不同加载时间周期性张应力对大鼠颅底软骨细胞的影响

目的: 构建颅底软骨细胞体外培养力学刺激模型,研究周期性张应力对颅底软骨细胞主要细胞外基质（Ⅱ型胶原）和Sox9表达的影响。方法: 采用FX-5000T应力加载系统对体外培养的第2代大鼠颅底软骨细胞分别施加3、6、12、24 h的周期性张应力,加力值均为10%形变率,频率均为1 Hz。加力后即刻收集细胞,提取总RNA,实时荧光定量 PCR技术检测颅底软骨细胞Ⅱ型胶原（type-Ⅱcollagen,Col-Ⅱ）和Sox9 mRNA的表达。采用SPSS 17.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 与对照组（加力0 h）相比,加力3 h组Col-Ⅱ和Sox9表达下降,且后者有显著差异（P<0.05）;加力6 h组Col-Ⅱ和Sox9表达显著下降（Col-Ⅱ,P<0.01;Sox9,P<0.05）;加力12 h组Col-Ⅱ和Sox9表达较6 h组有所上升,与对照组相比差异无统计学意义;加力24 h组中,两者表达与对照组相比显著升高（P<0.05）。结论: 周期性张应力可影响颅底软骨细胞增殖及细胞外基质合成,加力短时间基质合成抑制,增加加力时间则明显促进基质合成,且成软骨分化标志物Sox9 mRNA表达水平差异先于Col-Ⅱ出现。     

不同加载频率拉应力对髁突软骨细胞增殖分化的影响

目的:探讨不同加载频率的拉应力对髁突软骨细胞增殖、分化的影响。方法:体外分离2周龄新西兰兔髁突软骨细胞,对细胞施加2 h/d,为期3 d的不同频率(0 Hz、0.1 Hz、0.5 Hz、1 Hz)的拉应力。采用CCK8检测细胞增殖水平,实时荧光定量RT-PCR检测Sox9、Runx2、VEGF的表达。结果:细胞增殖水平在静止性(0 Hz)组显著高于周期性加力(0.1~1 Hz)组和对照组;Sox9、Runx2、VEGF表达在0.5 Hz组和1 Hz组显著高于静止性(0 Hz)组和对照组。结论:不同加载频率拉应力对髁突软骨细胞增殖分化有差异性影响。     

张应力对小鼠蝶枕软骨联合细胞增殖及低氧诱导因子-1α表达的影响

目的:了解循环张应力对小鼠颅底蝶枕软骨联合细胞(SOSCs)增殖及低氧诱导因子-1α表达的影响.方法:采集1 d龄小鼠的SOSCs进行体外培养,对第三代细胞加载牵张形变率分别为3％、6％、9％,频率为1 Hz,持续时间为1 h的循环张应力;用流式细胞术测算细胞增殖指数,用蛋白免疫印迹技术分析Hif-1α的表达水平.用按...     

骨形态发生蛋白6对张应力下大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:探讨骨形态发生蛋白-6(BMP-6)对张应力作用下大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成骨向分化的影响。方法:应用四点弯曲加力系统对体外分离培养大鼠BMMSCs施加不同大小的周期单一张应力60 min,2 h后检测检测内源性BMP-6的表达量,同时检测碱性磷酸酶、骨钙素表达量和进行成骨细胞转录因子-2mRNA定量分析。然后对体外分离培养转染人BMP-6复制缺陷型病毒的大鼠BMMSCs施加4000μstrain的周期单一张应力60 min,2 h后检测成骨标志表达。结果:随着张应力的增大,BMP-6的表达逐渐增强,同时成骨能力亦增强,但2000 μstrain以后BMP-6的表达与成骨能力均下降。4000 μstrain条件下2 h后转染人BMP-6基因的大鼠BMMSCs各项成骨标志因子的检测明显强于转染空白病毒。结论:适当的张应力可促进BMP-6表达上调和BMMSCs骨向分化,上调BMP-6的表达可以恢复过大张应力所致的成骨能力下降。     

周期性单轴压应力下大鼠髁突软骨细胞早期应答机制的蛋白质组学初探

目的探讨体外周期性单轴压应力对大鼠髁突软骨细胞蛋白质表达的早期影响，为阐明髁突软骨细胞的力学应答反应机制奠定基础。方法对第三代大鼠髁突软骨细胞进行周期性单轴压应力加载，分为2000μstrain加力组和对照组、4000μstrain加力组和对照组，加力时间为60min；采用双向凝胶电泳技术和质谱鉴定分析软骨细胞蛋白质表达的变化。结果与对照组相比，2000μstrain加力组细胞蛋白质表达变化无统计学意义（P〉0．05）；4000μstrain加力组细胞蛋白质表达改变，3个新蛋白点出现，5个蛋白点消失，22个蛋白点表达下调，7个蛋白点表达升高（P〈0．05）。质谱鉴定其中8个差异蛋白点分别为细胞骨架相关蛋白（丙种肌动蛋白和中间丝波形蛋白）、糖代谢相关蛋白（烯醇酶α和应激70糖调控蛋白）、信号传导相关蛋白（Raf激酶抑制蛋白），以及几种蛋白复合物。结论在体外4000μstrain周期性单轴压应力刺激下，大鼠髁突软骨细胞的蛋白表达谱明显改变，这些差异蛋白可能参与早期的力学应答反应。     

张应力对骨髓基质细胞分化和力生长因子表达的影响

目的探讨张应力加载下骨髓基质细胞力生长因子（MGF）表达的影响及量效关系。方法骨髓基质细胞原代培养后加力不同时间经形态学观察,ELISA检测各组BMSC培养上清中ALP的浓度,Western blot检测加力后骨髓基质细胞MGF的表达。结果机械拉伸刺激下BMSC的形态学特性逐渐发生改变。加载0h、1h、3h、6h、12h、24h位移为1mm,频率为0.5Hz的机械张应力,均可增强BMSC的ALP活性,其中24h时ALP OD值最高（P〈0.05）。Western Blot分析BMSC加力后MGF蛋白的表达,结果为细胞加力后MGF在1h开始有变化,MGF表达水平随加力作用时间延长而增高,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 MGF可能通过刺激骨髓基质细胞ALP的分泌而促进其向成骨方向分化。     

周期性张应力对成纤维细胞增殖能力的影响

目的探讨周期性张应力对体外培养的小鼠胚胎成纤维细胞增殖特性的影响。方法将体外培养的L929细胞分为加力组与对照组,加载周期性张应力的细胞为加力组,不加力的为对照组。应用细胞应力加载系统对L929细胞加载8%形变率、0.1 Hz的周期性张应力,分别在加力1 h、2 h、4 h和8 h后应用流式细胞仪分析细胞周期;四甲基偶氮唑盐比色法分析细胞的增殖活性。结果加力组加力1 h(q=5.532,P<0.01)与2 h(q=6.569,P<0.01),S期细胞比率(S-phase fraction,SPF)较对照组出现了下降,并伴有细胞数量的增加(P>0.05);加力组在加力4 h后,SPF较对照组下降(P>0.05),细胞数量增加(P>0.05);加力组在加力8 h后,SPF较对照组开始出现增高(q=4.287,P<0.05),细胞数量显著增加(q=5.202,P<0.01)。结论 8%形变率、0.1 Hz的周期性张应力引起细胞增殖活性的变化,表现为随应力加载时间的延长,细胞的增殖活性出现先被抑制、后被促进的改变。     

周期性单轴压力对大鼠髁突软骨细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的 探讨在髁突软骨细胞受到周期性单轴压力后,结缔组织生长因子(connective tissuegrowth factor, CTGF)表达的影响,为正畸治疗中髁突软骨受力后的改建提供生物学依据。方法 选取1周龄SD大鼠,提取并培养髁突软骨细胞,免疫组化鉴定。利用四点弯曲细胞力学加载仪对第3代细胞进行力值为2000u strain、0.5Hz的体外周期性单轴压力加载,分别在加力0min、30min、60min和120min后继续培养24h,应用蛋白印迹法检测在不同加力时间CTGF蛋白表达的变化。应用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。结果 CTGF的相对蛋白量在加力0min、30min、60min和120min后,分别为0、1.59、2.34和3.16,随着加载时间的增加,表达呈逐渐上升趋势。且组间差异具有统计学意义(P<0.05) 结论 周期性单轴压力可刺激大鼠髁突软骨细胞CTGF的表达。     

张应力刺激下人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白、整合素、细胞骨架的变化

目的:研究不同动态张应力刺激下体外培养的人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白、整合素β1和细胞骨架的变化.方法:刮取牙根中1/3牙周膜组织,采用Ⅰ型胶原酶消化结合组织块贴附法进行人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)原代培养并传代.用四点弯曲加载装置,通过对体外培养的hPDLF分别施加不同动态的张应力,采用实时荧光定量PCR法研究机械力对人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白和整合素β1亚单位mRNA表达的影响.经荧光倒置显微镜观察施加不同动态张应力后细胞形态的变化.采用SPSS 13.0软件包对荧光定量PCR所得数据取常用对数后行ANOVA分析.结果:张应力的大小及加力时间都对hPDLF纤连蛋白mRNA表达产生影响.加力后,hPDLF整合索β1亚单位mRNA表达下调,这种下调变化与所施加应力大小和作用持续时间相关.机械力刺激越强,整合素β1表达越明显.加力后,细胞骨架形态发生变化.加力前呈梭形,排列呈漩涡状,F-actin纤维粗且分布均匀;加力后,形态不规则,沿力的方向排列整齐,F-actin纤维细且分布不均匀;加力12h后,形态恢复到加力前形态,细胞F-actin荧光染色强度也由正常到下降再到正常.结论:动态张应力刺激在本实验提供的微应力范围内可以促进纤连蛋白、整合素βmRNA表达改变,hPDLF细胞骨架的形态结构也发生一定规律的变化.     

牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖及相关因子表达的影响

目的:观察牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖、炎性因子及Hedgehog通路基因的表达影响,探讨牵张力对软骨细胞的调控。方法:体外培养软骨细胞并鉴定。用Flexcell 4000TM加力板对细胞施加0.5 Hz,0%、3%和15%的牵张应变,作用4 h后检测细胞增殖情况,对比PCNA、Caspase-3、COL II、IL-1β、TNF-α及Hedgehog通路基因Ihh、Ptc和Smo的表达变化。结果:与对照组相比,3%组细胞增殖速度增加,PCNA、COLII、Ihh、Ptc和Smo的mRNA表达增加,15%组Caspase-3、IL-1β和TNF-α表达增加,而PCNA、Smo表达降低。与3%组相比,15%组细胞增殖速度降低,PCNA、COL II、Ihh和Smo表达降低,而Caspase-3、IL-1β表达增高。结论:不同强度牵张力对大鼠髁突软骨细胞增殖活性及炎性因子表达作用不同。Hedgehog通路对牵张力敏感,可能参与了力学刺激对软骨细胞的调控。     

Factors regulating endochondral ossification in the spheno-occipital synchondrosis

OBJECTIVES: To identify the temporal pattern of core-binding factor alpha1 (Cbfa1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) expressions in the spheno-occipital synchondrosis in vitro with and without tensile stress. MATERIALS AND METHODS: Sixty male BALB/c mice were randomly divided into an experimental group (with tensile stress) and a control group (without tensile stress) at each of five time points. Animals were sacrificed and the cranial base synchondroses were aseptically removed. In the experimental groups, mechanical stress was applied on the surgical explants with helical springs and incubated as organ culture for 6, 24, 48, 72, and 168 hours. In the control group, the springs were kept at zero stress. Tissue sections were subjected to immunohistochemical staining for quantitative analysis of Cbfa1 and VEGF expression. RESULTS: Quantitative analysis revealed that Cbfa1 and VEGF expressions reached a peak increase at 24 and 48 hours, respectively. Compared with the control groups, both Cbfa1 and VEGF were expressed consistently higher in the experimental groups at all time points. CONCLUSION: Mechanical stress applied to the spheno-occipital synchondrosis elicits Cbfa1 expression and subsequently up-regulates the expression of VEGF. Increased levels of expression of both factors could play a role in the growth of the spheno-occipital synchondrosis.     

Temporal expression of SOX9 and type II collagen in spheno-occipital synchondrosis of mice after mechanical tension stimuli

OBJECTIVE: To associate the expressions of SOX9 and type II collagen during growth in the synchondrosis with and without tensile stress in order to understand the role of these factors in the growth of cartilage in spheno-occipital synchondrosis. MATERIALS AND METHODS: Sixty 1-day-old male BALB/c mice were randomly divided into experimental and control groups. Each group was subdivided again into five different time points which were 6, 24, 48, 72, and 168 hours. Each subgroup consisted of five mice. Each mouse was sacrificed using an overdose of pentobarbitone sodium. The synchondroses were aseptically removed and incubated in a 24-well plate with or without tensile stress in tissue culture. Tissue sections were stained immunohistochemically to quantitatively analyze the expression of SOX9 and type II collagen. RESULTS: There was a statistically significant increase of 57% (P < .001) in the expression of SOX9 between the experimental and control groups at 24 hours, followed by a significant increase of 44.4% (P < .001) in the expression of type II collagen at 72 hours. CONCLUSIONS: SOX9 may play an important role for early differentiation of chondrocytes and increase the expression of type II collagen, a major component of the extracellular matrix, during the growth of cartilage in the spheno-occipital synchondrosis.     

大鼠生长发育过程中颅底软骨联合细胞增殖和凋亡的研究

目的研究大鼠生长发育过程中颅底细胞的增殖和凋亡现象,探讨颅底生长发育的变化规律。方法选用出生后4d、8d、16d、32d、48d、64d及128d的SD大鼠,取颅底软骨联合组织,行增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色标记增殖细胞,末端脱核苷酸转移酶介导的缺口末端标记技术(TUNEL法)标记凋亡细胞,比较观察不同时间段大鼠颅底的细胞增殖和凋亡的表达情况。结果在出生后4d、8d及16d的大鼠可见大量的PCNA阳性细胞存在于软骨联合区,而32d、48d、64d及128d大鼠的软骨联合区仅有少量的PCNA阳性细胞,而在软骨联合区两侧的骨小梁之间的PCNA阳性细胞较多。在出生后4d、8d的大鼠软骨联合的肥大区,交界区发现少数细胞凋亡现象;而在出生后16d、32d、48d及64d的大鼠颅底软骨联合组织的肥大区、交界区和两侧的骨小梁之间发现较多散在的黄色荧光凋亡细胞,并随时间推移凋亡细胞逐渐增多;但在128d的大鼠又几乎未见凋亡细胞。结论在大鼠颅底生长发育过程中,细胞增殖和凋亡存在特定的时空变化规律。     

牵张力作用下人牙髓细胞HIF-1α和VEGF的表达

目的:研究牵张力作用下人牙髓细胞HIF-1α和VEGF基因的表达变化,探讨 HIF-1α和VEGF与正畸牙髓组织维持内环境稳定的关系.方法:通过细胞牵张应力加载系统,对细胞施加频率为1.0 Hz、大小为15％形变率的牵张应力,分别加力6h、12h、24h、48 h和72 h实时定量PCR检测不同时间点HIF-1α和VEGF mRNA的表达变化采用SPSS 12.0软件包对数据进行统计学分析 结果:未加力前,HIF-1 αmRNA表达极其微弱;加力6 h时,表达开始升高(P＜0.05);持续增加至24 h时,表达最显著(P＜0.05);加力48 h时,表达缓慢下降(P＜0.01);至加力72 h时,表达下降至未加力前(P＞ 0.05).未加力前,VEGFmRNA表达微弱,加力6h表达开始升高,但无显著差异(P＞0.05);加力12 h 时,VEGF mRNA表达开始明显增强(P＜0.05),持续增加至72 h加力结束时(P＜0.05).结论:牵张力可诱导人牙髓细胞HIF-1α和VEGF mRNA的表达变化,两者可能在维持正畸受力后牙髓内环境稳定中发挥重要作用.     

Chondrocyte proliferation of the cranial base cartilage upon in vivo mechanical stresses

Whereas the growth of the cranial base cartilage is thought to be regulated solely by genes, epiphyseal growth plates are known to respond to mechanical stresses. This disparity has led to our hypothesis that chondrocyte proliferation is accelerated by mechanical stimuli above natural growth. Two-Newton tensile forces with static and cyclic waveforms were delivered in vivo to the premaxillae of actively growing rabbits for 20 min/day over 12 consecutive days. The average number of BrdU-labeled chondrocytes in the proliferating zone treated with cyclic forces was significantly higher than both static forces of matching peak magnitude and sham controls representing natural chondral growth. Cyclic forces also evoked greater area of the proliferating zone than both static forces and sham controls. Thus, chondrocyte proliferation is enhanced by mechanical stresses in vivo, especially those with oscillatory waveform. Analysis of these data suggests that genetically coded chondral growth is up-regulated by mechanical signals.