结核分枝杆菌H37Rv两种抗原Ag85b、HspX的制备及其与佐剂的联合应用

目的 用分子生物学方法制备H37Rv的两种抗原Ag85b、HspX,通过与铝佐剂和CpG佐剂联用免疫小鼠进行初步药理学实验以观察其生物学活性.方法 常规方法分别构建重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,内切酶鉴定目的 片段后两种质粒分别转化BL-21大肠杆菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后分别产生两种蛋白;用阴离子交换柱Source30、QHP以及疏水层析柱对两种蛋白进行纯化;蛋白测序进行鉴定.纯化后的两种蛋白分别与铝佐剂和CpG佐剂联用(Ag85b,Ag85b+Al,Ag85b+CpG,Ag85b+Al+CpG;HspX,HspX+Al,HspX+CpG,HspX+Al+CpG),免疫C57/BL小鼠,同时设置生理盐水对照组,取脾细胞进行酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测干扰素-γ(IFN-γ)的分泌;同时进行淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞经体外刺激后的增殖情况.结果 成功构建了两种重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,成功诱导表达了两种蛋白;经过纯化,两种蛋白纯度均达到95%;经鉴定两种蛋白纯化产物的N端15个氨基酸序列与目的序列相同;Ag85b+CpG、Ag85b+Al和Ag85b+CpG+Al组经Ag85b(80 μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05);HspX+CpG+Al组经HspX(80μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05).结论 成功表达并纯化了结核分枝杆菌H37Rv的两种抗原Ag85b和HspX,与铝佐剂和CpG佐剂联用后成功刺激小鼠产生了细胞免疫反应,证实了两种重组蛋白的生物学活性,为下一步药效学评估奠定了基础.     

Ag85A-HA2原核表达载体的构建及其抗甲型流感病毒免疫效果的研究

目的 构建结核杆菌分泌型抗原85A（Ag85A)与流感病毒血凝素（HA）中HA2（Ag85A-HA2）原核表达载体,并表达融合蛋白,研究其抗流感病毒的免疫保护效果。方法 构建Ag85A-HA2原核表达载体pET-32a(+)/Ag85A-HA2;异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达Ag85A-HA2融合蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物,并使用吸附多聚组氨酸标签（His-Tag）的蛋白纯化柱分离纯化蛋白;甲型流感病毒（influenza A virus,IAV）攻击重组蛋白免疫后的BALB/c小鼠（并设PBS对照组）,通过观察小鼠肺病理切片、测定肺指数及肺指数抑制率、死亡保护率等指标分析其免疫保护效果。结果 成功构建了原核表达载体pET-32a(+)/Ag85A-HA2;SDS-PAGE电泳分析显示成功表达相对分子质量为70×103的重组融合蛋白;动物实验表明,融合蛋白Ag85A-HA2对IAV攻击后的小鼠肺指数抑制率达到39.30%,死亡保护率达到80%,效果明显高于PBS对照组（P<0.05）,肺部病理切片也证实融合蛋白Ag85A-HA2对小鼠肺部的保护效果显著。结论 成功构建了Ag85A-HA2原核表达载体并表达出融合蛋白,该融合蛋白在动物体内能发挥良好的抗甲型流感病毒感染的免疫保护效果。     

结核分支杆菌Ag85B融合蛋白表达载体的构建及纯化

目的：构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP／Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法：常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0．3mmol／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D thiogalactoside,IPTG）诱导表达产生融合蛋白（MBP／Ag85B）,Western blot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂（Amylose resin）对MBP／Ag85B融合蛋白纯化。结果：重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ／HindⅢ酶切后,1％琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40％;Western blot显示,MBP／Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amylose resin纯化后,MBP／Ag85B融合蛋白的纯度可达95％以上。结论：成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。     

结核杆菌抗原Ag85A基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:将结核分枝杆菌Ag85A抗原基因克隆并在大肠杆菌中表达.方法:用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中扩增Ag85A抗原基因,然后将其插入到原核表达载体pGEX5T中,构建成pGEX5T-Ag85A重组质粒.经IPTG诱导使该基因在E.coli k802菌中表达,亲和层析法纯化蛋白,Western印迹法验证表达蛋白的抗原性.结果:扩增出了约0.9 kb的单一条带,并成功地构建了pGEX5T-Ag85A重组子;经IPTG诱导后,Ag85A蛋白在k802菌中获得了表达,表达的蛋白条带大小约58 000,与预期结果相符;纯化后获得了较单一的蛋白条带.蛋白纯化前后均可被结核病患者血清特异地识别.结论:成功地克隆了Ag85A抗原基因,并将其在大肠杆菌中进行了表达、纯化,为将其应用于结核病诊断和防治的研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性

目的　研究原核表达的结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85 B的免疫学特性 .方法　用原核表达的 Ag85 B蛋白免疫 BAL B/c小鼠 ,EL ISA法检测免疫小鼠的体液免疫应答效果 .分离免疫小鼠的脾淋巴细胞 ,体外用抗原再刺激 ,MTT方法检测 IFN- γ产生水平和 MTT法检测淋巴细胞增殖 .结果　 Ag85 B免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答 ,免疫小鼠的脾淋巴细胞体外用抗原再刺激 ,淋巴细胞的增殖较显著 . MTT方法检测 Ag85 B免疫小鼠的 IFN-γ量为 96 0pg· L- 1 ,而生理盐水对照组的量低于 80 pg· L- 1 .结论　Ag85 B有可能作为新型结核疫苗的组分     

Ad5／35 HIV疫苗刺激小鼠产生分泌型T细胞的效果观察

目的探讨新型重组腺病毒5／35载体HIY疫苗（Ad5／35一HIV）刺激小鼠产生IFN-γ分泌型T细胞的效果。方法采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）对15只经Ad5／35一HIV肌注免疫后的小鼠体内产生的γ-干扰素分泌型T细胞含量进行测定。结果Ad5／35-HIV免疫后小鼠的脾淋巴细胞的数量显著高于空白对照组（P〈0．05），在体外用HIV V3表位多肽刺激后均可分泌γ-干扰素。结论Ad5／35-HIV使小鼠产生细胞免疫反应。     

Ag85A DNA疫苗对肠上皮内淋巴细胞FasL mRNA表达的影响

目的：分析口服Ag85A DNA疫苗对小鼠肠上皮内淋巴细胞（iIEL）FasLmRNA表达的影响.方法：减毒伤寒杆菌运载的Ag85A DNA疫苗经口免疫小鼠,检测iIEL和脾淋巴细胞FasL mRNA的表达.结果：末次免疫后8 d,Ag85A DNA质粒组小鼠iIEL FasL mRNA平均表达水平高于正常对照组和空质粒对照组;空质粒对照组和正常对照组的iIEL FasL mRNA平均表达水平以及3组脾淋巴细胞FasL mRNA的表达水平均未见显著性差异.结论：口服Ag85A DNA疫苗可以上调小鼠iIEL FasLmRNA的表达,而对脾淋巴细胞未见有意义的影响.     

人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化及其对小鼠肺腺癌LA795细胞生长的抑制

目的：通过基因重组技术获得能高效分泌表达人内皮抑素的为酵母菌株；观察纯化的重组人内皮抑素（rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长的抑制作用，方法：利用氯化锂转化法将人内皮抑素基因整合入毕赤酵母基因组，获得可分泌表达人内皮抑素（endostatin)的菌株，用肝素亲和层析的方法纯化目的蛋白。观察人内皮抑素对碱性纤维生长因子（bFGF)刺激的人血管内皮细胞系ECV－304细胞增殖的作用。将接种LA795肺腺癌细胞的T739小鼠随机分成2组，分别给予rhES和磷酸缓冲盐液（PBS）皮下注射，每日1次，连续14d，观察2组小鼠肿瘤生长情况，结果：经筛选获得表达量较高的转化菌株，其表达的rhES能明显抑制bFGF刺激的人血管内皮细胞系ECV－304细胞的增殖，与对照组比较具有显著差异（P＜0．001），动物实验表明其有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长（P＜0．001），结论：用毕赤酵母作为宿主分泌表达的rhES具有良好的生长学活性，能有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长。     

热休克蛋白65-MUC1融合蛋白对小鼠干扰素γ产生细胞的诱生作用

目的：研究热休克蛋白65-MUC1（HSP65-MUC1）融合蛋白对小鼠免疫细胞的激活作用。 方法：用HSP65-MUC1融合蛋白免疫C57BL/6小鼠3次后,取脾脏和淋巴结,分离淋巴细胞,体外用HSP65-MUC1融合蛋白、MUC1肽或非特异性刺激剂如CpG ODN和ConA进行刺激,采用酶联免疫斑点法（enzyme linked immunospot, ELISPOT）检测免疫细胞分泌干扰素γ的情况。 结果：HSP65-MUC1融合蛋白免疫后小鼠的淋巴细胞在特异性或非特异性抗原刺激下所分泌的干扰素γ比PBS组明显增多。 结论：HSP65-MUC1融合蛋白对小鼠干扰素γ产生细胞有很强的诱生作用。     

结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达，以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法 采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体，双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子，阳性重组子转化大肠杆菌，并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达，对染色的凝胶扫描，以测定目的蛋白表达水平。结果 菌体蛋白经SDSPAGE，含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带，表达量占菌体总蛋白的33％～38％。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论 构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。     

Ag85A蛋白特异性细胞免疫反应对结核性胸膜炎的辅助诊断价值

目的:探讨Ag85A蛋白特异性细胞免疫反应对结核性胸膜炎的辅助诊断价值.方法:原核表达、纯化Ag85A蛋白.收集我院收治的胸腔积液患者149例,分为结核性胸膜炎组100例,非结核性胸膜炎组49例,收集胸水样本.ELISA法检测胸水样本上清成分内抗Ag85A抗体表达水平;将Ag85A蛋白刺激胸水样本细胞成分,检测IFN-γ表达水平的变化.结果:2组胸水中抗Ag85A抗体均未明显升高;经Ag85A蛋白刺激后,结核性胸膜炎组IFN-γ表达明显增加,平均(1151.25±217.81)μg/L,非结核性胸膜炎组IFN-γ表达未明显增加,平均(14.00±1.02)μg/L(P＜0.01).结论:结核性胸膜炎胸水样本中细胞成分经Ag85A抗原刺激后IFN-γ的表达明显增加,该方法对结核性胸膜炎的辅助诊断有一定的价值.     

Ag85A、Ag85B和HspX蛋白特异性细胞免疫反应对结核性胸膜炎的辅助诊断价值

目的:探讨3种结核分枝杆菌保守抗原Ag85A、Ag85B和HspX抗原特异性细胞免疫反应对结核性胸膜炎的辅助诊断价值。方法:收集我院收治的胸腔积液患者30例,根据胸水性质,分为结核性胸膜炎组20例,非结核性胸膜炎组10例。收集胸水样本,分离胸水样本中细胞成分。原核表达、纯化并鉴定结核分枝杆菌Ag85A、Ag85B、HspX蛋白。用Ag85A、Ag85B及HspX蛋白分别刺激2组患者的胸水细胞成分,通过ELISA技术检测IFN-γ表达水平并进行组间比较。结果:Ag85A蛋白刺激后,非结核性胸膜炎组IFN-γ为(15.50±2.41)ng/L,结核性胸膜炎组IFN-γ为(1 775.00±362.86)ng/L;Ag85B蛋白刺激后,非结核性胸膜炎组IFN-γ为(14.89±2.30)ng/L,结核性胸膜炎组IFN-γ为(2 442.50±418.94)ng/L;HspX蛋白刺激后,非结核性胸膜炎组IFN-γ为(14.20±2.30)ng/L,结核性胸膜炎组IFN-γ为(3 570.00±496.41)ng/L;两组比较均P<0.01。结核性胸膜炎组中,不同患者对不同抗原刺激所产生的IFN-γ水平有一定差别。结论:结核性胸膜炎患者胸水中的细胞成分经Ag85A、Ag85B及HspX蛋白刺激后,IFN-γ水平均不同程度明显升高,该方法对结核性胸膜炎有一定的辅助诊断价值。     

结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B蛋白在结核病诊断的价值

目的探讨重组结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B蛋白用于结核病的诊断价值。方法以Ag85A和Ag85B为抗原,PPD为对照,用ELISA法检测血清中特异性抗结核抗体。结果 325例肺结核病组,Ag85A、Ag85B和PPD检测的灵敏度分别为58.2%、62.2%和71.7%。健康献血组、非结核性呼吸疾病组和卡介苗接种阳转组血清同时用Ag85A、Ag85B和PPD检测,Ag85A特异性分别为94.3%、93.0%、73.7%。Ag85B特异性分别为96.4%、96.5%、85.3%。PPD特异性为93.6%、86.0%、67.9%。统计分析显示,Ag85B蛋白和PPD检测非结核性呼吸疾病组,其特异性有显著性差异（P〈0.05）。检测卡介苗接种阳转组阳性率和血清抗体滴度有显著性差异（P〈0.05）。Ag85A和Ag85B同时检测325例肺结核病组血清可显著提高检测的阳性率。结论 Ag85B蛋白抗原有较好的灵敏度和较高特异性,是ELISA的可靠抗原,与Ag85A联用可提高灵敏度,对结核病血清学诊断有较高参考价值。     

结核杆菌多价核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的构建包含结核杆菌3种抗原蛋白Ag85A、ESAT-6和CFP-10真核表达质粒的多价DNA疫苗,并对其在小鼠体内的免疫原性进行初步分析。方法PCR扩增获得结核杆菌ag85 a、esat-6和cfp-10基因片段,分别克隆入真核表达质粒VR1020的BamHⅠ位点构建DNA疫苗,以此多价DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内的特异性抗体应答和细胞免疫反应,并与BCG免疫组、质粒VR1020免疫组和生理盐水对照组相比较。结果多价DNA疫苗免疫小鼠后能产生特异性的细胞和体液免疫应答,DNA疫苗免疫组小鼠脾细胞IFN-γ的表达量显著高于BCG免疫组,而DNA疫苗免疫组小鼠所产生的特异性抗体水平低于BCG免疫组。结论成功构建了结核杆菌多价DNA疫苗,免疫小鼠后检测到特异性细胞和体液免疫应答。     

Ag85B DNA/H37Ra序贯免疫效果的探讨

目的：初步探讨含结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白的DNA（pTB30m）和结核菌H37Ra序贯免疫小鼠产生的特异性免疫应答。方法：重组质粒pTB30m用碱裂解法制备后进行质量鉴定。用pTB30m肌注初次免疫小鼠2周后,H37Ra皮内加强免疫作为DNA-85B/H37Ra组,同时设定DNA-85B/BCG组、H37Ra组、BCG组及未免疫组。免疫4周或8周后,用ELISA法检测小鼠血清中抗PPD IgG抗体的水平和MTT法检测其脾淋巴细胞的刺激指数（SI）。结果：酶切鉴定pTB30m所含外源基因片段大小正确,并且纯度较高。DNA-85B/H37Ra组小鼠血清中抗PPD IgG水平、脾淋巴细胞的SI均显著高于未免疫组（P〈0.05）;其抗PPD IgG水平稍高于DNA-85B/BCG组、H37Ra组及BCG组,但它们之间无显著性差异（P〉0.05）;其脾淋巴细胞的SI显著高于H37Ra、BCG组（P〈0.05）,而与DNA-85B/BCG组比较,仅在4周有显著性差异。在DNA-85B/H37Ra组内,SI在4周显著高于8周（P〈0.05）,而血清中抗PPD IgG水平8周均显著高于4周（P〈0.05）。结论：DNA-85B/H37Ra序贯免疫策略可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫,初步证明其免疫效果略优于BCG。     

结核杆菌抗原85A与GM-CSF诱发抗鼠黑色素瘤效应研究

目的：用结核杆菌抗原85A（Ag85A）和细胞因子GM-CSF,作为异种抗原及免疫增强剂,研究其在鼠体内能否有效地诱导抗黑色素瘤免疫应答。方法：用分子生物学法构建重组质粒pRSC-Ag85A/GM-CSF,通过细胞转染获得稳定表达Ag85A和GM-CSF的B16黑色素瘤细胞。48只C57BL/6小鼠随机均分为B16细胞组、B16-pRSC细胞组、B16-Ag85A细胞组和B16-Ag85A/GM-CSF细胞组,分别将上述不同B16细胞经背部皮下接种小鼠。通过观察其致瘤性的强弱、荷瘤鼠生存时间、鼠血清IFN-γ水平以及CTL、NK细胞杀伤活性,分析Ag85A和GM-CSF在抗肿瘤免疫效应中作用。结果：B16-Ag85A/GM-CSF细胞组小鼠肿瘤生长明显受到抑制,生存时间较对照组平均延长40%,血清IFN-γ分泌较对照组高1倍,CTL、NK细胞杀伤活性与其他各组相比也有较大的提高。结论：接种稳定表达Ag85A和GM-CSF的B16细胞能降低对小鼠的致瘤性,诱导有效的抗肿瘤效应。     

结核分枝杆菌潜伏感染早期两种检测方法的比较分析

目的比较结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)特异性IFN-γ酶联免疫斑点法(Elispot)和结核菌素皮试(TB-PPD皮试)在MTB潜伏感染早期诊断的优异。方法采用自主研制的Elispot试剂盒(简称Elispot)对100例健康志愿者进行检测,并和TB-PPD皮试进行平行比较。结果100例健康志愿者中有50例TB-PPD皮试阳性(占50%),Elispot检测阳性20例(占20%)。两种方法检测结果差异有统计学意义(χ2=20.45,P<0.005)。结论MTB特异性IFN-γElispot试剂盒在健康人群中检测阳性率比传统的TB-PPD皮试要低,Elispot检测体外IFN-γ应答反应在诊断MTB潜伏感染的价值优于TB-PPD皮试,在MTB潜伏感染早期诊断有较好的发展前景。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因在毕赤酵母中的构建及其表达

目的在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6基因。方法以重组质粒pET23a-ESAT-6为模板,亚克隆目的片段ESAT-6至酵母菌分泌表达载体pPICZaA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法分析。结果成功构建了pPICZaA-ESAT-6毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为18kDa的蛋白。蛋白质印迹（Western blot）显示,18kDa蛋白被活动性肺结核病人血清抗体识别。结论在毕赤酵母菌中成功表达了带有信号肽ESAT-6基因,为进一步研究新型单位疫苗打下坚实的基础。     

结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT64编码基因的共表达载体pBud85B-MPT.方法:将结核分枝杆菌Ag85B、MPT64基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pBud85B-MPT;将pBud85B-MPT转染COS-7细胞,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:在COS-7细胞中同时检测到Ag85B、MPT64的表达.结论:pBud85B-MPT共表达质粒构建成功,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础.