分化抗原5C5在人免疫细胞的表达

目的　明确 5C5蛋白为分化抗原 ,检测其在人免疫细胞的表达 ,以及它的信号传导作用。方法　用 5C5蛋白免疫小鼠 ,制备抗 5C5蛋白的单抗。用反义技术制备 5C5蛋白表达抑制的 3D5细胞。用免疫荧光染色和Western印迹确定 5C5单抗的特异性。用胞膜蛋白免疫沉淀和流式细胞术确定其分化抗原的性质。用双色免疫荧光染色流式细胞术检测 5C5分化抗原在多种人免疫细胞的表达。用Fura 3 AM试剂作探针 ,用激光共聚焦显微镜观察胞内Ca2 + 浓度的变化。结果　制备了抗 5C5蛋白的特异性单抗。用 5C5单抗作探针 ,从 3D5细胞膜免疫沉淀到 1条相对分子质量 (Mr)为 19× 10 3的蛋白带 ,并在活 3D5细胞见阳性免疫荧光染色。 5C5分化抗原在人周围血CD19+ 、CD14 + 、CD4 + 、CD8+ 和CD5 6 + 细胞的表达率分别为 (33.4 7± 7.9) %、(86 .13± 6 .7) %、(15 .79± 7.1) %、(18.11±12 .77) %和 (11.76± 7.4 7) % ,在人免疫细胞株的表达率分别为 5 8.0 % (Nalm6 )、72 .7% (3D5 )、5 3.6 %(BJAB)、6 1.0 % (Daudi)、6 .9% (SKW6 )、6 .3% (Jurkat)、5 .8% (Peer)、2 1.3% (K5 6 2 )和 39.1% (U937)。3D5细胞在 5C5单抗刺激下 ,胞内Ca2 + 浓度逐渐增高 ,可达 2倍左右 ,对照小鼠Ig则无此作用。结论5C5蛋白为一个分化抗原 ,在人周     

人分化抗原5C5在原核细胞的表达

为了确证5C5cDNA是全长cDNA并制备抗5C5分化抗原不同表位的功能性单抗,进而研究5C5分化抗原的结构与功能,用Northern-blot检测5C5mRNA在人各种组织的表达,并构建了重组表达质粒pGEX-5X-3-5C5全长和pGEX-5X-3-5C5 N端与pGEX-5X-3-5C5 C端。结果表明：所有检测的组织中均只有一个5C5 mRNA转录本,其大小与5C5 cDNA长度一致,表明所分离到的908bp 5C5cDNA是个全长cDNA。重组表达质粒pGEX-5X-3-5C5 N端与pGEX-5X-3-5C5 C端在大肠杆菌DH5α表达出了可溶性融合蛋白GST-5C5 N端与GST-5C5 C端,分子量各为36kD和35kD。     

编码人分化抗原5C5全长cDNA的克隆及功能初探

目的 编码５Ｃ５分化抗原全长ｃＤＮＡ的克隆及功能探索。方法 构建人活化Ｂ细胞株３Ｄ５细胞的λｇｔ１１ ｃＤＮＡ文库，以核苷酸杂交法从ｃＤＮＡ文库中筛选阳性克隆、作核苷酸序列分析，编码蛋白质氨基酸序列的亲疏水分析，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ测５Ｃ５ ｍＲＮＡ转录本长度，用ＲＴ－ＰＣＲ检测５Ｃ５ ｍＲＮＡ在不同细胞株的表达，观察单抗５Ｃ５－Ｇ１对３Ｄ５细胞增殖的影响。结果 从人活化Ｂ细胞株３Ｄ５的λｇ     

新的识别人活化B细胞分化抗原5C5单克隆抗体（5C5－G＿1）的制备和鉴定

新制备的抗人活化Ｂ细胞分化抗原５Ｃ５单克隆抗体５Ｃ５－Ｇ＿１经Ｗｅｓｔｅｒ印迹分析表明，该分化抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（还原条件下）显示五条带，分子量分别为９２ｋＤ、５２ｋＤ±（两条）、４０ｋＤ和２０ｋＤ。用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ＿１的混合物，从３Ｄ５细胞的λｇｔｌｌｃＤＮＡ文库中筛选到７个阳性ｃＤＮＡ克隆。     

人C5aR（CD88）序列结构及其B细胞表位预测

采用ＫｙｔｅＤｏｏｌｉｔｔｌｅ氨基酸亲水性标准及Ｂａｉｒｏｃｈ的ＧＧＢＳＭ方案对人Ｃ５ａＲ分子的亲水性基序、Ｂ细胞表位及二级结构进行了预测，并用吴氏建立的Ｂ细胞表位预测方法进行评述。     

人C5a过敏毒素拮抗剂的分子设计及其活性检测

目的：从蛋白质结构与功能的关系出发,探讨C5aR与其配体的C5a的结合位。方法：按分子设计理论,采用亲水性方案寻找C5aR胞外区高亲水性区域,Fmoc方案人工合成C5aR第9－30位氨基酸基序（P22肽）,经高效液相色谱纯化,毛细管电泳鉴定。结果：合成多肽（P22）的纯度为95.19％,每次缩合的平均效率为99.78％;能与anti-C5aR McAb（S5／1,Serotic公司）有效地结合,酶联OD490极显著高于同浓度对照多肽C20;还可被配体rh-C5a(10ng/ml)明显抑制而降低其酶联OD值（P＜0.05）,此外10ng/mlP22还可抑制rhC5a所致U937细胞胞浆Ca^2 升高（P＜0.01）。结论：从C5a分子中寻找C5a结合位基序,可拮抗C5a的过敏毒素作用,为治疗C5a及其相关疾病进行新型的药物设计。     

人腺病毒六邻体蛋白保守区抗原性分析

目的 阐明人腺病毒（HAdV）六邻体蛋白保守区的抗原性的特征,为鉴定六邻体的抗原表位奠定基础。方法 用生物信息学软件ANTHEPROT5．0和DNAMAN对HAdV3六邻体氨基酸序列进行抗原性预测分析和二级结构的分析,然后由SWISS-MODEL Protein Modelling Server预测出HAdV3六邻体蛋白三维结构。结果 抗原性预测分析显示,在六邻体的前段和中段,该区域含有大量的保守区,可能具有较强的抗原性,而六邻体后段总体抗原性较弱。根据HAdV2六邻体蛋白三维结构模型预测出HAdV3六邻体蛋白三维结构。结论 六邻体的前段和中段的部分保守区域在腺病毒颗粒上可能具有较好的暴露性并可能含有抗原性较强的型间或组特异性抗原表位。     

单抗5C5-G1识别的分化抗原表达于活化B细胞胞膜

目的鉴于５Ｃ５ｃＤＮＡ（６１３ｂｐ）的２～４５０ｂｐ与ＨＳＭＲＰ１７ｍＲＮＡ（１００８ｂｐ）的５６０～１００８ｂｐ的同源性高达９５％，且后者编码的蛋白质（ＭＲＰＬ１２）也在细胞活化后表达，本研究旨在探究两者是否属同一物。方法多个人Ｂ细胞株用单抗５Ｃ５－Ｇ１作间接免疫荧光染色，激光扫描共聚焦显微镜观察。结果５Ｃ５－Ｇ１单抗识别分子表达于膜下近膜胞浆处、也可能在膜表面，但非单纯在膜上，而ＭＥＰＬ１２只表达于线粒体。另外，前Ｂ细胞Ｎａｌｍ－６与单抗５Ｃ５－Ｇ１反应阴性，活化前期Ｂ细胞Ｄａｕｄｉ和３Ｄ５的反应强阳性，分化晚期Ｂ细胞ＳＫＷ６为弱阳性。结论５Ｃ５ｃＤＮＡ与ＨＳＭＲＰ１７ｍＲＮＡ不属同一基因；单抗５Ｃ５－Ｇ１识别的分化抗原的表达在Ｂ细胞分化过程中有变化     

人C5aR(CD88)序列结构分析及其B细胞表位预测

采用ＫｙｔｅＤｏｏｌｉｔｔｌｅ氨基酸亲水性标准及Ｂａｉｒｏｃｈ的ＧＧＢＳＭ方案对人Ｃ５ａＲ分子的亲水性基序、Ｂ细胞表位及二级结构进行了预测，并用吴氏建立的Ｂ细胞表位预测方法进行评述。结果显示，不同的预测方案所得结果一致，人Ｃ５ａＲ分子中，构成螺旋结构，伸展构象及无规卷曲的氨基酸残基数比例分别为３３．７％，３４．６％，３１．７％。三个高亲水性区域为第１５～１８位的ＤＤＫＤ，第１９５～２００位的ＤＫＲＲＥＲ和第３３０～３３３位的ＲＥＳＫ，其Ａｈ值分别为３．０、３．０、２．３２。其平均抗原性指数ＡＩ值分别为０．０６４、０．０９１、０．０７０。Ｎ－端第９～３０氨基酸序列的ＡＩ＝０．０４２，是Ｂ细胞优势表位区，以此制作短肽单克隆抗体是可行的。     

蛋白质结构预测的方法学评述

过去几年里,在蛋白质结构预测方面,人们努力发展新的方法与算法,本文较为详细地综述了这些算法;在二级结构方面,对Chou-Fasman方法、GOR方法、Lim方法、神经网络算法进行了讨论;在四级结构预测方面,对基于蛋白质结构认识的结构预测、从头预测方法等进行了综述.总之,在蛋白质结构预测方面仍存在不少困难,但这些困难正在逐步解决.     

甲壳类动物4种过敏原的序列分析、抗原表位预测及三维结构建模

目的探明甲壳类动物各种过敏原之间是否存在相似性,以期深入研究甲壳类食品过敏原的构效关系。方法应用生物信息学方法,分析预测了甲壳类动物的4种过敏原—原肌球蛋白(TM)、精氨酸激酶(AK)、肌球蛋白轻链(MLC)和肌质钙结合蛋白(SCP)的二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、表面可及性、线性抗原表位和三维结构等。结果 TM为超螺旋结构,而AK、MLC和SCP均为复合蛋白,含有较多的Turn和Coil结构;TM、AK、MLC和SCP 4种过敏原的亲水性区域均在60%以上,可塑性区域约为50%,抗原性区域均在60%以上。TM、AK、MLC和SCP分别有11、10、4和4个线性抗原表位。TM、AK、MLC和SCP的三维结构建模结果与相应的二级结构预测结果一致,基本能够反映此4种过敏原的空间构象。结论通过生物信息学方法分析,同时获得了甲壳类动物4种过敏原TM、AK、MLC和SCP的分子特征、抗原表位及部分三维结构,可望为进一步采用实验方法研究其构效关系奠定理论基础。     

蛋白质结构预测综述

蛋白质结构预测对于从分子层面理解蛋白质的生物功能具有重要意义。本研究从同源建模、自由建模等经典方法以及深度学习这几个方面来阐述蛋白质结构预测方面的进展。已知结构蛋白质模板数量的增加、序列比对等算法对信息提取能力的提升以及片段拼接技术的应用使得同源建模在预测蛋白结构的能力大大提升。域分割和片段分割技术及并行计算策略的应用使得自由建模方法在预测远程氨基酸接触能力不断提升。深度学习技术与以上经典方法的结合提升了蛋白结构预测的准确性和速度,但是对于没有同源性蛋白结构的预测,仍然存在巨大的挑战。     

Mutation of aspartate 82 of the human C5a receptor abolishes the secretory response to human C5a in transfected rat basophilic leukemia cells

C5a is a potent chemoattractant for monocytes, neutrophils and other leukocytes. The receptor for human C5a is a member of the rhodopsin superfamily of G protein-coupled receptors and contains an aspartate residue (Asp⁸²) within the putative second transmembrane domain conserved in all other G protein-linked receptors. We investigated the role of this residue and also the carboxy-terminal 23 residues of the C5a receptor in ligand binding and signal transduction by expressing wild-type and mutant receptors in the rat basophilic leukemia cell line RBL-2H3. Wild-type and truncated receptors coupled efficiently to effector systems, resulting in the C5a-dependent discharge of granule contents. In contrast RBL cells transfected with receptors in which Asp⁸² had been mutated to asparagine did not respond to human C5a by secretion despite binding human C5a with high affinity. We conclude therefore that Asp⁸² is not involved in the interaction with ligand but is essential for the proper transduction of the ligand binding signal.     

一个新的人B细胞活化抗原—5C5

用活化人B细胞株3D5细胞免疫小鼠和作为筛选的靶细胞,我们建立了产生单克隆抗体5C5的杂交瘤细胞株。此单抗识别的抗原5C5在25μg/ml anti-μ刺激的B细胞,于第10小时开始表达,亦即于G_1期开始表达。5C5细胞百分率随培养时间而增多。在PWM诱导下.外周血单一核细胞中5C5~ 细胞随培养时间而增加,至第3～4天达最高峰,然后减少,至第7天降至本底水平。5C5~ 细胞在不能为BCDF诱导分化至免疫球蛋白分泌细胞(ISC)的B细胞株3D5,Raji和Daudi阳性,但在能为BCDF诱导分化至ISC的CESS和SKW6细胞却不表达。这均表明5C5抗原表达于B细胞活化的早期和中期,但在B细胞终末分化阶段消失。在休止期B细胞、休止期T细胞、PHA激活的T细胞、单核细胞和中性粒细胞,以及在所检测的T细胞株和髓细胞株,5C5抗原均为阴性。~(125)I标记后用单抗5C5免疫沉淀提取的抗原,在还原与非还原条件下电泳,均只有分子量为52000的一条带,表明5C5是一个单链细胞表面蛋白。鉴于5C5抗原的分子量与文献中已报道的B细胞活化抗原分子量不同,以及5C5在细胞株表达的特点,它可能是一个新的人B细胞活化抗原。     

Isolation of human complement factors C3, C5 and H

An improved method for simultaneous purification of complement factors C3, C5 and H from human plasma has been developed. Using an initial batch separation technique with QAE-Sephadex, followed by chromatography on SP-Sephadex and gel filtration in Sephadex G-200, 600 mg of highly pure C3 can be prepared from 1600 ml of plasma. Simultaneously about 70 mg of highly pure factor H and 30 mg of C5 are obtained by chromatography of post SP-Sephadex material on DEAE-Sephacel. A small amount of C3 in the C5 pool is removed by anti-C3-Sepharose. By maleylation or citraconylation of reduced and alkylated C3, the constitutive polypeptide chains are modified in a way that made them separable by ion exchange chromatography.     

用单抗5C5和5C5—G1筛选的613bp cDNA的核苷酸序列分析

用识别人活化Ｂ细胞分化抗原５Ｃ５的单克隆抗体５Ｃ５和５Ｃ５－Ｇ１的混合物从人扁桃体细胞λｇｔ１１ ｃＤＮＡ文库筛选到３个阳性克隆。其ｃＤＮＡ插入到质粒ｐＵＣ１８，经双链双脱氧测序法作核苷酸序列分析，知其中一个ｃＤＮＡ长６１３ｂｐ，另二个长４６７ｂｐ，后者与前者的前４６７ｂｐ完全重叠。６１３ｂｐ ｃＤＮＡ中有一个开放阅读框架，从１０３ｂｐ到４２９ｂｐ，共３２７ｂｐ。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析显示，此６     

蛋白质空间结构预测研究动态

测定蛋白质空间结构有助于认识蛋白质功能以及蛋白质如何执行其功能。因此研究从蛋白质序列或由DNA读框翻译出的氨基酸序列预测蛋白质结构是当前研究热点之一。综述了蛋白质空间结构预测的同源模型化方法、线索化方法和混合方法等及其应用研究进展。