骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后细胞凋亡的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后心肌细胞凋亡的影响,探讨干细胞移植改善心功能机制。方法:实验于2004-09/2005-10在郧阳医学院附属十堰市太和医院生命科学研究所完成。①21只日本大耳白兔采用随机数字法分为正常对照组、心肌梗死组及干细胞移植组,每组7只。②心肌梗死模型制作3周后,心肌梗死组及干细胞移植组分别在梗死周边区域注射100μL细胞培养基或干细胞悬液,对照组不处理。③4周后心脏超声检测心功能、左室收缩末期内径、左室舒张末期内径等评价心室重塑。处死动物后经流式细胞仪检查梗死区域细胞凋亡情况。结果:①各组兔心脏超声检测结果:与心肌梗死组相比,干细胞移植治疗后,左心室射血分数[(56.27±1.73),(69.41±3.19)%,P<0.001]、左室收缩末期内径[(10.25±0.89),(8.13±0.79)mm,P<0.001]、左室舒张末期内径[(13.82±1.02),(11.24±1.21)mm,P<0.001]、室壁运动明显改善。②各组细胞凋亡检查结果:干细胞移植后,细胞凋亡显著降低[(14.00±0.31)%,(4.30±0.57)%,P<0.001]。结论:干细胞移植可抑制细胞凋亡,改善心功能,预防心室重塑,具有改善梗死后心脏功能的作用。     

骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后正常心肌细胞凋亡的影响

背景:目前的研究显示,骨髓间充质干细胞移植在治疗缺血性心血管疾病中起到了重要的作用,但干细胞移植后改善缺血心肌功能的详细机制尚不明确.目的:观察骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死后大鼠正常心肌细胞凋亡的影响.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008-02/08在福建省高血压研究所完成.材料:密度梯度离心法和贴壁筛选法获得SD大鼠骨髓间充质干细胞.2周龄雄性清洁级SD大鼠16只,体质量200～250g,用于制备心肌梗死模型.方法;16只SD大鼠随机区组法分为2组,对照组:结扎冠状动脉前降支,未进行干细胞移植,只在梗死心肌周围注入等量(200 μL)的生理盐水;实验组:在心肌梗死1 h后,向梗死心肌的周围分4点(200 μL)注入同种异体骨髓间充质干细胞1×1011L-1;每组8只.于移植4周后处死动物,取梗死边缘正常心肌组织,TUNEL法检测心肌细胞凋亡形态,并计算心肌细胞凋亡率.主要观察指标:①凋亡心肌细胞的形态变化.②实验组和对照组心肌细胞的凋亡率.结果:①造模后4周,TUNEL检测显示捌亡的心肌细胞核呈深浅不一的深褐色.细胞轮廓清楚,而正常增殖的心肌细胞不被染色.②经显微镜结合计算机显微图像分析系统检测对照组、实验组心肌细胞凋亡率分别是(1.12±0.06)%,(0.81±0.02)%,两者相比差异有显著性意义(P＜0.05).结论:骨髓间充质干细胞移植在一定程度上可以抑制急性心肌梗死后正常心肌细胞凋亡的发生.     

脂肪间充质干细胞移植对犬心肌梗死后心功能的影响

目的：观察将脂肪间充质干细胞移植人犬心肌梗死模型后，犬心功能的变化情况。方法：实验于2005—08／2006-03在解放军总医院心内科实验室及解放军总医院实验动物中心完成，选用杂种犬13只，按随机数字表法分为2组，对照组7只，脂肪间充质干细胞移植组6只。①两组犬均进行心肌梗死模型制备，取犬脂肪间充质干细胞进行体外分离培养和DAPI标记，脂肪间充质干细胞移植组犬心外膜下共注射2&;#215;10^6个DAPI标记后的脂肪间充质干细胞，对照组注射相同体积IMDM完全培养基。常规关闭胸腔，继续饲养4周。②于细胞移植术前、术后4周行超声心动检查，测定左心室射血分数、左心室舒张末容积及左心室收缩末容积；术后4周行血流动力学检查，测定左心室舒张末压力、左心室收缩末压力、左心室室内压最大上升速率及左心室室内压最大下降速率。术后4周后处死动物取心脏标本观察移植细胞存活及分化情况。结果：对照组1只犬于移植术后第2天死亡，进入结果分析共12只犬，对照组和脂肪间充质干细胞移植组各6只。①移植术后4周移植细胞存活及分化的观察结果：在脂肪间充质干细胞移植组心肌组织冰冻切片中可见发出DAPI蓝色荧光染色的细胞核，同一视野下还可看到发绿色荧光的细胞浆。②移植术后4周两组犬心功能的比较：脂肪间充质干细胞移植组与对照组比较，左心室室内压最大下降速率、左心室舒张末压力、左心室舒张末容积及左心室收缩末容积减少（P〈0．05～0．01），左心室射血分数、左心室收缩末压力、左心室室内压最大上升速率增加（P〈0．05-0．01）。结论：脂肪间充质干细胞移植可在心肌细胞内存活，并可分化为心肌细胞，改善急性心肌梗死后心力衰竭犬的心脏功能。     

骨髓间充质干细胞移植对视神经损伤大鼠视网膜细胞凋亡的影响

目的研究骨髓间充质干细胞移植对视神经损伤大鼠视网膜细胞凋亡的作用。方法制作大鼠视神经钳夹伤模型,随机分为干细胞移植治疗组(M组)和磷酸缓冲液治疗对照组(P组),取大鼠股骨和胫骨骨髓,密度梯度离心结合贴壁筛选法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)并鉴定,将传代培养后的定量MSCs注入损伤术后M组大鼠双眼玻璃体内,P组大鼠则注入等体积PBS,观察视神经损伤后1 d3、d7、d、14 d2、1 d和28 d视网膜形态学改变并应用流式细胞仪检测视网膜细胞凋亡率变化。结果视神经损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGCs)数目随时间延长而减少,组内前后时间段比较有显著性差异(P0.05);M组RGCs降低速度明显慢于P组,M组各时间段RGCs数目与P组同时间段相比均增高,有显著性差异(P0.05);视神经损伤后视网膜细胞出现凋亡,1 d-14 d内随时间延长凋亡率不断上升,14 d达到高峰,随后下降;损伤后21 d内M组各时间段细胞凋亡率均低于P组,二者比较有显著性差异(P0.05),损伤后28 d二者的细胞凋亡率没有统计学差异(P0.05)。结论 MSCs玻璃体内移植可提高视神经损伤大鼠RGCs的存活率,抵抗视网膜细胞凋亡。     

骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后心功能的影响

目的 探讨移植同种异体骨髓间充质干细胞（MSCs）是否具有改善家兔心肌梗死后心功能、缩小梗死面积的作用以及两者间的相关关系。方法 将24只大白兔随机分为急性心肌梗死（AMI）组和MSCs组,每组12只。采用局部注射法,将5-溴脱氧尿核苷（BrdU）标记的MSCs移植到兔梗死心肌边缘带和中心区。通过超声心动图测定两组手术前和术后6周心功能指标。取心脏标本用免疫组化法鉴定植入细胞,病理组织学测定梗死面积。分析心功能与梗死面积的关系。结果 MSCs组梗死心肌边缘带和中心区可见BrdU阳性细胞,AMI组未见BrdU阳性细胞。与AMI组比较,MSCs组术后6周左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD）均明显缩小（P均〈0.05）,左室射血分数（LVEF）、短轴缩短率（ΔFS%）明显增大（P均〈0.05）,组织学测量梗死面积明显缩小（P〈0.05）。两组LVEF与梗死面积均成显著负相关（P均〈0.01）。结论 MSCs移植可能通过缩小心肌梗死面积改善心功能,可用于心肌梗死的治疗。     

骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后心脏自主神经功能影响的机制研究

目的：观察骨髓间充质干细胞移植对猪心肌梗死后心脏自主神经功能的影响，并分析其可能机制。 方法：实验于2004-10／2005—08在南京医科大学第一附属医院心脏科完成。①33只猪随机分3组：正常对照组（对照组，n=10），心肌梗死模型组（梗死组，n=10）和骨髓间充质干细胞移植组（干细胞组，n=13）。②梗死组和干细胞组应用整体交换型球囊导管封堵左前降支制作心肌梗死动物模型，并经导管分别注入3mL生理盐水和3mL 5-溴脱氧尿核苷标记的骨髓间充质干细胞悬液。③4周后各组行心率变异性、心脏血流动力学和组织化学检查。 结果：33只苏中猪均进入结果分析。①骨髓间充质干细胞源性细胞参与了心肌组织和毛细血管网的重建，部分胞浆中还出现了心肌细胞和血管内皮细胞特异性标志物肌钙蛋白T和Ⅷ因子。②心率变异性频域分析发现，梗死组同对照组相比规一化高频成分显著降低[（17．12&;#177;5．17），（28，53&;#177;7．11）nU，P〈0．051；规一化低频成分和低高频成分比值显著增高[（67．82&;#177;12．68）比（44．10&;#177;12．20）nU，P〈0．05：4．10&;#177;0．65比1．61&;#177;0．13，P〈0．01]；干细胞组规一化低频成分与梗死组差异无显著性，但规一化高频成分却较后者显著升高（P〈0．05），以致低高频成分比值较后者显著降低（P〈0．05）。③干细胞组左室收缩压和左室射血分数显著低于对照组（P均〈0．01），却显著高于梗死组（P均〈0．05），干细胞组左室舒张末压显著高于对照组（P〈0．01），而明显低于梗死组（P〈0．05）。④干细胞组毛细血管密度显著高于对照组（P〈0.01）和梗死组（P〈0．01）；梗死组梗死区和非梗死区新生神经和交感神经的密度均较对照组显著升高（P均〈0，01），干细胞组除梗死区新生神经和交感神经密度较梗死组进一步升高（P均〈0．05）外，其他与后者差异无显著性。 结论：骨髓间充质干细胞移植能显著减轻心肌梗死后心脏自主神经功能的紊乱，其机制与骨髓间充质干细胞移植促进心肌细胞、毛细血管和神经组织修复，改善血流动力学状况，减少神经内分泌等系统的激活．不增加心脏神经重构有关。     

脂肪间充质干细胞移植对犬心肌梗死后心功能的影响

目的:观察将脂肪间充质干细胞移植入犬心肌梗死模型后,犬心功能的变化情况。方法:实验于2005-08/2006-03在解放军总医院心内科实验室及解放军总医院实验动物中心完成,选用杂种犬13只,按随机数字表法分为2组,对照组7只,脂肪间充质干细胞移植组6只。①两组犬均进行心肌梗死模型制备,取犬脂肪间充质干细胞进行体外分离培养和DAPI标记,脂肪间充质干细胞移植组犬心外膜下共注射2×106个DAPI标记后的脂肪间充质干细胞,对照组注射相同体积IMDM完全培养基。常规关闭胸腔,继续饲养4周。②于细胞移植术前、术后4周行超声心动检查,测定左心室射血分数、左心室舒张末容积及左心室收缩末容积;术后4周行血流动力学检查,测定左心室舒张末压力、左心室收缩末压力、左心室室内压最大上升速率及左心室室内压最大下降速率。术后4周后处死动物取心脏标本观察移植细胞存活及分化情况。结果:对照组1只犬于移植术后第2天死亡,进入结果分析共12只犬,对照组和脂肪间充质干细胞移植组各6只。①移植术后4周移植细胞存活及分化的观察结果:在脂肪间充质干细胞移植组心肌组织冰冻切片中可见发出DAPI蓝色荧光染色的细胞核,同一视野下还可看到发绿色荧光的细胞浆。②移植术后4周两组犬心功能的比较:脂肪间充质干细胞移植组与对照组比较,左心室室内压最大下降速率、左心室舒张末压力、左心室舒张末容积及左心室收缩末容积减少(P<0.05～0.01),左心室射血分数、左心室收缩末压力、左心室室内压最大上升速率增加(P<0.05～0.01)。结论:脂肪间充质干细胞移植可在心肌细胞内存活,并可分化为心肌细胞,改善急性心肌梗死后心力衰竭犬的心脏功能。     

移植骨髓间充质干细胞对大鼠脑梗死后神经元凋亡的影响

  目的  探讨移植骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stemcells, BMSCs)治疗大鼠脑梗死及其减轻半暗带神经元的凋亡作用。  方法  采集成人志愿者骨髓, 分离培养BMSCs; 线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)2h再灌注脑梗死模型; 建模后第3天分别立体定向脑内移植5×10⁵BMSCs和等量生理盐水, 改良神经功能损害评分(modified neurological severity scores, mNSS)观察神经功能恢复; 建模后第14天TUNEL法检测梗死周边神经细胞凋亡; 建模后第28天免疫荧光染色检测梗死周边神经元的存活; 采用依红-苏木素染色评估梗死体积。  结果  治疗组和对照组比较, 梗死周边TUNEL阳性细胞显著减少(P=0.017), 而神经元核抗原(neuronal nuclei antigen, NeuN)阳性细胞显著增多(P=0.015);同时, BMSCs可显著降低MCAO大鼠的相对梗死体积(P=0.041);mNSS评分显示, 从MCAO后第14天开始, 治疗组评分均显著低于对照组(P < 0.05)。  结论  脑梗死急性期移植BMSCs可显著减少半暗带神经元凋亡, 缩小梗死范围, 有效促进神经功能的恢复。     

骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后心脏自主神经功能影响的机制研究

目的:观察骨髓间充质干细胞移植对猪心肌梗死后心脏自主神经功能的影响,并分析其可能机制。方法:实验于2004-10/2005-08在南京医科大学第一附属医院心脏科完成。①33只猪随机分3组:正常对照组(对照组,n=10)、心肌梗死模型组(梗死组,n=10)和骨髓间充质干细胞移植组(干细胞组,n=13)。②梗死组和干细胞组应用整体交换型球囊导管封堵左前降支制作心肌梗死动物模型,并经导管分别注入3mL生理盐水和3mL5-溴脱氧尿核苷标记的骨髓间充质干细胞悬液。③4周后各组行心率变异性、心脏血流动力学和组织化学检查。结果:33只苏中猪均进入结果分析。①骨髓间充质干细胞源性细胞参与了心肌组织和毛细血管网的重建,部分胞浆中还出现了心肌细胞和血管内皮细胞特异性标志物肌钙蛋白T和Ⅷ因子。②心率变异性频域分析发现,梗死组同对照组相比规一化高频成分显著降低[(17.12±5.17),(28.53±7.11)nU,P<0.05];规一化低频成分和低高频成分比值显著增高[(67.82±12.68)比(44.10±12.20)nU,P<0.05;4.10±0.65比1.61±0.13,P<0.01];干细胞组规一化低频成分与梗死组差异无显著性,但规一化高频成分却较后者显著升高(P<0.05),以致低高频成分比值较后者显著降低(P<0.05)。③干细胞组左室收缩压和左室射血分数显著低于对照组(P均<0.01),却显著高于梗死组(P均<0.05),干细胞组左室舒张末压显著高于对照组(P<0.01),而明显低于梗死组(P<0.05)。④干细胞组毛细血管密度显著高于对照组(P<0.01)和梗死组(P<0.01);梗死组梗死区和非梗死区新生神经和交感神经的密度均较对照组显著升高(P均<0.01),干细胞组除梗死区新生神经和交感神经密度较梗死组进一步升高(P均<0.05)外,其他与后者差异无显著性。结论:骨髓间充质干细胞移植能显著减轻心肌梗死后心脏自主神经功能的紊乱,其机制与骨髓间充质干细胞移植促进心肌细胞、毛细血管和神经组织修复,改善血流动力学状况,减少神经内分泌等系统的激活,不增加心脏神经重构有关。     

骨髓间充质干细胞移植对急性心肌梗死大鼠血管内皮功能的影响

目的:观察骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死对血管内皮功能的影响。方法:实验于2005-09/2006-06在唐山工人医院中心实验室完成。①选用清洁级健康近交系SD大鼠40只,随机数字表法分为假手术组、模型对照组、干细胞移植组、细胞培养基组,10只/组。另取1只大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取。②大鼠处死后无菌条件下分离股骨和胫骨,剔除肌肉、骨膜,剪一侧骨端,用10mL无血清DMEM低糖培养基冲出骨髓细胞后,收集冲洗液制成单细胞悬液,过滤离心,弃上清液,密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞。待细胞80%贴满培养瓶底时,用乙二胺四乙酸和胰蛋白酶混合消化传代。将4,6-二脒-2-苯基吲哚以50mg/L浓度加入第3代细胞培养基中,制成细胞悬液备用。③术前各组大鼠均行气管插管,建立急性心肌梗死模型,以远端供血区心肌组织颜色苍白、心电图检测Ⅱ导联ST段持续抬高为模型建立成功的标志。假手术组仅开胸予以前降支穿线但不结扎。④造模成功后1～3h,干细胞移植组用微量注射器吸取4,6-二脒-2-苯基吲哚标记好的第3代骨髓间充质干细胞悬液50μL,直接注入梗死区边缘的心肌组织。细胞培养基组按干细胞移植组的方法于相同部位注射等量无血清DMEM低糖培养基(pH值6.9)。⑤造模后4周处死各组大鼠,切取心脏组织,于梗死边缘区心肌组织制作切片,荧光显微镜下观察4,6-二脒-2-苯基吲哚标记的供体细胞。留取2mL全血,离心后抽取血清500μL,酶联免疫吸附法测定血清中细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量。结果:40只大鼠均进入结果分析。①体外培养骨髓间充质干细胞的性状观察:从正常大鼠骨髓中分离培养的原代骨髓间充质干细胞,24～48h贴壁生长,短棒状;7～10d达到80%～90%融合;传至第3代骨髓间充质干细胞分布均匀,呈纺锤形。②各组心脏标本4,6-二脒-2-苯基吲哚标记移植细胞的存活状况:干细胞移植组可见成团及散在的4,6-二脒-2-苯基吲哚标记的阳性细胞,其余3组心脏标本中均未见荧光细胞。③各组大鼠血清中细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量检测:与假手术组比较,模型对照组、细胞培养基组、干细胞移植组细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量均明显升高(P<0.01或0.05);与模型对照组比较,干细胞移植组细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1的含量均有所降低[(3.37±0.14),(2.10±0.15)μg/L;(2.64±0.13),(1.74±0.06)μg/L;P均<0.05]。结论:骨髓间充质干细胞移植到实验性大鼠心肌梗死模型后成功存活,能降低血清中增高的细胞间黏附分子1与血管内皮细胞黏附分子1含量,提示骨髓间充质干细胞移植可能通过降低黏附分子的表达来改善血管内皮功能。     

心肌梗死后单个核细胞促间充质干细胞迁移的作用

背景：心肌梗死后间充质干细胞定向心肌迁移的机制尚不甚明了。 目的：探讨基质细胞衍化因子1和趋化因子受体4生物轴在心肌梗死后单个核细胞促间充质干细胞迁移中的作用。 方法：分离培养SD乳鼠心肌细胞及SD大鼠间充质干细胞。12只SD大鼠其中6只建立心肌梗死模型,6只行假手术处理,分离循环血单个核细胞,采用三室共培养模型,分别将 DAPI 标记的间充质干细胞、心肌细胞和单个核细胞培养于三室模型的上、中、下室内,设立心肌梗死组、趋化因子受体4受体阻断剂AMD3100组、假手术组和空白对照组。培养48 h后,荧光显微镜下观察并比较迁移细胞数目,免疫细胞化学和免疫荧光染色分别检测心肌细胞基质细胞衍化因子1和迁移细胞趋化因子受体4的表达。 结果与结论：除空白对照组外,各组中室内均可见迁移细胞,迁移细胞阳性表达趋化因子受体4,心肌梗死组迁移细胞数目显著高于其他各组,加入肿瘤坏死因子α中和抗体和趋化因子受体4受体阻断剂AMD3100后,迁移细胞数目明显减少（P＆lt;0.05）。各组心肌细胞阳性表达基质细胞衍化因子1,心肌梗死组及AMD3100组心肌细胞基质细胞衍化因子1表达灰度值显著高于假手术组及空白对照组（P＆lt;0.05）。表明基质细胞衍化因子1/趋化因子受体4生物轴在心肌梗死后大鼠单个核细胞促间充质干细胞向心肌细胞迁移中发挥了一定作用。     

Effect of mesenchymal stem cells transplantation on heart function after acute myocardial infarction]

OBJECTIVE: To investigate whether mesenchymal stem cells (MSCs) transplantation after acute myocardial infarction (AMI) can improve heart function and decrease infarct size in rabbits and their correlation. METHODS: Twenty-four rabbits were randomly divided into AMI group and MSCs group, each n=12. Exogenous MSCs labeled with bromodeoxyuridine (BrdU) were injected into the border and central area of the ischemic myocardium. Heart function was assessed with echocardiography before transplantation of MSCs and in 6th week after the transplantation. Surviving MSCs in infarcted myocardium were identified by immunohistochemistry. Infarct size was measured histologically. Correlation of heart function and infarctsize were analysed. RESULTS: Immunohistochemical stain revealed that BrdU-positive cells were seen in the infarcted myocardium in MSCs group but not in AMI group. Transplantation of MSCs was associated with a significant diminution of left ventricular end-diastolic dimension (LVEDD), and left ventricular end-systolic dimension (LVESD, both P<0.05), and left ventricular ejection fraction (LVEF) and fractional shortening (DeltaFS%)increased (both P<0.05) as compared with AMI group. Infarct size as measured histologically was significant smaller in MSCs group than AMI group (P<0.05). There were negative correlations between LVEF and infarct size in two groups (both P<0.01). CONCLUSION: Exogenous MSCs transplantation can improve heart function by decreasing infarct size and therefore it might be beneficial in the treatment of AMI.     

骨髓间充质干细胞移植心肌梗死大鼠的心功能

背景：前期研究发现移植的骨髓间充质干细胞能在受损心肌组织内存活和分化。目的：进一步观察局部注射移植同种异体骨髓间充质干细胞对心肌梗死模型大鼠心功能的影响。方法：体外培养的同种异体骨髓间充质干细胞达到一定数量（106）后用BrdU标记。24只SD大鼠随机分为3组：正常对照组未行冠状动脉前降支结扎,取骨髓间充质干细胞约1mL直接注射到冠状动脉前降支心肌的周围;假移植组：在冠状动脉前降支结扎后7d,取等量DMEM培养液直接注射到梗死心肌的周围;骨髓间充质干细胞移植组：冠状动脉前降支结扎后7d,取等量骨髓间充质干细胞直接注射到梗死心肌的周围;分别于移植前、移植后5周测定大鼠心功能。结果与结论：①移植后5周假移植组最大左室收缩末压、左室内压最大（最小）变化速率均低于移植前（P〈0.01）,而左室舒张末压高于移植前（P〈0.01）;移植后5周骨髓间充质干细胞移植组最大左室收缩末压、左室内压最大（最小）变化速率高于移植前（P〈0.01）,而左室舒张末压低于移植前（P〈0.01）。②移植后5周,骨髓间充质干细胞移植组大鼠的最大左室收缩末压、左室内压最大（最小）变化速率均高于假移植组（P〈0.01）,而左室舒张末压明显低于假移植组（P〈0.01）。结果可见骨髓间充质干细胞移植可明显改善心肌梗死模型大鼠心功能。     

骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死大鼠血管新生和内皮功能的影响

目的:通过检测血特异的内皮细胞标记物管性假血友病因子,观察骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死后大鼠局部新生血管情况,并探讨内皮血管功能指标E-选择素与新生血管的关系。方法:实验于2005-09/2006-06在唐山工人医院中心实验室完成。①选用清洁级健康近交系SD大鼠40只,随机数字表法分为假手术组、模型对照组、干细胞移植组、细胞培养基组,10只/组。②另取1只大鼠用于骨髓间充质干细胞的提取。大鼠处死后无菌条件下分离股骨和胫骨,应用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞。待细胞80%贴满培养瓶底时,用乙二胺四乙酸和胰蛋白酶混合消化传代。将50mg/L4,6-二脒-2-苯基吲哚加入第3代细胞培养基中,制成细胞悬液备用。③术前各组大鼠均行气管插管,建立急性心肌梗死模型,以远端供血区心肌组织颜色苍白、心电图检测Ⅱ导联ST段持续抬高为模型建立成功的标志。假手术组仅开胸予以前降支穿线但不结扎。④造模成功后1～3h,干细胞移植组用微量注射器吸取4,6-二脒-2-苯基吲哚标记好的第3代骨髓间充质干细胞悬液50μL,直接注入梗死区边缘心肌组织。细胞培养基组按干细胞移植组的方法于相同部位注射等量无血清DMEM低糖培养基(pH值为6.9),模型对照组仅制作心肌梗死模型不作其他处理,假手术组亦不作其他处理。⑤造模后2,4周各组处死半数大鼠,切取心脏组织,于梗死边缘区心肌组织制作切片,荧光显微镜下观察4,6-二脒-2-苯基吲哚标记的供体细胞。链霉亲和素免疫组化法检测心肌细胞中血管性假血友病因子评估新生血管情况,酶联免疫吸附法测定血清E-选择素含量,评估内皮功能。结果:40只大鼠均进入结果分析。①各组大鼠心脏标本4,6-二脒-2-苯基吲哚标记移植细胞存活状况:骨髓干细胞移植治疗后,荧光显微镜下可见成团和散在的DAPI阳性细胞,其余3组大鼠心脏标本中均未见荧光细胞。②各组大鼠血清E-选择素的检测:心肌梗死后2,4周模型对照组及细胞培养基组E-选择素明显增高,与假手术组比较差异显著[2周:(36.04±4.47),(34.10±2.04),(13.37±3.01)μg/L;4周:(33.02±4.78),(33.96±5.18),(13.94±2.87)μg/L,P<0.01],干细胞组移植组E-选择素较模型对照组明显降低[2周:(24.29±3.51),(36.04±4.47)μg/L;4周:(17.45±3.22),(33.02±4.78)μg/L,P<0.05]。③各组大鼠心肌组织血管性假血友病因子表达情况:链霉亲和素免疫组化法显示,造模后2周干细胞移植组心肌细胞血管性假血友病因子呈强阳性表达,模型对照组和细胞培养基组血管性假血友病因子表达减弱。造模后4周干细胞移植组心肌细胞血管性假血友病因子表达仍呈强阳性,模型对照组和细胞培养基组血管性假血友病因子表达有减弱趋势。结论:①移入的骨髓间充质干细胞存活。②骨髓干细胞移植治疗实验性大鼠心肌梗死模型后,可提高心肌细胞血管性假血友病因子水平,促进局部血管新生。③移植后心肌梗死大鼠血清中E-选择素的降低,可能与其参与血管新生有关,同时也提示骨髓干细胞移植不会诱发E-选择素增高而加重动脉硬化。     

骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后炎性细胞因子表达的调节

目的:近来研究表明,骨髓间充质干细胞具有独特的免疫调节特性,实验拟观察骨髓间充质干细胞移植对梗死心脏炎性细胞因子表达的影响,以进一步认识干细胞治疗心肌梗死的可能机制.方法:实验于2006-11/2007-08在中南大学湘雅二医院心内科实验室和实验动物中心完成.①实验材料:清洁级SD大鼠由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:提取体质量120～150 g SD大鼠骨髓间充质干细胞,以溴脱氧尿嘧啶核苷标记.取体质量180～200 g 雄性SD大鼠,结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型,将模型随机分为3组:假手术组:仅穿线不接扎血管;PBS溶液注射组:模型制作成功即刻心外膜注射PBS液;干细胞移植组:模型制作成功即刻心外膜注射溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞,每组8只.③实验评估:于术后1 ,28 d行心脏超声检测,测量大鼠射血分数、左室短轴缩短率和左室舒张末期直径以评价心脏功能,并进行免疫组织化学和western blot检测,分析移植细胞存活和炎性细胞因子的表达情况.结果:24只建模成功大鼠均进入结果分析.①术后28 d,心脏超声检测显示与注射PBS溶液相比,移植骨髓间充质干细胞可以延缓心室重构,改善心功能[射血分数:(30.76±3.39)%,(24.06±4.71)%,P < 0.05;左室短轴缩短率:(29.33±4.87)%,(23.05±3.94)%,P < 0.05;左室舒张末期直径:(6.45±0.47)mm,(7.81±0.31)mm,P < 0.05] .②免疫组织化学检测显示,心肌梗死后即刻心外膜移植的骨髓间充质干细胞可以在宿主体内存活.③与注射PBS溶液相比,骨髓间充质干细胞移植可以明显降低肿瘤坏死因子α、白细胞介素6表达(P < 0.05) ,同时增加白细胞介素10表达(P < 0.05) .western blot检测与免疫组织化学结果一致.结论:骨髓间充质干细胞移植可以延缓心肌梗死大鼠心室重构,同时下调大鼠梗死心脏促炎细胞因子肿瘤坏死因子α和白细胞介素6表达,上调抗炎细胞因子白细胞介素10表达.     

骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死后炎性细胞因子表达的调节

目的：近来研究表明，骨髓间充质干细胞具有独特的免疫调节特性，实验拟观察骨髓间充质干细胞移植对梗死心脏炎性细胞因子表达的影响，以进一步认识干细胞治疗心肌梗死的可能机制。 方法：实验于2006—11／2007-08在中南大学湘雅二医院心内科实验室和实验动物中心完成。①实验材料：清洁级SD大鼠由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：提取体质量120-150g SD大鼠骨髓间充质干细胞，以溴脱氧尿嘧啶核苷标记。取体质量180—200g雄性SD大鼠，结扎冠状动脉前降支建立心肌梗死模型，将模型随机分为3组：假手术组：仅穿线不接扎血管；PBS溶液注射组：模型制作成功即刻心外膜注射PBS液；干细胞移植组：模型制作成功即刻心外膜注射溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞，每组8只。③实验评估：于术后1，28d行心脏超声检测，测量大鼠射血分数、左室短轴缩短率和左室舒张末期直径以评价心脏功能，并进行免疫组织化学和western blot检测，分析移植细胞存活和炎性细胞因子的表达情况。 结果：24只建模成功大鼠均进入结果分析。①术后28d，心脏超声检测显示与注射PBS溶液相比，移植骨髓间充质干细胞可以延缓心室重构，改善心功能[射血分数：（30．76±3．39）％，（24．06±4．71）％，P〈0．05;左室短轴缩短率：（29．33±4．87）％，（23．05±3．94）％，P〈0．05;左室舒张末期直径：（6．45±0．47）mm，（7．81±0．31）mm，P〈0．05]。②免疫组织化学检测显示，心肌梗死后即刻心外膜移植的骨髓间充质干细胞可以在宿主体内存活。③与注射PBS溶液相比，骨髓间充质干细胞移植可以明显降低肿瘤坏死因子α、白细胞介素6表达（P〈0．05），同时增加白细胞介素10表达（P〈0．05）?     

骨髓间质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的病理学观察

目的:观察急性心肌梗死大鼠行骨髓间质干细胞移植后受损心肌组织的病理形态学变化。方法:实验于2004-01/2005-06在上海胸科医院完成。选取健康成年雌性SD大鼠40只,随机数字表法分为骨髓间质干细胞注射组、模型对照组,20只/组。①两组大鼠均建立心肌梗死模型。造模0.5h后,骨髓间质干细胞注射组于结扎点下方缺血区域组织注射Dill标记的骨髓间质干细胞3×106个,模型对照组心肌缺血区域注射100μL生理盐水。②造模后4～6周处死两组大鼠,取出心脏,剪除双侧心房及右心室,沿左心室长轴由心尖到底部做3mm厚切片,镜下观察心肌梗死区域病理组织学表现。③选择心肌梗死表现明显的蜡块切片,行酸性复红染色,用LeicaQWin多媒体彩色病理图文分析软件进行图像分析,自动测量出切片中心肌梗死组织占总面积的百分比。免疫组化检测梗死心肌血管内皮生长因子和FactorⅧ蛋白因子的表达情况。结果:40只大鼠均进入结果分析。①梗死心肌的病理形态学观察:光镜下两组均可见大小不等的心肌梗死灶,梗死心肌区域细胞肿胀坏死,严重缺血坏死区出现心肌溶解。但骨髓间质干细胞注射组上述改变明显弱于模型对照组,其心肌梗死中层可见条索状的梗死灶及纤维瘢痕灶,并且有残存的心肌呈岛状散在分布,纤维瘢痕区域心肌细胞、微血管和毛细血管数量均明显增加,侧支循环丰富。另外,骨髓间质干细胞移植组于造模初期4只大鼠心内膜面有灶性软骨生成,向心室腔突起。②梗死心肌面积百分率的检测:骨髓间质干细胞注射组梗死心肌面积百分率明显低于模型对照组[(3.69±0.48)%,(19.20±1.77)%,t=7.621～10.820,P=0.001]。③梗死心肌血管内皮生长因子和FactorⅧ免疫组化检测:骨髓间质干细胞注射组血管内皮生长因子、FactorⅧ呈阳性表达,模型对照组未检测到血管内皮生长因子和FactorⅧ。结论:骨髓间质干细胞在大鼠心脏内可以转化为血管内皮细胞或分泌血管内皮生长因子,是治疗缺血性心血管疾病理想的细胞来源。心内膜面有灶性软骨生成可能是由于注射细胞时进针太深,警示注意骨髓间质干细胞移植的副反应。