带有HA标签的HBc蛋白真核表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建带有流感病毒血凝素9钛表位标签（HA标签）的乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（HBc）的表达质粒,为进一步研究HBe蛋白基因的功能奠定实验基础。方法设计并合成扩增HBc蛋白全长的PCR引物,以野生型的HBV质粒pDolTHBV-1为模板,PCR扩增全长的HBc蛋白,大小为563bp;PCR产物经过Eco砒和XholI酶切后,与线性化的pcDNA3／HA载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定以及基因测序鉴定其分子质量和插入片段的序列;构建的质粒转染HEK293细胞48h后,RIPA裂解细胞,Western blot检测HBc蛋白表达。结果纯化质粒的相对分子质量为5．9kb,酶切鉴定结果符合目的条带（563bp）大小,插入的寡核苷酸序列与野生型HBV基因序列完全相符,表达的融合蛋白大小为28kDa。结论成功构建了带有HA标签的HBc蛋白的真核表达质粒pcDNA3／HA—HBc蛋白,为进一步研究HBe蛋白的功能奠定了良好的实验基础。     

靶向多药耐药基因mdr1 RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 构建靶向人多药耐药基因mdr1的microRNA(miRNA)干扰表达载体并进行鉴定. 方法 设计并合成4对编码mdr1 pre-miRNA的单链寡核苷酸,退火成双链后将其连接入miRNA干扰载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR,构建成重组质粒,酶切并测序鉴定其正确性. 结果 获得的重组质粒经酶切测序证实其插入片段大小与预期相符,序列完全正确. 结论 成功构建了4个靶向mdr1的miRNA干扰载体.     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因原核和真核表达质粒的构建

目的构建我国流行的周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶（BmCP）基因原核和真核表达质粒，为进一步研究奠定基础。方法从周期型马来丝虫虫体中提取总RNA，反转录成cDNA，设计合成引物，以eDNA为模板，通过PCR从eDNA中扩增出目的基因，扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pMD18-T载体，进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒，进行测序分析和同源性比较。阳性克隆的质粒亚克隆至真核表达质粒peDNA3．1（＋），转化感受态大肠埃希菌（E-coli）DH5α，筛选阳性克隆，用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果RT—PCR扩增出1条约1201bp的特异性条带，重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符．DNA序列分析与GenBank已知的基因序列同源性为99％。构建了真核重组表达质粒peDNA3．1-BmCP。结论成功构建了周期型BmCP原核和真核重组表达质粒，为进一步研究该基因的功能提供了条件。     

甲胎蛋白表达缺失的人肝癌HepG2细胞株的构建

目的：建立甲胎蛋白（AFP）表达缺失的HepG2细胞株。方法：选择AFP的RNA干涉靶序列,体外合成两段互补的寡核苷酸,与线性化的pll3．7连接,扩增纯化得到所需质粒。鉴定后将质粒用慢病毒包装、纯化得到病毒粗提液,与HepG2细胞共培养,转染后用RT—PCR和Westernblot实验检测细胞AFP的表达情况。结果：RT-PCR和Westernblot实验显示,干扰后HepG2细胞AFP基因和蛋白的表达显著减少。干扰效率达84％。所得细胞株传代后仍仅能检测到微量AFP表达。结论：成功构建稳定的AFP表达接近缺失的HepG2模型细胞株。     

靶向Midkine基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建靶向midkine基因的siRNA 的表达载体,为研究midkine在肿瘤中作用提供一个新的方向.方法 根据基因库中midkine cDNA 序列设计和合成针对人midkine 基因的siRNA 寡核苷酸,定向克隆入质粒载体PGCsiU6,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA 测序.结果 酶切鉴定、DNA 测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变.结论 成功构建了靶向midkine 基因表达的siRNA 干扰质粒载体PGCsiU6/midkine,为进一步运用RNA干扰技术进行midkine 基因功能研究奠定了基础.     

恶性疟原虫海南株STARP基因真核表达重组质粒的构建及基因结构分析

目的 构建恶性疟原虫海南（RCC1／HN株）STARP基因真核表达重组质粒pcDNA3-STARP;分析STARP基因结构,并了解FCC1／HN株与其它分离株STARP基因序列的差异。方法 根据STARP基因已知序列设计合成两对引物,用PCR技术从RCC1／HN株基因组DNA中扩增两个部分序列重叠的STARP基因片段;将两基因片段分别双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。酶切,PCR扩增鉴定筛选重组质粒阳性克隆;用双脱氧链末端终止法测序,应用软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果 分别PCR扩增获得1078bp,1092bp的两个STARP基因片段;经双酶切及PCR鉴定表明获得正确重组质粒;恶性疟原虫FCC1／HN株与T9／96株STARP基因核苷酸序列同源性92．2％;推测编码氨基酸序列同源性为90．9％;在STARP蛋白中部重复区推测有多个明显的抗原表位区段。结论 从FCC1／HN株恶性疟原虫基因组DNA中获取STARP基因,并成功构建真核表达重组质粒pcDNA3－STARP;FCC1／HN株与其它分离株STARP基因有高度的同源性。     

刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建北大核心CSCD

目的构建刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)棒状体蛋白11(ROP11)的真核表达重组质粒并在真核细胞中表达目的蛋白。方法设计合成弓形虫ROP11基因引物,运用RT-PCR方法扩增ROP11基因并克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组表达质粒pcDNA3.1-ROP11。将重组质粒转染HeLa细胞,采用间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 RT-PCR扩增弓形虫ROP11基因片段为1 548bp,与预期大小相符。构建的重组质粒pcDNA3.1-ROP11经PCR及EcoRⅠ和NotⅠ双酶切鉴定正确。重组质粒测序后与GenBank报道的ROP11基因比对,核苷酸序列同源性和推导氨基酸序列同源性均为99%。免疫荧光检测显示,在重组质粒转染的HeLa细胞胞浆观察到黄绿色荧光,对照组无荧光。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-ROP11,该重组质粒能够在真核细胞中表达目的蛋白,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

FAK基因靶向miRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建靶向黏着酶（FAK）基因的miRNA真核表达质粒,为其在胃癌相关研究中的应用奠定基础。方法设计合成两条针对FAK基因的特异性miRNA干扰序列,定向克隆到pcDNATM6．2-GW／EmGFP—miR真核表达载体上,经鉴定后转染胃癌BGC-823细胞,实时定量PCR及Western—blot技术鉴定重组体对细胞FAK基因表达的干扰效果。结果针对FAK基因的两组miRNA干扰质粒构建成功,转染BGC-823细胞后,细胞FAKmRNA及FAK蛋白表达均明显降低。结论针对FAK基因的miRNA真核表达质粒成功构建,该质粒可用于miRNA进行靶向FAK的相关研究。     

弓形虫GRA8基因真核表达重组质粒的构建、鉴定及测序

目的 构建弓形虫RH株pcDNA3，1( )-GRA8真核表达重组质粒，为进一步DNA免疫做准备。方法 用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码致密颗粒蛋白(GRA8)的基因片段，纯化后重组入pUC-19克隆载体，再经含IPTG，XGal氨苄培养基蓝白筛选，挑选白色克隆酶切，低溶点琼脂糖纯化，回收目的基因亚克隆入pcDNA3．1( )，经氨苄培养基过夜培养挑选6个克隆提纯酶切，PCR鉴定和测序。结果 从RH株基因组DNA中扩增出特异的GRA8基因片段，克隆成功pcDNA3．1( )-GRA8重组质粒。测序表明GRA8这部分基因与GENEBANK相应基因序列完全一致。结论 本结果为研究抗弓形虫核酸疫苗打下基础。     

AKT靶向miRNA表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖侵袭的影响

目的构建靶向AKT基因的miRNA真核表达载体,观察其转染胃癌BGC-823细胞后对胃癌细胞增殖及侵袭的影响。方法设计并合成两条针对AKT基因的特异性miRNA干扰序列,与载体pcDNATM6．2-GW／EmGFP—miR连接,转化大肠杆菌,纯化并鉴定后转染BGC-823细胞,实时定量PCR及Westernblot技术鉴定重组体对AKT基因表达的干扰效果。使用M1Tr法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞的侵袭能力。结果针对AKT基因的miRNA干扰质粒构建成功,BGC-825细胞转染该质粒后AKTmRNA及AKT蛋白表达明显受抑制,细胞增殖和侵袭能力均显著下降（P均〈0．05）。结论AKT靶向miRNA真核表达载体构建成功;其可有效抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力。