血管内皮生长因子反义RNA抑制人喉鳞癌的生长

目的　观察血管内皮生长因子1 6 5反义 RNA对人喉鳞癌细胞 Hep- 2的作用 ,探讨其治疗喉癌的可行性 .方法　采用亚克隆技术 ,构建并鉴定反义 VEGF1 6 5真核表达载体 ;重组质粒转染人喉鳞癌细胞 Hep- 2后 ,将其接种于裸鼠皮下 ,利用原位杂交、EL ISA、激光共聚焦、图像分析及微血管计数等方法 ,观察转染前后 Hep- 2细胞的生物学性状和致瘤性的改变 .结果　构建的 VEGF1 6 5反义真核表达载体在 Hep- 2细胞中获得表达 ,转染后的细胞 VEGF1 6 5的表达下降 70 % ,其生物学性状不受外源基因表达的影响 ,但其在裸鼠皮下的致瘤性和血管生成能力明显下降 ,实验组、空载体组和对照组肿瘤体积分别为 (736± 2 6 2 ) ,(74 4 0± 335 )和 (772 0± 35 0 ) mm3(P<0 .0 1) ,微血管密度分别为 (9.6± 5 .4 ) ,(45 .5± 8.4 )和 (48.4± 7.6 ) mm- 2 (P<0 .0 1) .结论　 VEGF1 6 5反义 RNA能够显著减少喉癌细胞内 VEGF1 6 5的表达 ,具有抑制肿瘤生长和血管生成的作用 ,有望成为抗喉癌的新基因治疗手段 .     

血管内皮生长因子_(165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的　探讨应用血管内皮生长因子165(VEGF165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的可行性。方法　构建和鉴定反义VEGF165真核表达载体 ;将其转染入人脑胶质瘤细胞SHG44 ,检测其转染前、后的生物学性状 ;比较转染前、后SHG44细胞的裸鼠皮下致瘤性 ;分别应用免疫印迹、免疫组织化学、微血管计数、电镜和流式细胞仪检测上述改变。结果　成功构建反义VEGF165真核表达载体并在SHG44细胞获得表达 ,该细胞生物学性状不受外源基因表达影响 ,其在裸鼠皮下致瘤性和血管生成能力明显下降。肿瘤终体积 :实验组 2 12mm3,对照组 7897mm3(P <0 .0 1) ;血管计数 :实验组 5 .5 0 ,对照组11 2 2 (P <0 .0 1)。结论　VEGF165反义RNA能有效抑制人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长 ,为基因治疗实体瘤奠定了基础     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸治疗肺癌的实验研究

目的　探讨血管内皮生长因子 (VEGF)反义寡核苷酸对C57BL 6小鼠肺癌的抑制作用。方法　制作C57BL 6小鼠皮下肺癌模型 30只 ,分为VEGF反义寡核苷酸 (ASODN)治疗组、VEGF正义寡核苷酸 (SODN)治疗组及对照组。接种Lewis肺癌细胞后 2 4h内 ,用ASODN及SODN皮下注射治疗 ,对照组只注射生理盐水 ,观察小鼠肿瘤的生长情况以及组织形态学改变。标本常规石蜡切片 ,HE染色。结果　对照组、VEGF反义寡核苷酸治疗组、VEGF正义寡核苷酸治疗组平均瘤重分别为 (7.83± 0 .78)g、(4 .4 9± 0 .4 3)g和 (7.73± 0 .6 9)g。VEGF反义寡核苷酸治疗组、VEGF正义寡核苷酸治疗组抑瘤率分别为 4 2 .7%、5 .9%。结论　原位注射VEGF反义寡核苷酸能抑制小鼠肺癌生长。     

反义寡核苷酸抑制肝癌细胞血管内皮生长因子的表达

目的 研究血管内皮生长因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）反义寡核苷酸（ＯＤＮ）抑制人肝癌细胞系ＶＥＧＦ的表达,探讨肝癌基因治疗的新方法。方法 人肝癌细胞系７７２１能表达ＶＥＧＦ,采用人工合成反义、正义ＯＤＮ分别作用于７７２１细胞,免疫组化图像分析方法比较各处理组ＶＥＧＦ的表达情况,即可了解ＶＥＧＦ反义ＯＤＮ抑制肝癌的血管形成情况。结果 ＶＥＧＦ反     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制大鼠脑胶质瘤生长

目的:观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)反义寡核苷酸对脑胶质瘤的抑制作用.方法:所有大鼠均在立体定向导引下右尾状核区注射含C6胶质瘤细胞1×106的Hank液20 μl,其中实验Ⅰ和Ⅱ组在细胞接种1、2周后分别原位注射1 mmol/L和2 mmol/L的VEGF反义寡核苷酸,对照组则在接种1、2周后原位注射20 μl的Hank液.接种2、3周后给大鼠作磁共振检查,第3周时处死所有的大鼠,观察肿瘤的生长情况,标本常规H-E染色.结果:实验组大鼠有较好的生存状态,而对照组在接种后第2周时开始出现颅内高压,至第3周时大多数大鼠处于濒危状态.实验Ⅰ组、Ⅱ组的抑瘤率分别为 91.5％和100％ .结论:原位注射含VEGF反义寡核苷酸能抑制荷瘤大鼠脑胶质瘤生长.     

血管内皮生长因子反义RNA对人脑垂体瘤细胞的作用

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）反义RNA对人脑垂体瘤细胞的抑制作用,探讨以VEGF反义RNA进行生垂体瘤基因治疗的可行性。方法：将VEGF反义cDNA、正义VEGFcDNA质凿转染垂体瘤细胞,通过Northern印迹杂交鉴定其表达,测定被转染细胞生长率,用原位发校和免疫组化法检测VEGFmRNA及蛋白表达。结果：经鉴定被转染的垂体瘤细胞有外源性VEGF反义基因的整合及表达,其VEGFmRNA及蛋白表达水平降低,但其生长速率无明显减曼。结论：VEGF在垂体瘤血管形成及发生、发展中起重要作用。可能成为基因治疗垂体瘤的优选靶的之一。     

血管内皮生长因子在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的：研究人脑胶质瘤中血管内皮生长因子（VEGF）的表达及意义。方法：采用免疫组化SABC法检测63例人脑胶质瘤组织中VEGF的表达。结果：63例中50例VEGF染色阳性，阳性率79．4％，VEGF的表达与胶质瘤的恶性程度及肿瘤复发相关（P＜0．01），而与患者的性别、年龄、肿瘤生长部位及肿瘤大小无关（P＞0．05）。结论：VEGF的表达与胶质瘤的恶性程度及复发相关，可作为一项有意义的预后指标。     

血管内皮生长因子反义RNA对人脑垂体瘤细胞的作用

目的 :研究血管内皮生长因子 (VEGF)反义RNA对人脑垂体瘤细胞的抑制作用 ,探讨以VEGF反义RNA进行垂体瘤基因治疗的可行性。方法 :将VEGF反义cDNA、正义VEGFcDNA质粒转染垂体瘤细胞 ,通过Northern印迹杂交鉴定其表达 ,测定被转染细胞生长率 ,用原位杂交和免疫组化法检测VEGFmRNA及蛋白表达。结果 :经鉴定被转染的垂体瘤细胞有外源性VEGF反义基因的整合及表达 ,其VEGFmRNA及蛋白表达水平降低 ,但其生长速率无明显减慢。结论 :VEGF在垂体瘤血管形成及发生、发展中起重要作用 ,可能成为基因治疗垂体瘤的优选靶的之一。     

胶质瘤MRI特征与血管内皮生长因子表达的相关性

目的　研究血管内皮生长因子 (VEGF)表达与人脑胶质瘤MRI表现的关系 ,探讨胶质瘤影像学表现的分子机制 .方法　采用免疫组织化学技术从蛋白质水平检测 2 2例人脑胶质瘤和 3例正常脑组织的VEGF表达 ;术前均行MRI检查 ,T2加权像测定瘤周脑水肿大小 ,并与瘤体体积相比较计算水肿指数 ;静脉注射钆 喷替葡甲胺 (Gd DTPA)后T1加权像观察肿瘤增强情况 .结果　 2 2例胶质瘤中 ,2 0例表达VEGF ,I级胶质瘤有 2例未表达 .VEGF表达水平与瘤周脑水肿系数呈显著正相关 (r=0 .811,P <0 .0 1) .注射Gd DTPA后 19例均呈不同程度强化 ,免疫组化染色显示均表达VEGF ;3例低恶度 (WHOI Ⅱ级 )胶质瘤无强化 ,其中 2例I级胶质瘤及正常脑组织既无VEGF表达也无强化 .结论　颅内胶质瘤VEGF表达与瘤周脑水肿及肿瘤强化呈正相关 .VEGF表达与胶质瘤MRI特征的相关性研究 ,可为阐明胶质瘤影像学表现的分子机制及临床评价和治疗胶质瘤提供有价值信息 .     

血管内皮生长因子在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)表达与人脑胶质瘤发生发展的关系，为肿瘤的抗血管治疗提供理论依据。方法 采用免疫组化的方法检测64例人脑胶质瘤和6例正常脑组织中VEGF的表达。结果 VEGF蛋白主要分布在Ⅲ，Ⅳ级胶质瘤组织的瘤细胞和血管内皮细胞，Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤呈低水平表达，正常脑组织不表达。VEGF在人脑胶质细胞瘤Ⅳ级中的阳性表达率为80．95％。结论 VEGF可能通过参与诱发胶质瘤血管的生成，对胶质瘤的演进过程起促进作用。     

人血管内皮生长因子165的基因克隆

目的 :克隆人血管内皮生长因子 1 6 5( h VEGF16 5)的 c DNA序列 ,进而进行序列分析。方法 :异硫氰酸胍一步法从人胎盘组织中提取总 RNA,利用逆转录 -聚合酶链反应( RT-PCR)的方法扩增出 h VEGF16 5c DNA,与 p GEM-T easy连接形成 p GEM/h VEGF16 5重组质粒 ,双脱氧链终止法测定核苷酸序列。结果 :通过 DNA SIS软件将测序结果与已发表的h VEGF16 5序列 ( NM0 0 3 3 76 )比较 ,核苷酸序列完全一致。结论 :获得了 h VEGF16 5的 c DNA基因 ,为下一步的研究工作奠定了基础     

脑胶质瘤组织中血管内皮生长因子的表达意义

目的:探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在脑胶质瘤组织中的表达及其意义.方法:采用免疫组化和核酸原位杂交的方法,检测68例脑胶质瘤和10例正常脑组织标本中VEGF的表达.结果:VEGF蛋白和mRNA在胶质瘤中的阳性表达率随着胶质瘤病理分级的增加而增加,差异均有显著性(P<0.01),而正常脑组织不表达.结论:VEGF高表达与胶质瘤的恶性进展有着密切关系.VEGF可能通过参与诱发胶质瘤血管的生成,对胶质瘤的演进过程起促进作用.     

腺病毒载体介导血管内皮生长因子165基因治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤

目的 研究腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)165基因转移对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)的治疗作用.方法 采用细菌内同源重组技术构建腺病毒重组载体Ad-VEGF.7日龄SD大鼠随机分成3组:假手术组(20只)、HIBD(20只)、Ad-VEGF移植组(Ad-VEGF组,20只),Ad-VEGF移植组在HIBD后3 d于大鼠左侧感觉运动皮层区(坐标AP:+0.3mm,ML:-2 mm,DV:-1.5 mm)立体定位注射2μl重组体腺病毒悬液.移植后7 d采用免疫组织化学法检测鼠脑VEGF蛋白;采用原位缺口末端标记法(TUNEL法)检测鼠脑神经元凋亡情况;大鼠3～4周龄时采用T迷宫觅食实验及足错误、姿势反射、肢体放置实验对其学习记忆、空间能力和感觉运动功能等行为学进行评估;采用尼氏染色法检测鼠脑海马CAl区和皮层单位面积内神经元数目.结果 免疫组织化学法结果 显示皮层与海马Ad-VEGF组VEGF阳性细胞数均明显多于HIBD组(68.09±3.37比24.65±3.37,68.37±3.17比25.14±1.86,均P<0.05).TUNEL结果 显示Ad-VEGF组鼠脑神经元凋亡数目明显低于HIBD组(151.4±21.7比264.4±16.3,P<0.05);行为学检测结果 显示Ad-VEGF组的各项行为学测试成绩均较HIBD组有明显改善(均P<0.05),尼氏染色结果 显示Ad-VEGF组鼠脑海马CAl区和皮层单位面积内神经元数日明显多于HIBD组(70.6±2.3比55.3±2.1,95.1±2.8比70.1±2.7,均P<0.05).结论 腺病毒载体介导的VEGF165基因治疗可增加VEGF蛋白的表达,减少脑细胞凋亡、改善脑损伤后的远期行为学功能,减轻缺氧缺血后的脑损伤,具有神经保护作用.     

带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165载体的克隆

目的 克隆及构建带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165表达载体。方法 对正常引产胎儿肺组织的总RNA进行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），克隆入T载体，测定扩增片段序列，进而克隆入表达质粒pcDNA3.1^-,酶切鉴定重组子。结果 用一对引物（5′引物为-21-7bp,3′引物为554-576bp)可扩增出两个条带，短条带为VEGF121（487bp)，长条带经筛选可得到两个片段，一为正常的VEGF165（619bp)，另一个为新的VEGFmRNA“异常”剪切片段。测序结果显示，此“异常”剪切片段扩增长度为639bp，同样为VEGF165全长核苷酸席子邓列，但在VEGF165的第3种和4外显子之间插入了长度为20bp的片段，经序列检索发现20bp的插入序殓为滞留的第3内含子终末序列，含内含子剪切信号。结论 克隆出带信号肽人血管内皮生长因子基因VEGF121及VEGF165表达载体。同时在正常引产胎儿的肺组织中可能发现了一种新的VEGFmRNA可变剪切形式。     

Expression of Human Vascular Endothelial Growth Factor （VEGF165）in pichia pastoris and Its Biological Activity

Objective :To express human vascular endothelial growth factor(hVEGF165) cDNA in Pichia pastroris,purify the expressed product and detect the biological activity of it.Methods:By inserting hVEGF165 cDNA coding 165 amino acid esidues into Pichia pastoris expression vector pPIC9K containing AOX1 promoter and the sequences of α secreting signal peptides,a recombinant expression plasmid pPIC9K/hVEGF165 was constructed and transformed to yeast host strain KM71,then multiple-copy insert transformants were screened out and cultured in flasks,and hVEGF165 was expressed under the induction of 1% methnol.Results:SDS-PAGE showed that after being induced with 1% methanol for 4d,the expressed product existed in supernatant in the form of soluble molecule and contained 60% of total protein expressed.Western blot showed good antigenicity and specificity of expressed product.After being purified by Heparin-Sepharose CL6B affinity chromatography,the purity of expressed product reached above 90%,Biological assays proved that the expressed product could stimulate the proliferation of HUVEC.Conclusion:hVEGF165 was successfully expressed.The study opened up a wide prospect for the application of VEGF165 in the prevention and treatment of ischemic heart disease and other tissue ischemic diseases such as secondary arterial occlusion in limbs.     

Experimental Study of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Therapy for Avascular Necrosis of the Femoral Head

Avascularnecrosisofthefemoralheadisanin creasingcauseofmusculoskeletalmorbidityinyoungandmiddleagedpersons It’sadebilitatingdiseasethatusuallyleadstodestructionofthehipjoint To taljointreplacementiscommonlyusedtotreatdis ablingsecondaryosteoarthrosis Althoughthemostrecentimprovementsintotalhipreplacementmayde creasethefailure ,thepatientsareusuallyyoungandthecurrenthipprothesiswouldn’tfunctionwellfortheremaininglifeexpectancyforthesepatients Forthisreason ,it’snecessarytodelayoreliminatethe…     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体的构建及其在大肠杆菌的表达

目的　获得人血管内皮生长因子 (hVEGF165)cDNA ,构建真核表达载体 ,并研究其在大肠杆菌中的表达情况。方法　采用PCR方法 ,从HL6 0细胞中扩增出hVEGF165cDNA ,将其克隆至 pcDNA3 真核表达载体上 ,构建成为 pCD hVEGF165重组质粒。将重组质粒转染感受态的大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 ,用Westernblot检测表达产物。结果　经酶切鉴定及基因测序证实hVEGF165cDNA基因克隆成功 ,并建立了高效表达的 pCD hVEGF165重组质粒。Westernblot检测表明 ,组建了具有高效表达hVEGF165的大肠杆菌菌株。结论　成功地克隆和表达出了hVEGF165基因 ,为进一步建立VEGF转基因动物模型 ,研究其在视网膜新生血管性疾病中的应用奠定了基础