冬凌草甲素逆转人胃癌细胞SGC 7901/DDP顺铂耐药的作用及机制研究

目的:探讨天然化合物冬凌草甲素(oridonin,Ori)对顺铂(cisplatin,DDP)耐药的胃癌细胞SGC7901/DDP的耐药逆转作用及其相关机制。方法:MTT法检测Ori对SGC7901/DDP的毒性作用及与DDP的协同作用;台盼蓝计数实验及集落形成实验检测Ori对细胞生长的抑制作用;核染色免疫荧光及免疫印迹法检测Ori诱导细胞凋亡作用及逆转SGC7901/DDP细胞DDP耐药的作用机理。结果:Ori能显著抑制SGC7901/DDP细胞增殖、生长和集落形成,并诱导凋亡。机制研究发现,Ori显著抑制与肿瘤多药耐药相关的蛋白的表达,包括P-糖蛋白(P-glycoprotein)、多药耐药性相关蛋白(multidrug resistance-associated protein 1,MRP1)和细胞周期蛋白Cyclin D1;另外,Ori还可以诱导磷酸酶2A的癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A,CIP2A)表达下调,Akt磷酸化下调。结论:Ori能够逆转SGC7901/DDP对DDP耐药并诱导凋亡,其机制可能是通过下调多药耐药蛋白P-gp、MRP1及抑制CIP2A/Akt信号级联。     

木犀草素抑制microRNA-21的表达诱导乳腺癌细胞凋亡

目的研究植物黄酮化合物木犀草素(luteolin)对乳腺癌细胞的凋亡诱导效应,并探讨microRNA-21(miR-21)在其中的作用。方法以MTT法检测细胞活力变化;Annexin V/PI双染流式细胞仪分析细胞凋亡;Western blot法检测胞内细胞色素C(Cyt C)的水平;定量RT-PCR检测miR-21的表达水平;通过构建miR-21质粒表达载体并转染乳腺癌细胞上调miR-21的表达。结果细胞活力检测结果表明,木犀草素可显著降低乳腺癌细胞MDA-MB-453的增殖活力;流式细胞凋亡分析和Westernblot检测结果表明,木犀草素可显著诱导乳腺癌细胞凋亡,并呈现剂量-效应关系;进一步研究显示,木犀草素可显著降低乳腺癌细胞miR-21的表达,而胞内miR-21表达水平的上调可显著降低木犀草素对乳腺癌细胞的凋亡诱导作用和细胞毒性。结论木犀草素可显著抑制乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡,其机制涉及对miR-21表达的抑制。     

低浓度雷公藤甲素联合顺铂对肝癌细胞HepG2活性的影响

目的探讨低浓度雷公藤甲素与顺铂联合用药对人肝癌细胞HepG2活性的影响,及其逆转顺铂耐药的可能机制。方法将人肝癌细胞HepG2分为顺铂单用组和雷公藤甲素加顺铂联合用药组。顺铂单用组分别用浓度为0、2.5、5、10、20、40μg/m L的顺铂处理,联合用药组同时联合低浓度雷公藤甲素(12.5ng/m L)处理HepG2。CCK-8法检测HepG2细胞增殖的抑制率;流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞内P糖蛋白的表达。结果顺铂单用组各浓度(0、2.5、5、10、20、40μg/m L)对肝癌细胞HepG2细胞活力24h的抑制率分别为0、(4.0±1.0)%、(9.7±1.1)%、(29.4±2.4)%、(47.5±2.5)%、(62.9±1.2)%,联合用药组24h抑制率分别为(4.7±1.0)%、(37.1±3.1)%、(44.1±3.5)%、(57.9±3.0)%、(66.9±2.0)%、(74.9±2.0)%,两组比较,细胞活力抑制率差异有统计学意义(P0.01);Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡后发现,顺铂单用组(0、5、10、40μg/m L)诱导HepG2肝癌细胞早期凋亡率分别为(4.3±0.3)%、(8.4±0.3)%、(9.6±0.3)%、(32.3±2.0)%,而联合用药组细胞早期凋亡率分别增加至(9.6±0.4)%、(16.2±0.2)%、(23.2±0.5)%、(53.0±3.6%),两组比较,细胞凋亡率差异有统计学意义(P0.01);PE单染检测P糖蛋白后发现,顺铂单用组(0、5、10、40μg/m L)细胞内P糖蛋白表达率分别为(37.3±0.4)%、(34.2±0.5)%、(30.1±1.1)%、(34.2±2.3)%,无明显变化,而联合用药组P糖蛋白的表达率分别降低至(25.0±1.8)%、(18.6±0.7)%、(8.9±0.3)%、(1.8±0.1)%,两组P糖蛋白表达差异有统计学意义(P0.01)。结论雷公藤甲素与顺铂联合用药可以显著抑制人肝癌HepG2的增殖并诱导凋亡,同时调节HepG2的顺铂耐药性,其作用机制可能与P糖蛋白下调相关,从而对肝癌细胞HepG2发挥抗肿瘤作用。     

雷公藤甲素通过调节microRNA21的表达干预K562/A02细胞的化疗敏感性

目的: 研究雷公藤甲素对K562/A02细胞多药耐药性的逆转作用,并探讨其机制。方法: 四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测雷公藤甲素细胞毒性;采用非毒性浓度雷公藤甲素作用于K562/A02细胞,AnnexinV/PI双标法检测细胞凋亡;荧光定量PCR检测microRNA21表达水平;蛋白印迹法检测Bcl-2蛋白表达水平。microRNA21反义寡核苷酸转染K562/A02细胞,观察细胞增长率,凋亡率和Bcl-2表达的变化。结果: 非毒性浓度（5 nmol/L）雷公藤甲素明显增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性,并能增强多柔比星诱导细胞凋亡的作用,使K562/A02细胞平均凋亡率由4.3%明显上升到18.5%（P< 0.05）;雷公藤甲素作用后,microRNA21和Bcl-2蛋白水平降低;microRNA21反义寡核苷酸转染K562/A02细胞后,降低了Bcl-2表达,提高多柔比星敏感性和多柔比星诱导的细胞凋亡。 结论: 雷公藤甲素增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性,并诱导其凋亡,可能与下调microRNA21水平有关。     

应用siRNA技术下调survivin基因表达以增强SGC7901胃癌细胞对顺铂的敏感性

目的利用小干扰RNA（siRNA）技术特异性下调survivin基因的表达,检测SGC7901胃癌细胞转染前后对顺铂敏感性的变化。方法实验分为空白对照组（control组）、单用顺铂组（CDDP组）、脂质体组（Lip组）、单用survivin siRNA组（siRNA组）、转染survivin siRNA（转染组）及转染survivin siRNA联合顺铂作用组（联合作用组）。人工合成survivin siRNA,通过Lip包裹将siRNA转染胃癌细胞SGC7901,荧光显微镜下观察转染情况。MTT法检测各组细胞的增殖抑制率,Western blot及免疫细胞化学法检测survivin蛋白的表达,Hoechst染色观察细胞凋亡的形态改变。结果Hoechst染色荧光显微镜下control组、Lip组及siRNA组细胞核呈正常的蓝色,而CDDP组、转染组及联合作用组细胞核染色增强、核质浓缩、核碎裂,呈凋亡改变;联合作用组细胞增殖抑制率（63.93±4.22）%明显高于其余各组（P〈0.05）;转染组及联合作用组survivin蛋白表达明显低于其他各组（P〈0.05）。结论应用siRNA技术下调SGC7901胃癌细胞中survivin基因的表达,能够增加其对顺铂的药物敏感性。     

川楝素通过XIAP途径增强肺癌细胞对顺铂的敏感性

目的: 研究天然药物活性成分川楝素对顺铂抗肺癌活性的协同效应并研究其机制。方法：实验对象为人肺癌细胞系A549,实验分为对照组,川楝素组,顺铂组,川楝素+顺铂组及川楝素+顺铂+XIAP质粒。MTT实验检测各组A549的细胞活力抑制率;流式细胞实验检测各组A549的细胞的凋亡;免疫共沉淀及western blot实验检测各组A549的细胞中XIAP表达水平及其与caspase-9和caspase-3的相互作用;western blot实验检测各组A549的细胞caspase-9和caspase-3的活化。结果：顺铂+川楝素组A549的细胞活力抑制率(66.8±5.9)显著高于顺铂单治疗组(15.2±1.2, P<0.05)和川楝素+顺铂+XIAP质粒组(20.4±1.8, P<0.05);顺铂+川楝素组A549的细胞凋亡率(34.5±2.6)显著高于顺铂单治疗组(9.7±0.8, P<0.05)和川楝素+顺铂+XIAP质粒组(13.3±1.2, P<0.05);免疫共沉淀及western blot实验显示川楝素能显著抑制A549细胞中XIAP的表达及其与caspase-9和caspase-3的相互作用,川楝素促进顺铂对caspase-9和caspase-3的活化。结论：川楝素通过下调XIAP的表达增强肺癌细胞对顺铂的敏感性。     

雷公藤甲素抑制大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的作用及机制

目的 观察雷公藤甲素（T10）对小牛血清介导的平滑肌细胞（SMCs)增殖的抑制作用,及其对细胞DNA周期的影响。方法 体外主动脉SMCs培养、结晶紫染色法测定细胞数和流式细胞仪技术。结果 T10明显抑制指数增殖状态SMCs增殖（P＜0．01）,抑制作用呈剂量依赖方式,有部分可逆性。细胞DNA周期分析,T10作用后,指数增殖期SMCs G0/G1主G2／M期细胞比例均显下降（P＜0．05）,S期细胞比例却明显升高（P＜0．01）,细胞凋亡率升高非常显（P＜0．01）。T10作用后静止状态SMCs(0.5%小牛血清培养）无变化。结论 在实验采用的浓度范围内,T10对小牛血清刺激的SMCs指数增殖有明显抑制,其机制可能与T10促进G1期SMCs进入并阻滞于S期,发生凋亡有关。     

顺铂诱导的人胃癌耐药细胞BGC-823/CDDP的建立

目的 建立人胃癌顺铂(CDDP)耐药细胞(BGC-823/CDDP细胞)并研究其生物学特征.方法 采用体外逐步增加顺铂药物浓度反复间歇诱导法建立BGC-823/CDDP细胞系,并对其产生耐药的特点、光镜形态、超微结构、生长特点、细胞周期进行研究,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其药物敏感性.结果 BGC-823/CDDP细胞系生物学特征较亲代细胞发生了变化.BGC-823/CDDP细胞系体积较亲代细胞稍大,并有巨核细胞,透射电镜观察细胞表面微绒毛明显减少.BGC-823/CDDP细胞较亲代细胞的倍增时间延长了4.3 h.细胞周期分布:S期细胞轻度减少;而G0/G1和G2/M期细胞较亲代细胞轻度增多;与亲代细胞比较,BGC-823/CDDP细胞对CDDP的耐药倍数为11.35倍,对丝裂霉素C(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(ADM)分别为4.85、5.29、10.07倍,表明其具有交叉耐药性.结论 本实验成功建立了BGC-823/CDDP细胞系,为下一步实验研究奠定了基础.     

Survivin在胃癌SGC7901顺铂耐药中的作用

目的:探讨Survivin在小剂量顺铂长期作用于SGC7901细胞导致细胞耐药中的作用机制.方法:体外诱导建立人胃癌顺铂耐药细胞株SGC7901/CDDP,显微镜下观察SGC7901/CDDP与正常SGC7901细胞株的形态差异,应用RT-PCR技术及Western blot技术分别检测SGC7901/CDDP与正常SGC7901细胞株中Survivin mRNA的表达和 Survivin蛋白的表达.结果:SGC7901/CDDP与正常SGC7901细胞株有明显的形态差异;SGC7901/CDDP 中Survivin mRNA的表达和Survivin蛋白的表达都高于SGC7901细胞.结论:SGC7901对顺铂耐药可能与顺铂诱导SGC7901/CDDP 中Survivin表达增加有关.     

microRNA-212对胃癌细胞系SGC7901迁移和侵袭能力的影响

目的：研究人microRNA-212（miR-212）对胃癌细胞系SGC7901迁移和侵袭能力的影响。方法：通过化学方法合成人成熟型miR-212抑制基因i-miR-212,分别以25、50、75、100 nmol/L浓度通过脂质体转染方法转染SGC7901细胞,同时设空白组和无序列对照组。采用Real-time PCR、细胞计数和Transwell小室等实验方法,分别检测各组细胞miR-212的表达、miR-212对细胞增殖的影响及miR-212对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果：各浓度i-miR-212转染SGC7901细胞后,miR-212表达均降低,以50 nmol/L i-miR-212转染组最佳,较无序列对照组降低约94.60%;50 nmol/L i-miR-212转染组与无序列对照组在细胞计数上差异有统计学意义（P＜0.01）。在细胞侵袭实验中50 nmol/L i-miR-212转染组透膜细胞明显多于无序列对照组（P＜0.01）,在迁移实验中i-miR-212转染组（50 nmol/L）的透膜细胞明显多于无序列对照组（P＜0.01）。结论：转染成熟型人i-miR-212能使胃癌细胞系SGC7901细胞中miR-212的表达明显下降,并能显著促进胃癌细胞系SGC7901的增殖、迁移及侵袭能力,表明miR-212与胃癌肿瘤细胞的转移具有相关性。     

抑制microRNA-21表达降低HCT-116细胞侵袭转移能力的实验研究

目的:探讨抑制人结肠癌细胞HCT-116 microRNA-21表达降低结肠癌细胞侵袭转移能力作用机制。方法:应用表达反义microRNA-21的质粒miRZip21转染HCT-116细胞,检测microRNA-21的变化,TargetScan和PicTar等工具筛选与侵袭转移相关的靶基因,实时定量PCR方法检测转染前后靶基因mRNA的变化,Western Blot检测靶基因蛋白表达变化,平皿划痕和Transwell实验观察抑制microRNA-21与否HCT-116细胞转移和侵袭能力。结果:筛选出4种与侵袭转移相关的microRNA-21靶基因:TIMP-3,RECK,BMPRⅡ和PCDH17;miRZip21质粒转染HCT-116后,micro-RNA 21表达水平下降约40%,靶基因TIMP-3和RECK 的mRNA及靶蛋白表达上升明显,有统计学意义（P <0.05）;平皿划痕和Transwell实验结果表明抑制microRNA-21后,HCT-116细胞转移侵袭能力明显减弱,差异有统计学意义（P <0.05）。结论:抑制microRNA-21的表达能够减弱HCT-116细胞的侵袭和转移能力。     

沉默MSH3表达增强舌癌细胞对顺铂的敏感性

目的设计靶向DNA错配修复基因MSH3的siRNA干扰片段,观察MSH3有效沉默对舌癌细胞顺铂耐药性的影响。方 法针对MSH3基因CDS区序列,设计3条siRNA片段,体外化学合成小干扰RNA（siRNA）片段,通过脂质体介导转染人舌癌细 胞CAL27。Real-time PCR及Western 检测干扰后MSH3 的表达。MTS,凋亡双染法及细胞免疫荧光检测顺铂处理后细胞存 活、凋亡及DNA双链断裂的情况。结果3 条siRNA 片段转染细胞后,与对照组相比,3 号siRNA 片段转染后能显著降低 MSH3 mRNA及蛋白质表达水平,该片段被选为后续实验。MSH3表达下调后,顺铂的半数抑制浓度（IC50值）分别由21.32降 至13.95 μmol/L（P<0.05）,凋亡指数分别由4.23±1.27升至11.32±1.82（P<0.05）,舌癌细胞中γ-H2AX焦簇（Foci）的数量显著增 加。结论MSH3表达下调可以明显增加舌癌细胞对顺铂的敏感性,减少DNA双链断裂修复是其主要机制之一。     

抑制热休克蛋白70表达可增强宫颈癌细胞对顺铂化疗的敏感性

目的 探讨抑制宫颈癌Hela229细胞内热休克蛋白(HSP)70表达对顺铂(DDP)化疗敏感性的影响.方法 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)及集落克隆法测定各因素对Hela229细胞的抑制作用;溴化丙啶(PI)单染法及DAPI检测细胞的凋亡率;JC-1染色法测定线粒体膜电位(△Ψm)的变化;Western blotting测定相关蛋白的表达;建立裸鼠动物模型测定各因素体内的抑瘤作用.结果 宫颈癌细胞较正常宫颈细胞高表达HSP70;当HSP70抑制剂与顺铂合用,细胞的存活率较单用顺铂显著下降(P<0.01);PI与DAPI染色实验表明HSP70抑制剂能增加顺铂诱导的细胞凋亡率;JC-1染色结果显示,HSP70抑制剂处理后顺铂组细胞线粒体膜电位发生了明显的降低.Western blotting实验结果显示HSP70蛋白表达抑制剂与顺铂合用较单用顺铂显著增加促凋亡蛋Bax/caspase-3表达及caspase-3活化;明显降低抑制凋亡相关蛋白Bcl-2表达.裸鼠移植肿瘤模型结果表明HSP70抑制剂与顺铂合用能增强顺铂对模型小鼠肿瘤的抑制作用(P<0.01).结论 抑制HSP70表达可增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感性,机制可能是通过抑制HSP70,进而调节凋亡相关蛋白的表达,促进宫颈癌细胞凋亡.HSP70有望成为宫颈癌基因治疗的一个新靶点.     

微小RNA-21对宫颈癌HeLa细胞程序性细胞死亡4蛋白表达及细胞增殖的影响

［摘要］目的: 探讨微小RNA-21(miR-21)对宫颈癌HeLa细胞中程序性细胞死亡4(programmed cell death, PDCD4)基因表达及细胞增殖的影响,为应用miR-21对宫颈癌进行基因治疗提供一定的依据。方法: 用脂质体转染的方法,将pre-miR-21、pre-miR-21阴性对照、anti-miR-21、anti-miR-21阴性对照瞬时转染HeLa细胞。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-21相对表达量;MTT法检测宫颈癌HeLa细胞增殖的变化;蛋白质印迹法检测PDCD4蛋白表达情况;荧光素酶报告基因法验证miR-21的靶位点。 结果: pre-miR-21上调miR-21的表达,抑制PDCD4蛋白表达,促进HeLa细胞增殖;而anti-miR-21下调miR-21的表达,增加PDCD4蛋白的表达,抑制HeLa细胞增殖。pMIR-Luc-PDCD4-3′UTR与pre-miR-21共转染后,荧光素酶活性下降,而与anti-miR-21共转染后,荧光素酶活性升高。 结论: PDCD4基因是miR-21的靶基因;miR-21通过调节PDCD4基因的表达调控细胞增殖。     

神经酰胺逆转SGC7901/DDP耐药的实验研究

目的 观察神经酰胺（ceramide,Cer）对人胃癌耐顺铂（cisplatin,DDP）细胞的耐药逆转作用并对其机制进行初步探讨.方法 体外培养SGC7901/DDP细胞后给予外源性Cer及DDP干预,通过MTT、流式细胞仪观察肿瘤细胞增殖、凋亡、周期阻滞情况,免疫细胞化学染色检测细胞Bcl-2、Bax蛋白表达的改变.结果 单独使用DDP 2.5 mg/L、Cer 2.5 μmol/L组细胞增殖、周期阻滞、细胞凋亡、蛋白表达与对照组相比无统计学差异.Cer 2.5 μmol/L预处理后给予DDP 2.5 mg/L可抑制细胞增殖,作用均强于单独使用Cer及DDP组;Cer 5 μmol/L联合DDP 2.5 mg/L组作用强于Cer 2.5 μmol/L联合DDP 2.5 mg/L组.Cer 2.5 μmol/L＋DDP 2.5 mg/L组凋亡率为（19.898±2.003）%,与对照组[（11.930±1.973）%]相比有统计学差异（P〈0.05）,与单独使用Cer及DDP组相比也有统计学差异（P〈0.05）.Cer 2.5 μmol/L预处理后给予DDP 2.5 mg/L Bcl-2表达下降、Bax表达上调,Bcl-2/ Bax比值下降,与单独使用Cer及DDP组相比有统计学差异（P〈0.05）.Cer 2.5 μmol/L预处理后给予DDP 2.5 mg/L出现细胞周期阻滞作用,G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,与单独使用Cer及DDP组相比出现统计学差异（P〈0.05）.结论 Cer逆转了DDP的耐药作用,其中Cer逆转了DDP的凋亡耐药与改变Bcl-2/Bax比值有关.     

乳酸菌培养上清液下调Piwil2基因增强三阴性乳腺癌细胞对顺铂的敏感性

目的 探讨乳酸菌培养上清液(lactobacilli supernatants,LS)处理乳腺癌细胞对顺铂(cisplatin,DDP)敏感性的影响及其机制.方法 采用CCK-8和Western blot检测不同浓度DDP(0、1、2、3、4、5 μg/mL)和LS(体积分数分别为1％、5％、10％、20％)对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和Piwil2基因表达的影响;瞬时转染Piwil2 siRNA沉默MDA-MB-231细胞中Piwil2基因表达,Westernblot检测其沉默效果,CCK-8检测Piwil2基因沉默后对MDA-MB-231细胞增殖的影响;2μg/mL DDP联合不同浓度LS(体积分数分别为1％、5％、10％、20％)作用MDA-MB-231细胞,观察细胞增殖抑制效应和Piwil2蛋白表达的改变.结果 高浓度DDP(≥3μg/mL)可抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P＜0.05),而低浓度DDP(≤2 μg/mL)不能有效抑制细胞增殖;DDP以剂量依赖性方式上调Piwil2蛋白的表达;siRNA沉默Piwil2表达可恢复2μg/mL DDP对细胞增殖的抑制.与对照组(乳酸菌培养基,MRS)比较,LS以剂量依赖性方式下调Piwil2蛋白的表达,但并不影响细胞的增殖;与单用2μg/mLDDP比较,2μg/mL DDP联合20％ LS处理可显著下调Piwil2蛋白的表达并抑制细胞增殖(P＜0.05).结论三阴性乳腺癌细胞中Piwil2的高表达可导致细胞对顺铂敏感性的降低,乳酸菌培养上清液可通过下调PiwiL2基因的表达增强三阴性乳腺癌细胞对顺铂的敏感性.