（adr亚型）转基因小鼠的研究

目的：制备含有2.0拷贝乙型肝炎病毒（HBV,adr亚型）基因组的转基因小鼠,为HBV相关医学问题的研究准备实验动物模型。方法：应用受精卵原核显微注射的方法,产生HBV转基因小鼠。用PCR, Southern-blotting杂交、放射免疫、免疫组织化学以及亚显微结构分析等方法,研究外源基因在转基因小鼠体内的整合、表达以及复制。应用常规病理切片及血清生物化学方法分析转基因小鼠的病理学改变。结果：得到了4只整合有HBV基因组的建立者小鼠,并证明HBV基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,在肝、肾组织内可特异性表达、复制,并在肝细胞内发现了Dane颗粒。转基因小鼠的肝、肾组织未见明显的病理学改变。结论：获得了HBV的转基因小鼠,其病毒基因可以表达,并有病毒颗粒形成。该小鼠对于HBV的各个基因产物是免疫耐受的,其基本生物学特性与人类的HBV携带者特征相似。     

基因小鼠在肿瘤研究中的应用

随着分子生物学研究的进展,特别是对癌基因表达、调控研究的深入,人们对人类肿瘤的认识已经从细胞水平深入到分子水平。转基因小鼠可以从不同时间、不同水平、多阶段、整体研究肿瘤的发生发展和治疗。１　转基因小鼠转基因小鼠是利用基因工程技术将外源基因导入受精卵雄原核或早期胚胎中,使之与小鼠染色体稳定融合并能传递给后一代的小鼠［１］。转基因动物研究始于７０年代未。１９７９年Ｍｉｎｔｚ将ＳＶ４０病毒基因导入小鼠早期胚胎,首次获得了携带有外源性基因小鼠。１９８０年,Ｇｏｒｄｏｎ将克隆的基因导入小鼠受精卵雄原核中,…     

电针治疗转基因鼠类风湿性关节炎的HLA-DR4β1基因调控机制

目的以转基因鼠为研究对象,运用现代生物技术,从免疫学,遗传学等角度深入系统地探讨电针对类风湿性关节炎易感基因调控机制.方法采用人类HLA-DR4β1基因转基因小鼠,转基因阴性小鼠和非转基因小鼠胶原性关节炎为疾病模型,以电针为主要治疗方法,将大于5周龄的小鼠随机分成电针治疗组、甲氨喋呤对照组和模型对照组,运用分子生物学、遗传学、免疫学等多种手段和技术,从动物细胞、分子水平,研究电针治疗RA的特点和环节,并阐明其作用机理.结果①电针可以抑制T淋巴细胞的活化;②电针在调控类风湿性关节炎易感基因的表达中有一定的作用.结论电针通过调控类风湿性关节炎易感基因的表达,影响MHCⅡ类分子的抗原递呈功能达到对CIA小鼠的治疗目的.     

血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因小鼠传代及表达检测

探讨外源基因在转基因动物中的遗传规律。方法：将血管内皮细胞组织特异性表达人CD59基因转基因昆明种雄性小鼠，与普通昆明种雌性小鼠交配。Southern-blot杂交确定子一代外源基因整合阳性转基因小鼠。RT-PCR方法用于子一代转基因小鼠人CD59转录水平筛选。以流式细胞术检测人CD59基因在子一代转基因小鼠蛋白质水平表达。结果：产子14只。7只外源基因整合阳性，其中雄性4只，雌性3只。转录水平检测发现3只出现所需的条带。继而对上述3只转录水平阳性的F1代小鼠白细胞行流式细胞术检测，白细胞膜表面人CD59表达均阳性。结论：转基因动物的遗传规律复杂，基因沉默可能是导致子代转基因动物不表达的重要因素。     

转基因小鼠技术在肿瘤研究中的应用与进展

转基因动物 (transgenicanimals)是指用实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定地整合并可以表达和传与后代的一类动物。自 1980年Gordon等[1 ] 将猿猴病毒 (SV4 0 )和人单纯疱疹病毒 (HSV)的tk基因 (thymidinekinase) ,即胸腺嘧啶核苷激酶基因 ,整合后的质粒直接注入到小鼠受精卵原核中 ,首次成功的培养出转基因小鼠 (transgenicmice ,TGM)后 ,先后出现转基因大鼠、兔、鱼、鸡、羊、猪、牛等。1　转基因小鼠技术自转基因小鼠技术创立以来 ,该项技术和方法经过不断改进和发展 ,并被迅速应用于肿瘤研究。具体方法是将某种与肿瘤相…     

转基因小鼠——一种新型实验动物

转基因小鼠是通过人工的方法把外源基因整合到小鼠生殖细胞培育而成的携带外源基因的小,鼠它能把该基因传递给后代。 Gordon等首次将克隆化基因注入小鼠受精卵,再移植于假孕雌鼠输卵管中,育成了转基因小鼠[‘’。尔后,国内外许多学者纷纷从事这方面的研究,并成功地将10多种基因导入小鼠体内,得到各型转基因小鼠。本文简要介绍特基因小鼠培育的方法和意义。     

乙型肝炎病毒纯合子转基因小鼠(adr 1.2)的培育

目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。     

fat-1转基因小鼠的构建与鉴定

目的构建和鉴定携带有外源fat-1基因的转基因小鼠。方法将fat-1基因的cDNA与动物表达载体pEF—neo连接,构建pEF-fat-1重组质粒,酶切、测序鉴定正确后,以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中,并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠,通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果成功构建了pEF-fat-1重组质粒,将其显微注射到小鼠受精卵中,得到G0代小鼠,PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat-1基因的首建鼠。结论fat-1基因可整合到小鼠体内,得到的转基因小鼠为研究fat-1基因的生物学功能提供了动物模型。     

转基因动物研究进展

转基因动物就是指通过人工的方法将外源基因导入动物染色体基因组,使之稳定表达并能遗传给后代的一类动物。目前制备转基因动物的方法主要有显微注射法,反转录病毒感染法,胚胎干细胞法等。转基因动物技术已广泛渗透于分子生物学、免疫学、生物制药、畜牧育种以及器官移植等研究领域中。本文通过对当前转基因动物的研究进展做出分析,以探讨当前转基因动物的发展方向和展望未来转基因动物的前景。     

相对定量法检测nestin-GFP转基因小鼠外源基因整合拷贝数

目的计算出转基因小鼠nestin-GFP的外源基因整合拷贝数,为研究该模型中外源基因遗传及表达的稳定性打下基础。方法用荧光定量PCR的方法对F0代的2只小鼠基因组做检测。先根据已知拷贝数的GFP(green fluorescent protein)和GAPDH来制作标准曲线和方程,然后计算出基因组中二者所含拷贝数的比例来计算外源基因的拷贝数。结果 2只F0的外源基因拷贝数分别是3和4。结论 nestin-GFP转基因小鼠的外源基因整合拷贝数分别是3和4。     

利用转基因植物作为疫苗生产系统的研究进展

植物转化技术是利用分子生物学和基因工程技术，将外源基因插入到受体植物的基因组中并使其在后代植株中得以表达的过程。本文就转基因植物作为疫苗生产系统的方法、优点、研究应用等进行综述。     

MTA1转基因小鼠的构建及鉴定

目的将人的MTA1外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建稳定高表达MTA1的小鼠模型。方法通过RT-PCR方法克隆人的MTA1编码序列,将MTA1插入真核表达载体pcDNA3.1构建pcDNA3.1-MTA1载体,回收片段后利用显微注射技术将目的基因片段注入到受精卵的雄原核中,使用MTA1特异性的引物经PCR鉴定出基因型阳性的转基因小鼠,再利用Western-blot及免疫组化方法检测MTA1在转基因小鼠全身级织表达情况。结果成功构建了MTA1转基因注射片段。在320枚显微注射受精卵中挑选出300枚存活卵移植到10只ICR小鼠假孕受体的输卵管中,10只ICR小鼠均怀孕,移植成功率为100%,共生出子代鼠80只,经PCR检测其中共有9只整合了MTA1基因,整合率为11.25%。经PCR鉴定MTA1整合阳性的F1代小鼠,再经Western-blot和免疫组化分析检测MTA1表达水平在脑、肺、肝、肠等组织中表达明显增高,肾、骨骼肌表达无差异。结论成功构建了脑、肝、肺、结肠高表达MTA1的转基因小鼠,为进一步MTA1研究奠定了良好的研究模型。     

慢病毒载体法制备荧光素酶转基因小鼠

目的基于慢病毒介导的转基因方法制备荧光素酶(Luc)转基因小鼠。方法制备携带Luc基因的慢病毒,将其注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,然后将胚胎移植进假孕母鼠体内以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪及PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定Luc转基因小鼠。结果移植慢病毒隙感染后的成活胚胎63枚。将其移植至3只假孕母鼠,其中2只怀孕,共生仔鼠11只;利用小动物活体成像仪检测Luc表达,在蛋白水平证实11只F0代中,3只(命名为S1、S2、S3)表达Luc;DNA水平检测证实,3只Luc阳性小鼠的基因组中整合有外源转基因Luc。此外,Luc转基因首建鼠基因组中整合的Luc转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。Luc转基因小鼠主要脏器如睾丸、肾脏、胃、肠、肺、脑、胸腺、肝脏和心脏等均可见Luc信号,但不同脏器间Luc强度有差异。结论成功制备Luc报告基因转基因小鼠。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

钙蛋白酶抑制蛋白转基因小鼠的构建和鉴定

目的 将人的钙蛋白酶抑制蛋白（calpastatin,CAST）外源基因整合到C57BL/6J小鼠中,构建高表达CAST的转基因小鼠模型。方法 利用Gateway技术构建pRP.EX3d-EF1A-CAST-IRES-eGFP载体,回收片段后通过显微注射法将目的基因片段注入到C57BL/6J小鼠受精卵中,将其胚胎移植至同期发情的假孕受体母鼠输卵管内获得子代小鼠。采用PCR方法鉴定出阳性的转基因小鼠,确定首建鼠,通过与C57BL/6J小鼠回交后互交数代建系。利用RT-PCR和Western blotting方法检测CAST基因和蛋白在各组织中的表达情况。结果 将90枚注射受精卵移植到3只假孕鼠中,3只均怀孕,移植成功率100%,产下23只子鼠,经PCR鉴定得到2只转基因阳性首建鼠,阳性率为9%。子代小鼠进行RT-PCR检查显示,CAST基因在转基因小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑和骨骼肌中均有表达;Western blotting检查显示,CAST蛋白表达在转基因小鼠中显著高于同窝阴性小鼠。结论 通过显微注射法成功构建CAST高表达的转基因小鼠,为进一步研究CAST奠定了良好的模型基础。     

Nestin转基因小鼠模型的建立及nestin基因在器官中的表达

目的构建人nestin基因表达载体,制备nestin过表达转基因小鼠。方法以人神经胶质瘤细胞株U251的cDNA为模板,分
3段扩增出nestin基因cDNA全序列,并将其克隆入含有强启动子ROSA26的pBROAD3载体,酶切鉴定、测序,除去原核序列,
纯化。显微原核注射建立转基因小鼠。PCR验证nestin基因整合,确定建立首建者。将阳性鼠传代。Western blot方法检测F3
代转基因小鼠与野生型小鼠主要器官（心、肺、脑、肾）的nestin 表达。结果测序结果证明成功构建了受ROSA26启动子调控的
nestin转基因载体。出生34只小鼠,PCR检测证实存在首建者2只。Western blot方法证实,与野生型小鼠相比,F3代转基因小
鼠脑、肺组织存在较高水平nestin 表达。结论首次成功建立nestin过表达转基因小鼠,外源基因可遗传到子代并在脑和肺组织
中稳定表达,为深入研究nestin在肿瘤转移、细胞“干性”的维持和细胞的分化等功能提供了良好的实验动物模型。
     

基因打靶技术在转基因动物中的进展

80年代初发展起来的基因定位整合技术(gene targeting)以及同期建立的小鼠胚胎多潜能千细胞系(Es，emgbryonic stem cell)的体外培养方法，使转基因技术更加前进了一步，为人们在动物体内分析某一特定基因提供了有力的手段。转基因技术是将外源基因导入动物生殖细胞或ES细胞，也就是将动物原来没有的基因或不占主导地位的基因导入该动物的基因组中并使之表达，观察其表达后对动物产生的影响。而基因打靶技术则是应用外源DNA与染色体上一段与其具有高度同源性序列进行同源重组(homologous recombination)的原理使动物体内某种正常基因失活，     

BIGH3R555w突变转基因小鼠模型的建立

目的建立BIGH3R555w突变转基因角膜营养不良小鼠模型。方法构建以磷酸甘油酸激酶（phosphoglyceratekinase,PGK）为启动子的BIGH3（M）-IRES-EGFP重组质粒载体,通过原核显微注射方法将线性化、纯化后的外源质粒注射入C57小鼠受精卵中,胚胎移植入假孕受体母鼠输卵管内,获得子代小鼠。用PCR方法检测子代鼠尾基因组DNA,通过RT—PCR及Western印迹法检测BIGH3基因表达。结果8只假孕小鼠共移植注射后的胚胎84枚,出生35只子代鼠,经PCR检测得到4只转基因阳性小鼠。RT—PCR和Westem印迹法检测结果显示,BIGH3R555w在转基因小鼠角膜表达量明显增多。结论通过显微注射法使外源基因B1GH3555w突变体在小鼠基因组中整合,成功建立了BIGH3突变转基因小鼠模型,该模型可为今后进一步研究角膜营养不良疾病的发病机制提供依据。     

应用精原干细胞转染法建立HBV（adr型）转基因鼠

目前转基因动物的研究已在农业和医学等领域显示广阔的应用前景 ,但其研究进展缓慢 ,转基因技术仍是主要的制约因素之一。探讨新的简便而有效的转基因方法 ,提高转基因效率 ,是转基因动物研究中的重要课题之一。Brinster等 [1]( 1994 )率先进行通过精原干细胞转染建立转基因动物技术的研究。其原理是将外源基因转染到曲细精管内的精原干细胞 ,使其整合到干细胞染色体上 ,干细胞将可能长期保留有外源基因 ,因此该雄性动物所产生的精子 (精子由精原干细胞分化而成熟 )就有可能携带外源基因 ,由该精子受精而获得的子代动物就会携带外源基因。…