含心脏阿霉素反应蛋白基因的重组慢病毒过表达和RNA干扰载体的构建及鉴定

目的：构建心脏阿霉素反应蛋白（CARP）基因重组慢病毒过表达和RNA干扰载体并进一步包装慢病毒,为研究CARP在阿霉素（ADR）心肌病中的作用及机制奠定基础。方法：将PCR扩增的大鼠CARP基因序列和设计合成的短发夹RNA（shRNA）序列分别插入GV-358和GV-248表达载体,行DNA测序鉴定。采用重组CARP过表达和shRNA表达穿梭载体与Helper 1.0和Helper 2.0辅助包装质粒共转染人胚肾细胞HEK293T,进行病毒包装和扩增,采用终点稀释法测定病毒滴度。采用重组慢病毒感染HEK293T细胞,荧光显微镜观察绿色荧光强度。采用重组慢病毒感染H9C2细胞,分为对照组、Scramble RNA组、CARP过表达组和shRNA CARP组,Western blotting法检测各组细胞中CARP蛋白表达水平。结果：基因测序,CARP过表达及shRNA载体序列与原设计序列完全相符。载体转染HEK293T细胞后,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。包装的CARP过表达及shRNA病毒感染H9C2细胞后,与对照组比较,CARP过表达组细胞中CARP蛋白表达水平升高5.3倍（P=0.01）,shRNA CARP组细胞中CARP蛋白表达水平降低53%（P=0.02）。结论：成功构建了CARP过表达和特异性shRNA慢病毒表达载体并获得高感染效率的过表达和RNA干扰慢病毒,后者在H9C2细胞中能够干预CARP表达。     

大鼠蛋白激酶Cγ基因小发卡RNA慢病毒载体的构建及其干扰效率的鉴定

目的：研究指出蛋白激酶Cγ（PKCγ）在脊髓水平上参与了伤害性信号的传递,文中拟构建大鼠PKCγ基因的小发卡RNA（shRNA）慢病毒载体,并在细胞水平鉴定其干扰效率。方法：根据PKCγ-mRNA序列,选择3条19nt的靶序列,设计并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入到pLVTHM载体的H1启动子后获得重组质粒,同时构建一个非特异性对照质粒。将所构建的质粒与pMDLg-pRRE、pR sv-REV、pMD2G共转染293T细胞,包装产生慢病毒后,分别感染C6细胞,经免疫印迹技术（W estern b lot）检测PKCγ基因的蛋白表达水平以评价慢病毒载体的抑制效率。结果：测序证实成功构建了3个大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,分别感染C6细胞后pLV-PKC2和pLV-PKC3可明显降低PKCγ蛋白的表达,其中以pLV-PKC2（靶向位点：＋1913＋1931）的慢病毒抑制效率最高。结论：成功构建了大鼠PKCγ基因shRNA慢病毒载体,且慢病毒载体pLV-PKC2能特异、高效地抑制PKCγ基因的表达。     

慢病毒介导GDNF过表达对CCI大鼠神经病理性疼痛的影响

目的 观察鞘内注射过表达胶质细胞源性神经生长因子（GDNF）慢病毒载体对慢性缩窄性神经损伤（CCI）大鼠神经病理性疼痛的影响.方法 采用结扎大鼠坐骨神经制备CCI模型.CCI造模成功后第7天鞘内注射GDNF过表达慢病毒载体.CCI造模前及造模后第3、5、7、14、21天测定大鼠机械痛阈,并于术后第21天采用Western免疫印迹法测定脊髓GDNF表达.结果 Western免疫印迹显示CCI组GDNF表达较假手术组减少（P＜0.05）;鞘内注射GDNF过表达慢病毒载体后,脊髓GDNF表达上调,且CCI大鼠机械痛敏显著降低（P＜0.05）.结论 上调脊髓GDNF表达可减轻CCI大鼠神经病理性疼痛.     

大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒,为进一步探究RNA干扰技术对CaSR在肾脏对钙重吸收调控中的作用提供基础准备。方法(1)CaSR基因慢病毒高表达细胞系构建:PCR克隆CaSR目的基因,双酶切CaSR基因和pcDNA3.1载体,连接酶连接,阳性克隆筛选后测序,将pcDNA3.1-CaSR高表达载体和空载体(对照组)经慢病毒包装后转染NRK-52E细胞,Western blot测定CaSR蛋白表达;(2)CaSR基因的RNA干扰质粒构建:设计3对靶向干扰CaSR基因的RNA引物序列,双酶切干扰引物和pLV[shRNA]-EGFP载体,然后经T4连接酶连接,获得重组干扰质粒pLV[shRNA]-EGFP-CaSR,转化至感受态E.coli DH5,阳性克隆筛选后测序,测定干扰效率。结果(1)测序结果与CaSR基因序列一致;(2)测序结果与设计shRNA引物序列一致;(3)Western blot检测获得慢病毒高表达稳定细胞系的CaSR蛋白;(4)干扰质粒干扰高表达细胞系有效。结论成功构建大鼠CaSR基因的慢病毒高表达细胞系和RNA干扰质粒。     

以慢病毒为载体的整合素β8 RNAi在新生鼠脑内干扰效率的研究

目的 制备稳定表达pSicoR-β8 shRNA的慢病毒载体系统,并评估其在新生鼠脑内RNA干扰（RNAi）效率。方法 将慢病毒表达载体pSicoR-β8 shRNA、pSicoR-对照序列与慢病毒包装质粒系统pDM2G、g/p RRE和pRSV Rev分别进行扩增及质粒酶切鉴定,然后共转染293T包装细胞株,通过293T细胞的包装和分泌以收集携带目的干扰片段的慢病毒颗粒。利用PEG-it病毒浓缩试剂进行浓缩,50%组织培养感染剂量法（TCID50）测定病毒滴度。将浓缩后的慢病毒颗粒通过侧脑室注射对新生SD乳鼠中枢神经系统野生表达的整合素β8进行干扰,荧光显微镜下观察慢病毒侧脑室注射后脑组织中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,结合RT-PCR和Western blot方法检测β8 mRNA和蛋白在干预后表达水平的变化,以评估RNAi效率及选择最佳干预时间。结果 质粒扩增及酶切结果显示各质粒片段大小分别与质粒图谱大小一致,浓缩后测得的病毒滴度为LV-对照序列:1.0×108PFU/mL,LV-β8 shRNA:5.0×108PFU/mL。慢病毒侧脑室注射后1 d,侧脑室周围即可观察到携带GFP的慢病毒整合到宿主细胞基因组并发出绿色荧光,注射后2 d、3 d和5 d可在脑组织切片中观察到较强的绿色荧光。β8 mRNA表达水平在RNAi后1~3 d出现降低（P＜0.05）,第3天达到最大抑制作用,其β8 mRNA抑制率约为56％。β8蛋白表达变化趋势与β8 mRNA表达变化趋势基本一致,RNAi后第3天达到最大抑制作用,其β8蛋白抑制率约为51％。结论 成功获得滴度达到体内实验要求的含有β8 shRNA的慢病毒颗粒,并具有较好的体内干扰活性,为进一步研究整合素β8在新生鼠脑组织中的生理功能奠定了基础。     

整合素β1基因shRNA慢病毒载体构建及其对乳腺癌他莫昔芬耐药细胞迁移和侵袭能力的影响

目的：构建整合素β1（integrin β1,ITGβ1）基因干扰慢病毒载体,并研究ITGβ1对他莫昔芬耐药乳腺癌MCF-7细胞（Tamoxifen-resistant MCF-7,MCF-7R）的迁移和侵袭能力的影响。方法：针对ITGβ1靶序列设计合成4条shRNA序列及1条阴性对照序列NC,构建ITGβ1RNAi慢病毒载体及对照病毒载体,并分别进行病毒包装,通过内源性筛靶,选取干扰效果最好的组病毒感染MCF-7R细胞,Western blot检测ITGβ1蛋白的表达水平;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果：成功构建4条慢病毒干扰重组质粒,并分别包装成病毒,通过内源性筛靶挑选出干扰效果最佳的慢病毒组,感染MCF-7R细胞后ITGβ1基因的蛋白表达量较NC组明显降低（P=0.000）,且细胞的迁移和侵袭能力明显弱于NC组（P=0.000）。结论：慢病毒介导的shRNA可有效地干扰MCF-7R细胞中ITGβ1的表达,并且抑制MCF-7R细胞的迁移和侵袭能力。     

大鼠STAT3特异性shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的在已经成功构建4个针对STAT3的shRNA质粒表达载体的基础上,筛选出干扰效果最佳者进行慢病毒包装并鉴定。方法将STAT3的干扰质粒shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4及Control1(空载体对照),Control2(无效shRNA对照)分别转染目的细胞(大鼠肾小球系膜细胞),48h后收集细胞提取mRNA,以RT-PCR检测各组分STAT3表达量。对于筛选所得干扰效果最佳的质粒,采用pPACKH1TM慢病毒载体系统进行病毒包装。利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对感染效率及病毒滴度进行检测。结果 RT-PCR检测结果显示,shRNA3样品受干扰的效果最佳。成功构建了慢病毒载体Lenti-shRNA3,共转染293T细胞24h、48h,荧光显微镜下可见强绿色荧光,细胞生长状态良好,表明病毒包装成功。转染HT1080细胞,收集慢病毒液,测定病毒滴度为3.34×108ifu/ml,适合感染目的细胞。结论成功构建了STAT3基因的shRNA慢病毒表达载体,为进一步应用奠定了基础。     

靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建介导 RECQL4 RNA 干扰的 shRNA 慢病毒表达载体。方法将人工合成的 RECQL4 siR－NA 经 PCR 扩增后与线化的 pLKO．1慢病毒表达载体连接,经测序鉴定后,将 pLKO．1－RECQL4－shRNA 与慢病毒包装质粒共转染入 HEK －293T 细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。体外感染人结肠癌细胞 RKO 后,实时定量 PCR 和 Western blot 检测 RECQL4 mRNA 和蛋白的沉默效果。设置未加入任何慢病毒表达载体的 RKO 细胞为未感染组,感染 pLKO．1－scramble －shRNA 慢病毒载体为阴性对照组。结果基因测序结果证实成功构建 pL－KO．1－RECQL4－shRNA 慢病毒表达载体。测定包装后的慢病毒颗粒滴度为6.70×107 IU／mL。感染 RKO 细胞后,RECQL4的 mRNA 和蛋白表达量均低于阴性组和未感染组。结论成功构建靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体,可有效抑制人结肠癌 RKO 细胞 RECQL4 mRNA 和蛋白的表达。     

人periostin干扰载体的构建及其对成纤维细胞目的基因表达的影响

目的：为了研究人成骨细胞特异因子-2(periostin,POSTN）基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响,构建shRNA质粒和慢病毒载体,观察其对293T细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞的POSNT基因表达的抑制作用,检测shRNA慢病毒载体对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响。方法：设计特异性干扰人POSTN基因的小发卡RNA序列,合成含有干扰序列的双链DNA oligo,与经双酶切后的质粒连接,转化感受态大肠杆菌DH5α并对阳性克隆进行PCR扩增测序鉴定。将构建的质粒采用脂质体共转染入293T细胞,36~48 h后采用Western blot的方法检测目的蛋白的表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果。将干扰效果最好的序列包装shRNA质粒和慢病毒载体,利用生成的POSTN shRNA质粒和慢病毒分别感染293T细胞和原代瘢痕疙瘩成纤维细胞,检测两种细胞目的基因、蛋白的表达,进而观察基因干扰后瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖变化。结果：转染干扰质粒原代瘢痕疙瘩成纤维细胞、感染空质粒阴性对照细胞和正常皮肤成纤维细胞的POSTN mRNA表达分别为1.98±0.03、1.12±0.03和1.08±0.03,实验组对比阴性对照组细胞的敲减率为43%（F=688.291,P<0.001）。感染干扰慢病毒原代瘢痕疙瘩成纤维细胞、感染空病毒阴性对照细胞和正常皮肤成纤维细胞的POSTN mRNA表达分别为0.44±0.09、0.81±0.07和0.37±0.05,实验组对比阴性对照组细胞的敲减率为46%（F=90.06,P<0.001）。实验组POSTN蛋白表达水平（0.29±0.04）比阴性对照组细胞（0.53±0.09）的表达降低45%（F=33.43,P<0.001）,正常皮肤成纤维细胞POSTN蛋白的表达水平为0.23±0.02。感染干扰质粒和慢病毒的原代瘢痕疙瘩成纤维细胞与空质粒转染的对照细胞相比,POSTN蛋白和mRNA的表达水平亦明显降低,并趋近正常皮肤成纤维细胞的表达。从感染慢病毒48 h开始,干扰组瘢痕疙瘩成纤维细胞与空质粒转染的对照组细胞相比增殖明显减慢,抑制率达19%。 结论：本方法构建的POSTN基因干扰质粒和慢病毒构建成功,其能显著降低POSTN基因和蛋白在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达,干扰POSTN基因表达抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖。POSTN基因干扰质粒和慢病毒的构建成功为进一步研究POSTN基因的功能奠定了研究基础。     

下调细胞因子信号转导抑制因子3表达对2型糖尿病大鼠糖代谢影响的研究

目的探讨RNA干扰（RNAi）技术下调肝脏和骨骼肌细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3）表达对2型糖尿病（T2DM）大鼠糖代谢的影响。方法构建并筛选SOCS3短发夹状RNA（shRNA）表达质粒,与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒。制备T2DM大鼠模型,采用随机数字表法分为对照组和干扰组各15只,于实验第1天和第15天对照组尾静脉注射非干扰序列慢病毒1.5ml/次,干扰组尾静脉注射SOCS3RNAi慢病毒1.5ml/次。4周后检测大鼠空腹胰岛素（FINS）和空腹血糖（FPG）水平,计算胰岛素抵抗指数（IRI）和胰岛素敏感指数（ISI）;实时荧光定量PCR法和Westernblot法检测大鼠肝脏和骨骼肌组织中SOCS3mRNA和蛋白表达水平。结果成功构建了SOCS3shRNA慢病毒表达质粒,其在C6大鼠神经胶质瘤细胞中可抑制SOCS3表达,其抑制率为70%,获得的慢病毒滴度为1.0×109TU/ml。干扰组肝脏和骨骼肌组织中SOCS3mRNA和蛋白表达水平较对照组均明显下降,差异均有统计学意义（均P＜0.01）。干扰组FINS、FPG和IRI较对照组均明显下降,而ISI较对照组明显上升,差异均有统计学意义（均P＜0.01）。结论利用RNAi技术下调T2DM大鼠SOCS3基因可提高T2DM大鼠胰岛素敏感性,缓解胰岛素抵抗程度。     

小鼠Mmp-9 shRNA重组慢病毒包装、筛选及干扰效果检测

目的:设计、筛选、构建并鉴定Mmp-9小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),并构建其慢病毒表达载体,为血管化疾病的防治提供理论依据及实验室数据。方法:针对基质金属蛋白酶9靶基因设计siRNA序列,并合成小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)结构的DNA,与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,构建成携带Mmp9-shRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-shRNA),PCR及测序鉴定后,Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体,并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP9-shRNA慢病毒,并测定病毒滴度为1×1010pfu/l。结果:PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶9短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体,表明实验成功构建基质金属蛋白酶9RNA干扰慢病毒表达载体。结论:成功的构建并筛选出针对小鼠Mmp9基因沉默的特异性shRNA重组慢病毒,为血管化性疾病的防治研究提供基础。     

转录因子E2F-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建细胞周期相关转录因子E2F-1RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体。方法：选取E2F-1基因的19nt特异性序列,设计针对E2F-1的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pLentiLox3.7（pLL3.7）慢病毒表达载体中,XbaI和NotI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒48h后,收集病毒颗粒,孔稀释法测定病毒滴度。结果：双酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确;293FT细胞包装E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体成功;收集的细胞培养上清液中,病毒的滴度为5×10^7TU/mL。结论：成功构建人E2F-1基因RNAi慢病毒载体,为研究E2F-1对于胃癌生长的影响提供了稳定的转染细胞载体。     

慢病毒载体介导的shRNA对小鼠T细胞CD28基因表达的影响

目的探讨编码针对小鼠CD28的短发卡状RNA（short hairpin RNA,shRNA）的慢病毒载体对小鼠T细胞CD28基因表达的影响。方法设计并合成3对靶向小鼠CD28的特异性干扰序列和1对非特异性干扰序列,亚克隆入慢病毒载体pLB中,构建出重组慢病毒干扰质粒,行PCR鉴定并进一步测序证实。分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,生产慢病毒颗粒,并依据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平检测病毒滴度。慢病毒感染小鼠脾淋巴细胞,实时荧光定量RT-PCR和Western blot技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测CD28的表达。结果PCR鉴定及测序结果证实4种重组慢病毒质粒均构建成功,重组慢病毒滴度均达1×1011U/L。感染T细胞后,CD28基因mRNA和蛋白表达量均有明显下降。结论成功构建了CD28 shRNA慢病毒载体,可有效下调小鼠T细胞CD28基因的表达,其为进一步研究体内沉默CD28基因控制移植物抗宿主病奠定了基础。     

人CDH22基因RNAi慢病毒载体的构建及稳定干扰CDH22基因的表达

目的 构建人CDH22基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默大肠癌细胞的CDH22基因表达,为研究CDH22在大肠癌转移中参与的信号转导机制提供研究基础.方法 利用在线软件设计人CDH22基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序.得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体.在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和CDH22基因重组慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染大肠癌细胞SW480,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰CDH22基因的细胞亚系.结果 成功构建CDH22真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8×105U/ml.荧光定量PCR结果表明,所获得的细胞克隆11中CDH22 mRNA水平的表达显著降低.结论 成功构建出CDH22基因慢病毒RNAi表达载体,并获得CDH22基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系,为研究CDH22在大肠癌转移中的作用机制提供了研究基础.     

Wnt3a信号通路通过JMJD6的表观遗传修饰参与神经病理性疼痛

目的：探讨Wnt3a通过Jumonji C结构域6( Jumonji C domain 6,JMJD6)的表观遗传修饰在神经病理性疼痛 中发挥作用的机制。方法：将SD大鼠分为4组：Sham组,慢性缩窄性损伤(chronic constriction injury,CCI)组,CCI+阴性慢病毒表达载体(LV-NC)组;CCI+慢病毒过表达载体(LV-JMJD6)组。构建SD大鼠坐骨神经CCI模型和JMJD6慢病毒 表达载体。CCI术后第3天通过鞘内导管给药,按照分组分别给予生理盐水和含慢病毒的试剂(病毒滴度1×108 TU/mL) 各20 μL。监测大鼠的机械缩足阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)和热缩足潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL),并运用蛋白质印迹法检测脊髓水平Wnt3a及NR2B蛋白的表达变化,免疫共沉淀检测JMJD6与Wnt3a之间是否存在直接相互作用。结果：与Sham组相比,CCI术后各组大鼠的PWMT明显降低和PWTL明显缩短(P<0.05)。与CCI组和CCI+LV-NC组相比,CCI+LV-JMJD6组的PWMT在术后第10和14天明显升高,PWTL在术后第14 天明显延长(P<0.05)。CCI术后第14天,CCI组及CCI+LV-NC组Wnt3a和NR2B蛋白表达水平较Sham组明显升高,鞘内注 射慢病毒载体后, CCI+LV-JMJD6组的Wnt3a和NR2B蛋白表达水平较CCI+LV-NC组降低(P<0.05)。免疫共沉淀结果显示Wnt3a与JMJD6之间无直接相互作用。结论：Wnt3a参与调节神经病理性疼痛,其作用可能与JMJD6的表观遗传修饰相关,两者可能通过间接相互作用进行调节。     

靶向YWHAE基因shRNA慢病毒表达质粒的构建及功能验证

目的 构建靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,并验证其对AGS胃癌细胞增殖的影响. 方法 设计并合成5对针对人YWHAE基因的shRNA序列,分别克隆入pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达质粒,接着将重组的慢病毒表达质粒和包装质粒PHR、包膜质粒VSVG一起采用磷酸钙法转染293T细胞包装慢病毒,收集制备的慢病毒感染AGS细胞,用抗生素Puromycine进行筛选.Western-blot检测感染细胞YWHAE蛋白的表达.选取干扰效率最高的慢病毒表达质粒,针对性设计siRNA的点突变引物,重叠延伸PCR法扩增获得点突变的YWHAE基因,克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A载体,构建YWHAE点突变的表达质粒,转染YWHAE沉默效果最好的AGS细胞株,Western-blot检测转染细胞YWHAE蛋白的回复表达.采用MTS法检测YWHAE-shRNA慢病毒对AGS细胞增殖的影响. 结果 5对针对人YWHAE基因的shRNA序列构建的慢病毒中,pLL3.7-siYWHAE-5包装成的慢病毒抑制AGS细胞的YWHAE蛋白表达的效果最明显,仅为对照组相对表达量的(0.269±0.083)倍;pLL3.7-siYWHAE-5包装的慢病毒,其干扰效应可经由YWHAE点突变表达质粒回复.与对照组比较,YWHAE-shRNA组AGS细胞增殖能力明显下降. 结论 成功构建了靶向YWHAE基因的shRNA慢病毒表达质粒,获得YWHAE基因表达显著下调的AGS细胞株;探明YWHAE表达的下调可有效抑制AGS细胞的增殖,提示YWHAE在胃癌中的致癌潜能.     

Id2 shRNA慢病毒载体的构建及其转染后对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的构建能高效敲减分化抑制因子2(Id2)基因的短发夹状小干扰RNA(shRNA)慢病毒载体,并观察敲减Id2对胶质瘤细胞株U251增殖和凋亡的影响。方法设计并合成特异性针对Id2基因的shRNA序列,将其构建到慢病毒载体pGCSIL-GFP中。以含有Id2基因的质粒为模板,扩增Id2基因cDNA序列的特异性片段,插入真核表达载体pEGFP-N1-3FLAG。构建含Id2基因质粒和不同靶点的RNAi慢病毒载体,共转染入工具细胞293T,筛选出适合浓度慢病毒感染U251细胞株。MTT法检测敲减Id2后胶质瘤细胞增殖的改变,RT-PCR检测Id2敲减后U251细胞caspase 3的表达。结果构建后载体的PCR鉴定及DNA测序结果与预期一致。与对照组相比,转染Id2 shRNA的U251细胞增殖降低,凋亡率升高,caspase3表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建的针对Id2基因的RNA干扰慢病毒载体体外转染可抑制胶质瘤细胞增殖并促进其凋亡。     

人AURKA基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其对A549细胞增殖的影响

目的:针对AURKA基因构建RNA干扰重组慢病毒质粒并进行慢病毒包装,初步探讨AURKA基因的功能。方法:应用pGCLV-GFP慢病毒载体构建针对AURKA的shRNA载体,转染包装293T细胞,收集病毒上清液,转染肺腺癌细胞株A549。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况确定转染效率,应用Western blot技术检测AURKA基因在蛋白水平表达的变化,以明确RNAi的抑制率。应用BrdU法分析干扰AURKA前后A549细胞增殖情况的变化,运用克隆形成实验检测干扰AURKA后A549细胞株对长春新碱敏感性的变化。结果:针对AURKA基因的RNAi慢病毒表达载体构建成功,PCR和DNA测序鉴定实验表明插入位点与干扰片断的碱基序列完全正确。在293T细胞中进行慢病毒包装,获得高滴度病毒上清液。通过重组慢病毒载体将AURKA shRNA转导入A549细胞中,转染效率为100%。Western blot检测证实LV-AURKA慢病毒显著抑制AURKA的表达,BrdU检测显示AURKA基因表达下调抑制了A549细胞的增殖。克隆形成实验表明AURKA基因表达增强A549细胞对长春新碱的敏感性。结论:慢病毒载体介导的靶向AURKA的RNA干扰可有效抑制AURKA表达,降低肺腺癌A549细胞的增殖能力,并且增强A549细胞对长春新碱的敏感性。     

靶向S1PR3基因shRNA慢病毒表达载体构建及功能鉴定

目的：构建靶向小鼠S1PR3基因的shRNA慢病毒表达载体,并验证其对内皮祖细胞迁移能力的影响。方法依照shRNA设计原则,合成对应的shRNA序列,将其克隆到PHBLV载体中,使用三载体系统进行病毒包装,收集制备成功的病毒,并用荧光显微镜法测定病毒滴度,使用病毒感染EPC后,测定各组细胞中S1PR3蛋白表达情况,选择合适的病毒感染EPC后,测定其对EPC迁移能力的影响。结果成功将shRNA序列克隆到慢病毒表达载体PHBLV-U6-RFP,表达质粒与辅助质粒共转染293细胞后48 h就可以看到细胞中成功表达红色荧光。收集培养成功病毒感染小鼠EPC,可以不同程度干扰细胞中S1PR3蛋白表达,S1PR3蛋白表达受到抑制后,EPC的迁移能力明显减弱。结论我们成功构建了可以有效干扰S1PR3表达的慢病毒载体,并初步观察了其对EPC细胞的迁移能力的影响,为后续进一步调控S1PR3相关的细胞功能的研究奠定了基础。     

STAT3基因沉默抑制人白血病细胞体外生长的实验研究

目的:构建人STAT3 shRNA(short hairpin RNA)慢病毒载体,研究慢病毒介导的STAT3 SiRNA(small interferenceRNA)对人慢性粒细胞白血病K562细胞体外生长特性的影响。方法:针对STAT3基因RNAi有效靶点构建STAT3 shRNA慢病毒载体,293T细胞内包装产生STAT3 SiRNA慢病毒,感染K562细胞后RT-PCR和Western-blot方法验证STAT3基因的敲减效率;细胞生长曲线和MTT法观察STAT3敲减后K562细胞体外生长和增殖情况;流式细胞术和Annexin V-FITC/PI法检测细胞周期改变和早期凋亡。结果:成功得到STAT3 SiRNA慢病毒,RT-PCR和Western-blot实验证实,针对其中两个靶点的STAT3 SiRNA对STAT3基因的敲减效率均在70%以上(P<0.05)。STAT3敲减后,K562细胞生长变慢,细胞增殖活性降低40%(P<0.05);细胞阻滞于G1→S期,并出现早期凋亡。结论:STAT3 SiRNA慢病毒可有效抑制K562细胞内STAT3基因表达,使细胞生长增殖受抑,细胞周期阻滞,细胞出现早期凋...