人微小病毒B19 VP1独特区蛋白的表达及纯化

目的：利用原核表达系统表达人微小病毒B19的VP1独特区蛋白, 大量发酵培养细菌后纯化蛋白, 为制备VP1蛋白的mAb奠定基础.方法：构建重组质粒VP1-PQE30, 转化大肠杆菌M15, 测序正确后发酵培养、 IPTG诱导表达, 通过SDS-PAGE及Western blot分析表达产物, 表达蛋白经AKTA explorer 100快速纯化系统纯化.结果：成功地构建原核表达系统VP1-PQE30-M15, 经IPTG诱导发酵培养细菌可大量表达VP1蛋白, 纯化后蛋白纯度达95%以上.结论：重组表达质粒可表达VP1独特区蛋白, 高纯度蛋白对制备VP1 mAb及疫苗具有重要意义.     

人类微小病毒B19与儿科疾病

人类微小病毒Ｂ１９（ＨｕｍａｎｐａｒｖｏｖｉｒｕｓＢ１９，ＨＰＶＢ１９。本文简称Ｂ１９病毒）是儿科常见的出疹性疾病—传染性红斑（又称第五病，Ｅｒｙｔｈｅｍａｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ＥＩ）的病因。除了这一轻型自限性感染外，Ｂ１９病毒还可使慢性溶血病病人发生...     

两株人微小病毒B19结构蛋白部分基因序列的测定及分析

人微小病毒B19(humanparvovirusB19,PVB19)是微小病毒科微小病毒属中唯一致人类疾病的病毒 ,是动物病毒中体积最小、结构最简单的DNA病毒。近年来 ,国外对PVB19基因变异进行了大量的研究[1 4 ] ,但国内仅有少数学者对部分地区PVB19分离株的核苷酸片段进行了序列测定[5、6 ] ,且均与标准株对应序列完全一致。还有学者用PCR SSCP法对从华南地区收集的PVB19流行株进行了比较分析 ,结果与国外参考株的SSCP图谱一致[7] 。为了初步了解PVB19广东分离株的基因变异及与其他地区流行的PVB19间的分子进化关系 ,我们对 2例PVB19分离株…     

人微小病毒B19感染的研究进展

人微小病毒Ｂ１９感染的研究进展王凝芳作者单位：１０００３９北京解放军３０２医院１９９７年３月１３日收稿５月１０修回１９７５年Ｃｏｓｓａｒｔ等从一名无症状者血清标本电镜检查中发现直径２０～２５ｎｍ球形病毒样颗粒，编定为Ｂ１９病毒（１）。经证实该病毒属于...     

AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体（mAb）并进行鉴定。方法：用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB／c小鼠，经过3次免疫后，取其脾细胞与sp2／0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果：成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株，分别命名为：188、5E1、5E2，其分泌的mAb为IgG1（188）和IgG2a（5E1、5E2）亚类，他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒，其腹水效价在1：10^5～1：10^6。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV，中和效价达1：1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性，型间无交叉反应，证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论：在口蹄疫病毒mAb的研究中，VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1 mAb的成功制备，为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。     

妊娠期微小病毒B19感染

人微小病毒Ｂ19(ｈｕｍａｎｐａｒｖｏｖｉｒｕｓＢｌ9,Ｂ19)于 1975年由Ｃｏｓｓａｒｔ等人首次在献血者血清中发现。 1984年Ｂｒｏｗｎ等人在苏格兰人微小病毒爆发感染时发现Ｂ19病毒感染与胎儿水肿及自发性流产的关系。近年由于ＴＯＲＣＨ感染等研究的进一步发展 ,以及对孕妇ＴＯＲＣＨ感染的重视 ,使其可得到早期诊断和处理 ,所以ＴＯＲＣＨ感染与胚胎及胎儿发育关系的重要性下降。因为Ｂ19病毒感染十分普遍 ,妊娠期Ｂ19病毒感染与优生的关系就变的非常重要。本文拟对Ｂ19病毒宫内感染的病因、作用机制、危险因素、临床表现、对胎儿的近…     

AsiaⅠ口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法:用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,经过3次免疫后,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果:成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株,分别命名为:1B8、5E1、5E2,其分泌的mAb为IgG1(1B8)和IgG2a(5E1、5E2)亚类,他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒,其腹水效价在1:105～1:106。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV,中和效价达1:1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性,型间无交叉反应,证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论:在口蹄疫病毒mAb的研究中,VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1mAb的成功制备,为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。     

人细小病毒B19-XA株VP1蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达及其反应原性分析

目的:探讨人细小病毒B19-XA株VP1蛋白在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达及其反应原性分析.方法:以PCR法扩增VP1全长基因,并将其克隆到pFastBac1载体中,通过转化E.coli DH10Bac筛选阳性克隆,抽提重组VP1-Bacmid.以VP1-Bacmid经Cellfectin介导转染昆虫细胞Sf9,获取重组杆状病毒,扩增后感染Sf9细胞表达VP1蛋白,并以SDS-PAGE进行鉴定.以表达的重组VP1蛋白作为抗原,采用间接ELISA法检测B19病毒感染的患儿血清抗体,并与德国ELISA试剂盒检测的结果比较,分析表达产物的反应原性.结果:(1)获得含VP1全长基因的重组杆状病毒,转染Sf9细胞后能表达相对分子质量(Mr)约87 000的VP1重组蛋白.(2)以表达的重组VP1蛋白作抗原,与B19病毒感染的患儿血清的反应,平均A值为0.46,P/N值＞2.1,与德国ELISA试剂盒检测的结果(平均A值为0.68)相似.结论:人细小病毒B19-XA株VP1蛋白在Bac-to-Bac表达系统中可成功表达,且表达产物能有效地与抗B19病毒的阳性血清反应,具有良好的反应原性.     

建立人微小病毒B19的PCR检测方法

人微小病毒Ｂ１９是微小病毒科中唯一能感染人的病毒。能够提供Ｂ１９抗原的病毒体外培养系统尚未建成，因此限制了血清学实验的开发和普及。为此作者建立起Ｂ１９病毒的ＰＣＲ检测方法。设计引物在表达外壳蛋白ＶＰ１基因区，扩增长度为４００ｂｐ。     

微小病毒B19的巢式聚合酶链反应检测

人微小病毒Ｂ19(ＨｕｍａｎｐａｒｖｏｖｉｒｕｓＢ19,简称Ｂ19)属微小病毒属 ,是目前动物病毒中体积最小和结构最简单的一类单链线状ＤＮＡ病毒〔1〕 ,自 1974年被Ｃｏｓｓａｒｔ发现以来 ,至今已证实该病毒与传染性红斑、一过性再障、胎儿水肿、死胎和关节炎等多种人类疾病有关〔2〕。新近有Ｂ19感染与心肌炎 ,心肌病 ,川畸病等心肌受累的报道。我们就巢式聚合酶链反应 (ＰＣＲ)对微小病毒Ｂ19ＤＮＡ的检测技术的建立及对 2 9例先天性心脏病心脏组织、30例非先天畸形尸解的心脏组织进行Ｂ19ＤＮＡ的检测结果报告如下。1　材料和方法1.1　…     

人类微小病毒B19感染在桥本甲状腺炎发生中的作用

目的 探讨人类微小病毒B19感染（parvovirus B19,B19）在桥本甲状腺炎（Hashimoto＇s thyroiditis,HT）发生中的作用。方法 对32例手术切除的HT患者甲状腺组织及16例甲状腺腺瘤患者腺瘤旁正常甲状腺组织,分别用原位杂交法（ISH）和免疫组化（IHC）SP法检测B19病毒DNA和病毒蛋白的表达。结果 B19 ISH阳性信号同时来源于甲状腺滤泡上皮细胞和间质浸润的淋巴细胞,而IHC阳性信号大多表达于增生甲状腺滤泡上皮细胞,少数表达于间质浸润的淋巴细胞。在HT中,ISH和IHC阳性率分别为71．9％（23／32）和56．3％（18／32）,而腺瘤旁正常甲状腺组织中,阳性率分别为12．5％（2／16）和6．25％（1／16）,两者比较差异有统计学意义（ISH：X^2=12．783,P=0．000;IHC：X^2=9．158,P：0．001）。结论 HT患者甲状腺组织B19感染率明显高于腺瘤旁正常甲状腺组织,提示HT可能是一种新的B19相关性人类疾病,B19感染在桥本甲状腺炎的发生中可能起重要的作用。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb).方法:以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠, 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合, 杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选, 有限稀释法克隆, 直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体, 用Western blot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定.结果:免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选, 共获得5株抗pET28a-3D的mAb, 其亚类鉴定3株为IgG1 , 2株为IgG2b, 初步判定所得5株mAb识别2个不同表位.Western blot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDV O/China99感染的BHK-21细胞中的3D抗原均特异性结合, 免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白.结论:成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb , 为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础.     

EV71结构蛋白VP1的原核表达及VP1单克隆抗体的制备

目的:原核表达EV71结构蛋白VP1并制备其单克隆抗体。方法:以肠道病毒71型(EV71)P1基因为模板,设计引物扩增出目的片段VP1,将其连接至大肠杆菌表达载体pET-32a(+)上,转化大肠杆菌TG1,筛选出阳性克隆后进行测序。将重组表达载体pET-32a(+)-VP1转化大肠杆菌表达菌株BLgold(DE3),对该工程菌进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,表达产物以包涵体的形式存在。包涵体用6 mol/L盐酸胍溶解,经过Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白。用纯化的VP1蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体(mAb)。结果:获得了24株mAb,其中1株EV71 Westernblot法鉴定呈阳性,5株EV71间接免疫荧光法(IFA)鉴定阳性。结论:成功地制备了VP1的mAb。     

微小病毒B19感染与死胎妊娠结局关系的研究

人微小病毒Ｂ19(简称Ｂ19)感染广泛存在 ,人群中感染率达 6 0 %以上[1] 。目前 ,公认该病毒与传染性红斑、急性造血停滞、胎儿水肿、死胎、关节炎等多种人类疾病有关。为了进一步了解Ｂ19病毒感染与不良妊娠特别是死胎结局的影响 ,我们对 1996年 6月至 2 0 0 1年 6月间来我站做     

微小病毒B19及其它感染因子与婴肝综合征关系的研究

对西安地区８０例婴肝综合征患儿血清做Ｂ１９－ＩｇＭ、ＣＭＶ－ＩｇＭ、弓形体抗体、乙肝５项血清学指标检测，其结果Ｂ１９－ＩｇＭ阳性率为１２．２５％，仅次于ＣＭＶ－ＩｇＭ的检出率、位于第二，提示：人微小病毒Ｂ１９可能是婴肝综合征的病毒病因之一。     

山西地区小儿常见血液病微小病毒B19的感染状况调查

人微小病毒Ｂ 19(ＶＢ 19)感染是致人类疾病的重要病原 ,与小儿血液病关系密切。我们随机采集山西省儿童医院住院的小儿常见四种血液病 16 3例 ,应用聚合酶联链反应技术 (ＰＣＲ)检测ＶＢ19ＤＮＡ。研究对象为 1997年～ 1999年山西省儿童医院住院患儿 ,其中急性白血病41例 ,再生障碍性贫血 2 3例 ,特发性血小板减少性紫癜 (ＩＴＰ) 87例 ,溶血性贫血12例。男 93例 ,女 70例 ,平均年龄 6 5岁。其诊断均符合张之南主编《血液病诊断及疗效标准》。对照组为 2 0名体检正常儿童 ,男 12例 ,女 8例 ,平均年龄 4岁。耐热ＴａｑＤＮＡ聚合酶、四种脱…     

PCR技术对300例妇科患者宫颈人微小病毒B19感染检测

人微小病毒B19（以下简称B19）是引起胎儿水肿、流产和宫内死亡的一个重要病原体，它亦引起畸胎和新生儿疾病。B；，感染与妇科临床疾病的关系尚少见报道。我们应用聚合酶链式反应（PCR）技术，对300例妇科门诊病人进行检测，以探讨B；，与妇科临床疾病的关系。现将结果报告如下。资料与方法一、研究对象与标本采集1996年3月至1997年10月来我院门诊就诊的妇科病人300例。年龄18．52岁。300例均有性生活史，近3个月无阴道冲洗亦未使用抗菌素、抗病毒药物。其中阴道炎78例；宫颈糜烂50例；（阴道炎及宫颈糜烂巳除外其它病因），其它（包括…     

北京地区人Boca病毒外壳蛋白VP2的原核表达及抗原性初步分析

目的 获得新发现的北京地区人Boca病毒(HBoV)主要外壳蛋白VP2,为对该病毒病原学的深入研究打下基础.方法 从已证明为HBoV阳性的临床标本BJ3722中经PCR扩增得到HBoV VP2蛋白编码区基因片段,将其克隆至pUCm-T载体中,然后再亚克隆至原核表达载体pET-30b(+),经双酶切、PCR、序列测定等方法 挑选、鉴定阳性克隆,得到重组表达质粒pET-30b-VP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同的温度下利用IPTG诱导蛋白表达;对得到的蛋白表达产物粗提物经Ni2+亲和层析纯化后,利用抗组氨酸抗体、兔抗HBoV-VP2多肽免疫血清及人血清进行抗原性初步分析.结果 BJ3722 VP2基因正确插入pET-30b中,开放阅读框架正确,表明得到了预期的pET-30b-VP2重组原核表达质粒.比较25℃、30℃、37℃ 3个不同温度下的蛋白表达产物,以25℃ 1 mmol/LIPTG诱导培养过夜后产生的带6×His标记的重组VP2蛋白量最大,主要以包涵体形式存在.VP2蛋白粗提物经Ni2+亲和层析,在pH4.5时获得较理想的纯化结果.Western blot显示所表达的蛋白质能够与抗组氨酸特异性抗体、兔抗HBoV-VP2蛋白多肽免疫血清以及人血清发生反应.结论 本研究成功构建了重组pET-30b-VP2原核表达质粒,改善了表达及纯化条件,得到了较大量的HBoV-VP2蛋白表达,并初步证明表达产物具有抗原特异性,可用于对这一新发现病毒的进一步深入研究.     

胎儿水肿与人微小病毒B19感染关系的临床分析

目的了解胎儿水肿与人微小病毒B19感染的关系.方法对本次或既往妊娠中有水肿胎儿的29例母亲作Rh、ABO血型和相关抗体,以及弓形体、巨细胞病毒、柯萨奇病毒、人微小病毒B19抗体检测.其中,4例孕妇作羊水穿刺,1例作胎心彩超,1对夫妇作血红蛋白基因等测定.结果 29例中,B19病毒感染者17例(58.6%),合并胎儿染色体异常、Rh抗D抗体阳性各1例,夫妇均为α和β地中海贫血基因双杂合子1例.5例孕期B19病毒抗体阳性中2例作了中期引产,1例在4w后胎死宫内,1例分娩正常儿,1例失访.结论由孕妇B19病毒感染引起胎儿非免疫水肿者并不少见,若母体感染后不能正常产生保护性抗体,则极易发生不良妊娠结局.