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相似文献
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1.
目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164(vascular endothelial growth factor,VEGF164)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组(转染pcDNA3.1空载体)、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。  相似文献   

2.
目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164(vascular endothelial growth factor,VEGF164)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组(转染pcDNA3.1空载体)、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。  相似文献   

3.
目的:克隆大鼠促凋亡基因Smac,构建真核表达载体pcDNA3.1+-rSmac,并在心肌细胞中表达。方法:应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从大鼠肾组织中扩增到大鼠Smac基因的CDs片段,构建含Smac基因的真核表达载体pcDNA3.1+-rSmac并将此重组质粒、空载体pcDNA3.1+、pcDNA3.1+-EGFP通过脂质体介导转染大鼠心肌细胞H9C2,荧光显微镜、流式细胞术间接检测转染效率,RT-PCR法检测外源基因的表达。结果:经测序目的基因序列与GenBank(NM_001008292)公布的结果一致,所构建的重组质粒pcDNA3.1+-rSmac经PCR和酶切鉴定所释放的片段大小与预期结果相符。荧光显微镜和流式细胞术检测,细胞转染有效,转染效率达38.36%。转染重组载体pcDNA3.1+-rSmac 48 h后,H9C2细胞Smac的mRNA水平明显升高。其中,对照组Smac/β-actin为1.19,空载体组Smac/β-actin为1.31,二者之间差异无显著性(P>0.05);转染pcDNA3.1+-rSmac组Smac/β-actin为1.67,与对照组比较差异具有显著性(P<0.01)。结论:克隆大鼠Smac基因成功,成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1+-rSmac,并在转染后的心肌细胞中表达,为研究Smac基因在心肌细胞凋亡过程中的调控作用奠定基础。  相似文献   

4.
目的 研究外源性PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)基因表达对炎性乳腺癌MDA-MB-468细胞株体外生物学行为的影响。方法 应用基因重组技术构建并鉴定pcDNA3.1-PTEN真核表达质粒,重组质粒被BglⅡ酶切线性化后运用脂质体介导基因转染法,将外源性PTEN基因导人乳腺癌细胞系MDA-MB-468中,经G418筛选阳性克隆,空载体pcDNA3.1(-)转染人细胞作为对照,逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)、免疫印迹法(Western blot)分析目的基因及蛋白表达,膜联蛋白V-FITC(FITC-Annexin V)和碘化丙啶(PI)双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 重组真核表达质粒pcDNA3.1-PTEN经限制性内切酶XbaⅠ和BamHⅠ双酶切,电泳后显示约1.4kb的PTEN目的片段和5.4kb的pcDNA3.1(-)载体片段,证明重组质粒连接正确。RT-PCR、Western blot均显示pcDNA3.1-PTEN转染组有PTEN mRNA及其蛋白表达,流式细胞分析显示恢复PTEN蛋白表达后其凋亡率较其它两组细胞凋亡率增高(均P〈0.01)。结论 成功地构建了pcDNA3.1-PTEN真核表达质粒,外源性PTEN基因可通过诱导细胞凋亡而抑制乳腺癌细胞的增殖。  相似文献   

5.
目的以重组人钠/碘转运体(hNIS)基因转染结肠癌SW480细胞并检测hNIS mRNA及蛋白的表达,为放射性碘治疗非甲状腺肿瘤提供新思路。方法将构建好的重组质粒(pcDNA3.1+-hNIS)进行酶切、测序鉴定并扩增、提取。SW480细胞分为重组质粒(pcDNA3.1+-hNIS)转染组、空白质粒(pcDNA3.1+)转染组、空白对照组,转染后以RT-PCR和Western blot检测各组细胞hNIS mRNA和蛋白的表达。结果酶切和测序结果显示插入的hNIS基因大小和方向均正确。RT-PCR和Western blot显示重组质粒转染组SW480细胞可见hNIS mRNA和蛋白的表达,而空白对照组和空白质粒转染组均未检测到hNIS mRNA和蛋白的表达。结论脂质体法可有效地将hNIS基因转染至SW480细胞并成功表达hNIS蛋白。  相似文献   

6.
目的研究人白细胞介素10(hIL-10)cDNA重组质粒的转染和表达,为以后的基因治疗研究奠定基础。方法构建hIL-10 cDNA真核表达重组质粒pcDNA3-hIL-10后进行酶切和测序鉴定。以SA脂质体介导对照质粒pcDNA3及重组质粒pcDNA3-hIL-10转染COS7细胞和SD大鼠,用ELISA方法检测COS7细胞培养液及大鼠胰腺、肺和肝脏组织中hIL-10的含量。结果用pcDNA3-hIL-10质粒转染COS7细胞48 h后,在培养液中检测到hIL-10蛋白浓度为38 000 pg/mL,而对照组仅为55 pg/mL。hIL-10基因转染24 h后大鼠胰腺、肺和肝脏组织hIL-10的产生量达到峰值,以后逐渐下降,至96 h仍显著高于对照组(P〈0.05),1周后降至正常水平。结论本研究构建的pcDNA3-hIL-10重组质粒可以在真核细胞及大鼠体内高效表达。  相似文献   

7.
目的探讨质粒的不同构象下磷酸钙转染后对蛋白表达量时间曲线的影响。方法经过处理的pcDNA3-MADCAM-1-Fc,pcDNA3.1/Hygro(+)-Alpha4,pcDNA3.1/Hygro(+)-Beta7三种质粒磷酸钙转染293T细胞,第一种表达分泌到胞外的蛋白通过收集上清,ProteinA纯化,另外两种表达于细胞外膜,通过流式细胞仪检测荧光强度。结果 pcDNA3-MADCAM-1-Fc磷酸钙转染后处理组(缺口开环)比对照组表达蛋白量多(t=5.009,p=0.0376)。pcDNA3.1/Hygro(+)-Alpha4,pcDNA3.1/Hygro(+)-Beta7两种质粒共转后处理组荧光强度36h后略高于对照组,48h后对照组明显升高。结论质粒的不同构象下磷酸钙转染后蛋白表达量有时间依赖性。  相似文献   

8.
周瑛  徐宁  卢震亚 《浙江医学》2009,31(4):417-419
目的构建含小鼠细胞因子信号抑制蛋白-3(SOCS-3)基因的重组pcDNA3.1质粒,同时瞬时转染后,鉴定其在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达。方法自小鼠肝脏标本中提取RNA进行RT—PCR,经克隆后获得pUC19-SOCS-3质粒,从中切出目的基因片段克隆至质粒pcDNA3.1中,以构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3。后将构建完成的质粒瞬时转染COS-7细胞株,并随机分为未转染质粒组(对照组)、转染空质粒组和转染重组SOCS-3基因质粒组,同时采用免疫印迹法测定SOCS-3的表达。结果经测序鉴定证实,SOCS-3与美国国立生物技术信息中心核苷酸序列数据库提供的原始序列完全一致;同时经瞬时转染COS-7细胞后,转染重组质粒组的SOCS-3蛋白表达水平(光密度比值)显著高于对照组和转空质粒组(P〈0.01)。结论成功构建含小鼠SOCS-3基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在脂肪代谢中的抑制调节作用提供了技术平台。  相似文献   

9.
目的观察RECK基因过表达对人早孕绒毛外滋养细胞系TEV-1的MMP-2活化比例及细胞侵袭力的影响。方法以脂质体Lipofectamine^TM 2000介导的方法将含RECK全长基因的真核重组表达质粒pcDNA3-RECK转染入TEV-1细胞,以获得稳定转染目的基因的TEV-1细胞株。RT-PCR、流式细胞术检测目的基因的表达;明胶酶谱法、Transwell侵袭小室实验分别检测TEV-1细胞MMP-2活化比例及细胞侵袭力变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和细胞生长曲线法观察质粒DNA转染的细胞毒性情况。结果目的基因RECK在TEV-1细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达;明胶酶谱显示重组质粒pcDNA3-RECK转染组活化的MMP-2比例均明显低于正常对照组、空载质粒转染组(均P〈0.05),Transwell侵袭实验显示重组质粒pcDNA3-RECK转染组穿透Matrigel的细胞数目均明显低于正常对照组、空载质粒转染组(均P〈0.01);MTT法测重组质粒pcDNA3-RECK转染组细胞生长曲线与正常对照组、空载质粒转染组无明显差异。结论RECK过表达可显著减少绒毛外滋养细胞的MMP-2活化及其侵袭能力,可能参与了早孕绒毛外滋养细胞侵蚀机制。  相似文献   

10.
目的:构建人膜突蛋白(moesin)的真核表达质粒pcDNA3/HA-moesin,并检测其在内皮细胞中的表达。方法:采用RT-PCR法从人脐静脉内皮细胞株(HUVECs)中克隆得到moesin cDNA全长序列,经双酶切后连接到真核表达载体pcDNA/HA中,挑选出的阳性克隆经双酶切和测序鉴定后,经脂质体转染法转入HUVECs中,采用Realtime PCR及Western blot等方法检测目的基因mRNA及蛋白的表达。结果:pcDNA3/HA-moesin质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实,目的基因moesin的序列完全正确,真核表达质粒构建成功。Realtime PCR检测显示,转染pcDNA3/HA-moesin组的moesin mRNA表达水平明显高于未转染组和转染pcDNA3/HA空载体组,后2组间无明显差异。Western blot结果显示转染pcDNA3/HA-moesin组有HA-moesin蛋白表达,而未转染组和转染pcDNA3/HA空载体组未检测到HA-moesin表达。结论:成功构建pcDNA3/HA-moesin真核表达载体,在体外转染HUVECs后可使moesin mRNA表达增加,并成功表达HA-moesin,为进一步鉴定内皮细胞中晚期糖基化终产物(AGEs)引起的moesin的磷酸化位点奠定了实验基础。  相似文献   

11.
目的:探讨 Ad-SPK1 是否促进胃黏膜上皮细胞增殖和迁移。 方法:分离培养胎兔胃黏膜上皮细胞, 通过重组腺病毒介导鞘氨醇激酶在上皮细胞中的表达,western blot 及 SPK 酶活性检测其表达情况。 结果:体外 实验中,Western blot 和SPK 酶活性检测外源SPK1 在上皮细胞的表达情况。 用抗FLAG 的抗体在Ad-SPK1 感染 的上皮细胞检测到一条特异条带。 SPK 酶活性法检测不同MOI 为100 的Ad-SPK1 感染兔上皮细胞后SPK 的活 性最高。 结论:腺病毒介导的鞘氨醇激酶可促进实验兔胃溃疡黏膜上皮修复和溃疡面血管增生,加快溃疡愈合。 关键词:胃黏膜;鞘氨醇激酶;上皮细胞  相似文献   

12.
目的探讨ACP1蛋白对人骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。方法以骨肉瘤细胞MG-63为研究对象,针对ACP1基因设计小干扰RNA(si RNA),构建其短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体并转染入细胞,在mRNA和蛋白水平检测ACP1表达,通过黏附实验、细胞划痕、transwell检测MG-63体外侵袭能力。结果成功构建si RNA表达载体Pgenesil-1/ACP1-shRNA。shRNA可使ACP1在基因和蛋白表达水平显著降低,骨肉瘤细胞的迁移能力明显下降,黏附能力由(96.4±8.8)%到(43.4±6.0)%,P〈0.01;穿过人工基底膜的细胞数量明显减少,由56.5±4.8减少到36.3±6.1,P〈0.05。结论ACP1在骨肉瘤的侵袭过程中发挥着重要作用,为肿瘤的生物学治疗提供了新思路。  相似文献   

13.
目的研究螺旋藻蛋白激酶(SPK)对老龄大鼠血液流变学的影响。方法24-36月龄老年大鼠30只,按随机数字表法随机分为SPK高浓度组(A组)、SPK低浓度组(B组)和老龄对照组(C组),每组10只,3-4月龄大鼠为成年对照组(D组),10只。A、B组分别给予SPK混悬液1 g/kg、0.5 g/kg灌服C、D组灌服等量生理盐水,均连续7 d。运用全自动血液流变快速测定仪检测血液流变学各项指标。结果SPK可以降低老龄大鼠的高、中、低切变率下的全血黏度(P〈0.05),降低红细胞压积和血沉(P〈0.05)。结论SPK可以显著降低老龄大鼠的血液黏度,改善血液流变学特性。  相似文献   

14.
目的 观察大鼠胃切除术后小肠内滴注芪黄煎剂对黏膜地址素细胞黏附分子-1(mucosal addressin cell adhension molecule-1,MAdCAM-1)与细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)及其mRNA表达的影响。方法 将60只SD大鼠分为3组,每组20只。假手术组大鼠仅行腹部皮肤切开后缝合手术,模型组大鼠胃切除后给予肠内营养液能全素,芪黄煎剂组大鼠胃切除后先给予芪黄煎剂再滴注营养液能全素。连续给药7 d后,采用免疫组织化学法检测MAdCAM-1、ICAM-1蛋白表达水平,采用RT-PCR荧光定量法检测MAdCAM-1、ICAM-1mRNA相对表达水平。结果 与假手术组比较,模型组大鼠PP结中MAdCAM-1、ICAM-1及其mRNA表达水平均明显下降(P<0.05);与假手术组比较,芪黄煎剂组大鼠PP结中MAdCAM-1、ICAM-1及其mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。结论 芪黄煎剂能增加肠黏膜效应部位MAdCAM-1、ICAM-1及其mRNA表达水平,改善胃切除术后肠黏膜免疫屏障功能。  相似文献   

15.
目的观察鞘氨醇激酶-1(SPK-1)基因修饰对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。方法分别用携带SPK-1和绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒载体,感染大鼠骨髓间充质干细胞后用WesternBlot的方法检测SPK1蛋白表达,用[32P]ATP掺入法检测SPK-1酶活性,用MTT法测定细胞增殖,用特殊诱导剂在体外向成骨和成脂细胞诱导后检测碱性磷酸酶的活性及油红O染色,用AnnexinV-PI双标法检测去血清诱导后细胞凋亡比例。结果Ad-SPK感染大鼠骨髓间充质干细胞后可有效表达SPK-1蛋白且有较高的酶活性;基因转染不影响MSC的增殖和向成骨、成脂细胞的分化,但可显著抑制去血清诱导的细胞凋亡。结论腺病毒介导的SPK-1基因转染不影响MSC的增殖、分化等干细胞基本特性,但可显著增强其抗凋亡能力。  相似文献   

16.
目的研究siRNA-ΔNp63干扰质粒在体外对宫颈癌HeLa细胞迁移、侵袭能力的影响。方法在体外利用siRNA-ΔNp63干扰质粒转染HeLa细胞,将实验分为空白对照组、空载体组、阴性质粒组和干扰质粒组;采用Real-time PCR、Western blot检测各实验组细胞中ΔNp63的mRNA、蛋白的表达;通过Transwell侵袭实验、同质黏附实验和异质黏附实验来检测各组细胞的侵袭能力和细胞迁移能力。结果成功将siRNA-ΔNp63干扰质粒转入HeLa细胞;与空白对照组比较,阴性质粒组及空载体组中ΔNp63的mRNA、蛋白的表达水平无明显变化(P〉0.05),siRNA-ΔNp63质粒组中ΔNp63的mRNA、蛋白的表达水平表现为降低(P〈0.05);空载体组和阴性质粒组平均细胞穿膜数、同质黏附性和异质黏附性无明显变化(P〉0.05);而干扰质粒组中平均细胞穿膜数明显降低(P〈0.05),同质黏附性增加(P〈0.05),异质黏附性明显下降(P〈0.05)。结论 siRNA-ΔNp63能明显降低HeLa细胞的迁移和侵袭能力。  相似文献   

17.
目的:探讨鞘氨醇激酶/1-磷酸鞘氨醇信号途径(SPK/S1P)对人肝癌细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的调节作用。方法:体外培养人肝癌细胞HepG2,用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法检测了5~20μmol/L N,N二甲基鞘氨醇(DMS)在12h时对肝癌细胞分泌VEGF蛋白的影响。结果:5~20μmol/L DMS均可使细胞培养上清液中VEGF蛋白含量明显降低,与对照组相比有显著性差异(P<0.01)。结论:DMS可以通过阻断SPK/S1P信号途径,抑制肝癌细胞合成和分泌VEGF,从而说明阻断SPK/S1P信号途径对人肝癌细胞VEGF分泌具有明显的下调作用。  相似文献   

18.
目的建立抑制肠上皮细胞基因组中Muc2 基因表达的CRISPR/Cas9 系统并探索粘蛋白Muc2 在鼠李糖乳杆菌GG株 (LGG)抑制大肠杆菌K1(Escherichia coli, E.coli k1)株E44 黏附和侵袭肠上皮中的作用机制。方法设计2 个长20~25 bp 的 sgRNA分别靶向Muc2,合成sgRNA寡核苷酸序列并构建CRISPR表达载体,转染野生型人结肠癌Ht29细胞,蛋白免疫印迹法 检测抑制效率及通过MTT法检测其细胞活力及生长情况后,竞争性排斥分析验证粘蛋白Muc2在益生菌抑制E44黏附侵袭肠 上皮中的作用。结果目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入酶切后的lenticrisprv2质粒载体中且序列正确;稳定抑制Muc2表达的 细胞株筛选成功;Muc2基因沉默后,与空白对照组相比,其表达水平明显降低,抑制率可达81%(P<0.01);黏附侵袭实验中E44 相对黏附率为72.23%(P<0.01),相对侵袭率为81.49%(P<0.01),益生菌LGG的抑制E44 黏附和侵袭作用明显下调。结论 Muc2基因下调明显降低益生菌抑制E44黏附和侵袭肠上皮细胞的能力,提示益生菌刺激Muc2表达上调可能是其强化加固肠粘 膜屏障和拮抗致病菌功能的关键性机制之一,并可为肠道细菌性感染疾病的预防治疗提供了一个新手段。  相似文献   

19.
目的 探讨鞘鞍醇激酶-1(SPK1)对胰腺癌SWl990细胞增殖和凋亡的影响.方法 培养的胰腺癌SW1990细胞株,实验分为DMS组、PMA组和对照组,各组细胞接种于孔板中,每组设3个复孔,每个实验至少重复3次.DMS组加入N,N-二甲基鞘氨醇(DMS,50μmol/L),PMA组加入佛波醇-12-豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA,100 nmol/L),对照组按常规培养,采用MTT法和克隆形成实验检测细胞生长增殖的变化,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR检测SPK1 mRNA的表达,Western blot检测SPK1蛋白的表达.结果 PMA组细胞的增殖活力[OD值:(1.37±0.03),细胞克隆数目:(292.45±10.68)]较对照组[OD:(1.00±0.01),细胞克隆数目:(215.34±12.23)]显著增加,DMS组细胞的增殖活力[OD值:(0.65±0.02),细胞克隆数目:(130.56±15.6)]较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).PMA组细胞凋亡率[(9.7±0.62)%]较对照组[(16.71±1.53)%]明显下降,DMS组细胞凋亡率[(31.7±1.32)%]较对照组明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01),PMA组SPK1 mRNA表达水平(0.202±0.013)及蛋白表达水平(0.258±0.015)较对照组[SPK1 mRNA:(0.148±0.006),蛋白:(0.182±0.044)]显著增加,而DMS组SPK1 mRNA表达水平(0.112±0.022)及SPK1蛋白表达水平(0.101±0.034)较对照组显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 SPK1与胰腺癌细胞的增殖和凋亡密切相关,SPK1的激活可促进胰腺癌细胞的增殖并抑制细胞的凋亡.  相似文献   

20.
丹参多酚酸盐预防大鼠术后肠粘连的机制   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:研究丹参多酚酸盐预防大鼠术后肠粘连的作用并探讨其机制。方法:雄性SD大鼠50只,随机分为5组:正常对照组、模型组和丹参多酚酸盐低、中、高剂量组。除正常对照组外,其余大鼠均制备肠粘连模型。正常对照组和模型组每天腹腔注射葡萄糖;丹参多酚酸盐低、中、高剂量组每天腹腔注射丹参多酚酸盐,连续注射8d。各组于术后第8天取血,肉眼观察肠粘连的程度分级;取盲肠与腹壁粘连组织做病理观察;酶联免疫吸附法测定细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。结果:丹参多酚酸盐能显著减轻大鼠的肠粘连程度,明显降低肠粘连大鼠IL-1β和TNF-α的表达水平,抑制纤维结缔组织的增生,但对IL-4的表达水平几乎没有影响。结论:丹参多酚酸盐可减轻大鼠肠粘连程度,降低IL-1β和TNF-α的表达水平,抑制纤维结缔组织的增生,这可能是其预防肠粘连的机制。  相似文献   

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