小鼠脾内免疫法制备重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体

 目的 制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,用于早期弓形虫感染的抗原检测。方法 用弓形虫RH株重组抗原SAG1进行常规免疫结合小鼠脾内免疫,杂交瘤技术制备单克隆抗体。ELISA法筛选阳性克隆,经亚克隆建株。诱生腹水法制备抗体,protein-G亲合层析法进行纯化,测定其亚类、效价;Western blot法分析其特异性;夹心-ELISA法检测抗体的敏感性及特异性;检测弓形虫感染小鼠血液循环抗原,同时用PCR法检测弓形虫B1基因并比较结果。结果 获得2株抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体3B6、10C4,抗体均为IgG1,轻链均为κ链,Western blot显示2株单抗均能识别弓形虫天然的和重组的SAG1抗原。3B6、10C4敏感度分别为31.3 ng和62.5 ng,与血吸虫病、钩虫病及疟疾患者血清均无交叉反应。弓形虫早期感染检测PCR及ELISA法阳性检出率分别为63.2%、47.4%。结论 成功制备小鼠抗重组弓形虫SAG1抗原单克隆抗体,初步用于早期弓形虫感染诊断。     

弓形虫病基因诊断的动物实验研究

目的：建立敏感、特异、稳定的PCR法，用于弓形虫病诊断。方法：选择与合成引物并确立最佳扩增条件，用PCR法检测实验感染鼠血液中弓形虫DNA，并与ELISA法检测循环抗原(CAg)作比较。结果：该PCR检测弓形虫DNA法特异性强，对其他7种寄生虫DNA均不扩增；敏感性高，可检测到0．2pg DNA；检测急性感染弓形虫小鼠血液最早于感染后第2天出现用性，与ELISA法查CAg比较。PCK检测弓形虫DNA法阳性出现时间早、检出率高。结论：该PCR法可应用于弓形虫感染的早期诊断。     

实验小鼠豚鼠弓形虫抗体ELISA试剂盒的研制及应用

本文研究了快速、特异性强、敏感性好的弓形虫抗体ELISA诊断试剂盒。IHA、IFAT和ELISA平行检测3份阳性血清和30份阴性血清，符合率均为100％。IHA和ELISA检测61份小鼠和84份豚鼠血清，结果表明ELISA法敏感于IHA。用本ELISA诊断试剂共检测了319份血清，小鼠阳性率为0．67％．豚鼠为2.22％．说明弓形虫在实验小鼠、豚鼠中感染率报低。     

弓形虫有效抗原表位的筛选及其对小鼠免疫保护性的研究

目的:利用噬菌体随机肽库技术筛选弓形虫抗原的有效表位，并探讨其免疫保护效果。方法：用纯化的弓形虫免疫兔血清IgC对噬菌体12肽库进行三轮筛选，对获得的日的噬菌体用间接ELISA和Dot—ELISA检测其特异性，并对其中的某些克隆进行Western—blot分析和序列测定；用混和噬菌体克隆及强阳性表位克隆免疫BABL／c小鼠．间接ELISA法测定其特异性抗体滴度，攻击感染后观察小鼠存活情况。结果：经三轮筛选，特异性噬菌体得到富集，随机挑取18个克隆经间接ELISA和Dot—ELISA鉴定，有16个克隆能与弓形虫免疫兔血清IgG呈特异性反应。Western—blot分析显示P2克隆能被免抗弓形虫血清所识别，具有类似于弓形虫抗原的免疫原性，其序列为5’-CTTCAGTTGGATCGGGCTCGGTTTTGGAAT CAGGGT-3’，与GenBank的弓形虫已知序列无一级结构的同源性；与原肽库对照组相比，P2实验组和P总实验组免疫小鼠均能诱导出较高滴度的IgG抗体，抗攻击感染后小鼠的存活率及存活时间也均高于对照组。结论：利用噬菌体随机肽库技术获得了弓形虫抗原的有效模拟睥位，这些表位能诱导对弓形虫的部分保护作用。     

小鼠泰泽菌抗体IFA检测方法的建立及其与ELISA方法的初步比较

目的 建立小鼠血清中泰泽菌抗体的IFA检测方法。方法 采用IFA方法以泰泽菌抗原片检测人工感染和人工免疫的ICR小鼠血清中抗泰泽菌抗体，并与日本的泰泽菌抗体ELISA检测试剂盒检测结果进行初步比较。结果 用阳性对照血清，抗原片出现特异性蓝绿色荧光，清晰显示出泰泽菌形态，而阴性血清只出现橘红色的本底。在12份人工感染泰泽菌的小鼠早期血清标本中，IFA方法检出4份阳性，8份阴性，阳性检出率33．3％；而ELISA方法检测12份样本均为阴性。另外，在66份人工免疫泰泽菌的小鼠晚期血清样本中，IFA方法检出44份阳性，22份阴性，阳性检出率66．7％；而ELISA方法检出50份阳性，16份阴性，阳性检出率75．7％，结论 建立的小鼠泰泽菌抗体IFA检测方法能够用于小鼠血清中泰泽菌抗体的检测，特别是早期感染的检测。     

固相放射免疫(SPRIA)在恙虫病立克次氏体血清学检测的应用研究(简报)

为了改进完善恙虫病血清学诊断方法,本文将建立的恙虫病立克次体抗原特异性SPRIA用于检测不同毒株立克次体感染的CBA小鼠血清中特异性抗体和流行地区正常人血清中特异性抗体,同时还与ELISA和IFA进行了比较。结果可见:(1)检测小鼠感染血清抗体,无论是灭活疫苗强毒株或减毒活立克次体,免疫后均可刺激小鼠产生抗体反应,但以减毒株引起的抗体反应持续时间长,滴度也较高(可达     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的：在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶（GDH）与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白，测定重组蛋白的免疫活性。方法：采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫（海南株）GDH基因，双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达，重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清，并用琼脂双向扩散法检测效价，ELISA、Westernblotting检测重组抗原的免疫活性。结果：获到了重组表达的抗原蛋白，表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应，并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答，免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1：16。结论：恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

实验动物弓形虫几种检测方法的应用评价研究

目的:评价检测实验动物弓形虫的2种方法。方法:应用间接免疫荧光法(IFA)、间接酶联染色法(IEA)、间接酶联免疫吸附法(ELISA)对实验动物的血清样品进行检测,以间接免疫荧光(IFA)法作为检测弓形虫的标准方法,比较后2种方法的检出率、敏感性、特异性等。结果血清经IFA、IEA、ELISA检测,分别有32.73%(18/55)、41.86(36/86)和6.34%(4/63)阳性;IFA、IEA两种方法检测血清的阳性率之间无显著性差异(P>0.05),IFA与ELISA两种方法检测血清的阳性率之间有显著性差异(P<0.05)。IEA、ELISA敏感性和特异性分别为100%与86.48%,13.33%与100%;经独立性检验,IFA与IEA两种方法存在关联性(P<0.05),IFA与ELISA两种检测方法相互独立(P>0.05)。结论:与IFA相比,IEA检测弓形虫抗体具有相似的敏感性及特异性,检出率较高,可适用于基层单位实验动物弓形虫抗体的检测;ELISA检测弓形虫抗体敏感性不高,检出率低,仍需进一步探讨和完善。     

小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型标准化血清制备及ELISA检测方法的建立

目的制备标准化小鼠呼肠孤病毒III型（reovirus 3,Reo-3）免疫血清,建立小鼠Reo-3抗体ELISA检测方法。方法使用动物来源的Reo-3病毒感染BALB/c小鼠,获得高效价免疫血清;以BHK-21细胞制备Reo-3病毒抗原,同时制备做正常对照抗原。滴定抗原和标准化小鼠Reo-3血清的最佳工作浓度,进行特异性、敏感性、重复性、稳定性等实验。结果制备18 mL抗Reo-3血清,经检测,IFA效价达1∶640,IEA效价达1∶160;Reo-3抗原和标准化小鼠Reo-3免疫血清最佳工作浓度分别为5μg/mL和1∶2400;该ELISA检测体系Reo-3特异抗原批内变异系数为3.8%,批间变异系数为4.0%;检测灵敏度〉1∶4400;与仙台病毒（SV）、小鼠肝炎病毒（MHV）、小鼠腺病毒（Mad）、小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）、小鼠多瘤病毒（POLY）均无交叉反应。经37℃破坏性试验,2 d稳定性试验相对偏差〈27%。结论本研究制备的Reo-3抗血清达到同批次大量高滴度的水平,可作为检测实验小鼠Reo-3病原的标准化质控血清。本研究建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强。该体系可用于大、小鼠等实验动物Reo-3抗体的检测。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

检测弓形虫的PCR法和ELISA法的比较

目的:建立快速、敏感、特异的PCR方法,用于检测弓形虫感染。方法:选择弓形虫B1基因194bp片段作为扩增模板,优化反应条件,并测定其敏感性和特异性;以104弓形虫RH株速殖子腹腔接种小鼠,用PCR法检测感染动物全血DNA,并与ELISA法检测血清IgM进行比较。结果:本实验中,PCR方法的检测阈值为0.2pg弓形虫DNA,并且与人、小鼠、疟原虫、旋毛虫等DNA均无交叉反应。用PCR法检测感染动物全血DNA,感染后第2d即可测出阳性,总阳性数为1(313/15);而ELISA法检测血清IgM则到感染后第6d才测出阳性,总阳性数为2(2/15)。经统计学检验,二者存在显著差异(P<0.05)。结论:PCR是一种快速、敏感、特异的检测方法,可用于弓形虫病的早期诊断。     

实验大鼠泰泽病原体三种检测方法的比较

目的 利用不同的检测方法调查了解我国实验大鼠中泰泽病原体的携带情况,并比较三种方法的检测结果,为合理选择实验室检测方法提供依据.方法 应用ELISA法,间接免疫荧光（IFA）法和套式PCR法三种检测方法对国内大型实验动物生产厂家送检的125只实验大鼠同时进行泰泽病原体检测,并对比分析检测结果,评估我国实验大鼠泰泽病原体的携带情况.结果 共检测125只实验大鼠,其中清洁级54只,SPF级71只,IFA法检出36只阳性,89只阴性,阳性检出率28.8%：ELISA法检出24只阳性,101只阴性,阳性检出率19.2%：PCR法检出6只阳性,119只阴性,阳性检出率4.8%;ELIsA法和IFA法阳性检出率要高于PCR法.结论 对于泰泽病原体的检测,可以采用IFA法或ELISA法进行抗体检测,对可疑的样品用PCR法验证.相比而言,IFA法具有简单,可靠、价格低廉的优点,可以用于实验大鼠泰泽病原体感染状况的初步调查和流行病学监测.     

LAMP技术检测弓形虫感染方法的建立

目的建立一种快速、简便的检测弓形虫感染的环介导等温扩增方法(LAMP)。方法根据弓形虫RH株SAG1基因序列合成2对特异性LAMP引物,优化扩增体系与参数。通过与常规PCR方法的比较,评估优化后的LAMP反应的特异性和灵敏性。利用建立的LAMP初步检测人工感染弓形虫4 d后白兔与大鼠的肌肉组织。结果 LAMP法检测弓形虫基因组DNA的灵敏度是传统PCR方法的100倍。LAMP法检测与其他常见寄生原虫、寄生虫无非特异性阳性结果。LAMP法检测人工接种动物的肌肉组织,阳性率达到100%,对照组为0,差异有统计学意义(P0.01)。结论 LAMP法检测弓形虫感染快速简便、敏感性高、设备要求低,具有较好的应用前景。     

Comparison of four DNA extraction methods from cerebrospinal fluid for the detection of Toxoplasma gondii by polymerase chain reaction in AIDS patients.

BACKGROUND: Toxoplasmosis is a serious and often life-threatening disease in immunodeficient patients. Polymerase chain reaction (PCR) assays allow a rapid diagnosis of Toxoplasma infection by direct detection of the parasite's DNA. To perform a sensitive, specific, and reliable PCR-based diagnostic test, the availability of pure DNA lacking PCR inhibitors as well as a rapid and easy-to-perform DNA extraction protocol are essential. The aim of the present study was to compare four DNA extraction methods for the detection of T. gondii on cerebrospinal fluid (CSF) using the PCR technology. MATERIAL/METHODS: Four DNA extraction methods (boiling, lysis + centrifugation, the miniMAG commercial system, and phenol-chloroform) were compared with respect to the time of completion, the manual labor involved, and PCR analytical sensitivity for the detection of T. gondii in CSF. The optimal DNA extraction method for the detection of the parasite was evaluated in CSF from 43 AIDS patients using the nest-PCR B1 assay. RESULTS: According to the time required for completion, labor, and PCR analytical sensitivity, the lysis + centrifugation protocol proved to be a simple, efficient, and economical in-house procedure to recover the T. gondii DNA present in the CSF. The diagnostic sensitivity of nest-PCR, according to Centers for Disease Control and Prevention (CDC) criteria, was 86.3% and the diagnostic specificity was 100%. CONCLUSIONS: We report a simple, rapid, reproducible, and economical in-house method for T. gondii DNA extraction from CSF. This method is recommended for diagnostic PCR of Toxoplasmic encephalitis (TE) in places with economical shortage.     

重庆地区TORCH感染的血清学调查

本研究对重庆地区正常人群的TORCH感染进行了血清学调查。共收集160份成人血清,多数为育龄期妇女者,以及100份脐带血清。对上述标本以IFA法检测了弓形体抗体(IgS和IgM),以ELISA法检测巨细胞病毒(CMV)抗体(CMV-IgG和CMV-IgM),以乳胶凝集法检测风疹抗体,以及以补体结合试验(CF)检测单纯疱疹抗体。成人的弓形体、CMV、风疹、单纯疱疹感染率各为32.6％、72.0％、89.4％和79.4％;脐带血清的阳性率则各为21.4％、79.3％、78.9％和90.7％。作者讨论了以上结果的重要性     

应用氯化锶对小鼠卵母细胞孤雌活化的研究

根据弓形虫P30基因序列设计二对引物分别进行了PCR一次扩增和套式扩增，结果这两对引物在一次扩增和套式扩增中分别出现预期的扩增片段914bp,522bp和522bp；套式扩增出现的条带比一产供销扩增出现的条带亮度明显增强，提示套式扩增比一次扩增具有更高的敏感性，用外引物进行扩增后，最低可以检测到1pg的弓形虫DNA，说明所建立的反应体系具有高度的敏感性。用内引物对人工感染弓形虫的ICR小鼠血液，组织进行弓形虫DNA的检测，结果均扩增出522bp的扩增带。根据B1基因序列设计的弓物进行PCR一次扩增和半套式扩增。结果均出现预期的扩增片段619bp,362bp和362bp；用半套式扩增检测感染弓形虫形虫的ICR小鼠血液，组织时可扩增出522bp的619bp,362bp和362bp；用半套式扩增检测感染弓形虫的ICR小鼠血液，组织时可扩增出522bp的扩增带，半套式扩增比一次扩增更敏感。     

P43基因在造血干细胞移植患者弓形虫感染诊断中的应用

目的 建立快速、特异、敏感诊断造血干细胞移植(HSCT)患弓形虫感染情况的DNA检测方法，并讨论其临床意义。方法 利用ELISA和PCR方法对56例造血干细胞移植受及20例正常供同时进行检测。结果 检测造血干细胞移植受56例，PCR和ELISA方法检测弓形虫P43基因片段和其抗原，阳性各为10及7例；其阳性率分别为17．86％和14．3％。作为阴性对照的20名正常同时进行弓形虫的检测，其结果均为阴性。结论 体外扩增弓形虫P43基因的方法具有准确、快速、特异和敏感的优点，可以作为造血干细胞移植患弓形虫感染诊断的有价值的方法之一。     

抗弓形虫伴侣蛋白60多克隆抗体制备与鉴定

目的：制备、鉴定抗弓形虫伴侣蛋白60（TgCpn60）特异性多克隆抗体。方法：以弓形虫RH株cDNA为模板，PCR扩增编码TgCpn60的C末端168个氨基酸（TgCpn60C168AA）的507 bp序列片段，构建pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA重组质粒。将鉴定正确的质粒转化入大肠埃希菌（E.coli ）BL21，并利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，进而用Glutathione-SepharoseTM4B介质亲和层析法纯化重组蛋白后行SDS-PAGE电泳。以纯化的GST-TgCpn60C168AA蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，取小鼠血清进行纯化，获得特异性抗TgCpn60C168AA多克隆抗体。以该多克隆抗体为一抗，进行Western blot检测，验证其与虫体蛋白的反应情况。瞬时转染pFNR-RFP质粒至虫体后，采用间接免疫荧光法（IFA）检测TgCpn60与弓形虫顶质体外腔膜标志蛋白NADP+铁氧化还原蛋白还原酶（TgFNR）的共定位情况。结果：经PCR及测序结果证实重组质粒pGEX-4T-1-TgCpn60C168AA构建成功。SDS-PAGE电泳结果表明，GST-TgCpn60C168AA蛋白成功诱导表达。Western blot结果显示，制备的多克隆抗体既能特异性识别GST-TgCpn60C168AA重组蛋白，同时也能识别弓形虫内源性TgCpn60蛋白。IFA结果证实，TgCpn60蛋白与TgFNR蛋白存在共定位现象。结论：制备的抗GST-TgCpn60C168AA重组蛋白多克隆抗体能特异性识别弓形虫内源性TgCpn60蛋白，为进一步研究该蛋白功能提供了有利的工具。     

间接免疫荧光法检测麻疹抗原在麻疹早期诊断中的临床应用

目的:探讨间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence Assay,IEA)检测麻疹病毒抗原对儿童麻疹病毒(measles virus,MV)感染的早期诊断价值.方法:观察86例临床诊断麻疹的患儿,在发病的不同阶段IFA检测痰液MV抗原和酶联免疫吸附试验(engymelinked imgmunosorbent assay,ELISA)检测血清中MV特异性LgM抗体,采集30份上呼吸道感染患者痰液进行IFA麻疹病毒抗原检测,比较分析检测结果.结果:86例中发病7 d内IFA测抗原ELISA测抗体两种方法的阳性率为分别为97.1%和16.2%;7 d后为33.3%和88.9%,P均＜0.01.IFA测抗原阳性率与检测时间的相关系数为-0.91,P=0.02;ELISA测抗体阳性率与检测时间的相关系数为0.97,P=0.04.30份对照组的标本MV抗原检测均为阴性,IFA测抗原的特异性与敏感性分别是100%和97.1%.结论:IFA测抗原在疾病早期检出阳性率高,阳性检出率与检测时间成负相关,IFA测抗原痰液麻疹病毒抗原是一种早期快速、特异敏感的实验室检测方法.