恶性疟原虫疫苗研究VⅡ.PfCMR基因与人白细胞介素—2基因…

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和Ｓａｌｌ将恶性疟原虫复合抗原基因ＰｆＣＭＲ从质粒ＰＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ中切下，插入质粒ＰＢＶ２２０／ＩＬ－２中人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因的ＥｃｏＲＩ位点，重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，通过ＰＣＲ扩增和酶切鉴定，筛选出自向插入的重组载体ＰＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２。为表达ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２融合蛋白打下基础。     

人钙调素基因表达载体的构建及在大肠杆菌DH5α中的表达

目的;构建人钙调素基因表达载体并在大肠杆菌ＤＨ５α中高效表达人ＣａＭ蛋白。方法：用ＰＣＲ方法获得人钙调素基因Ⅲ（ｈＣａＭⅢｃ ＤＮＡ）,将其插入表达载体ｐＢＶ２２０,构建重组表达质粒ｈＣａＭα／ｐＢＶ２２０,用酶切,ＤＮＡ测序,ＰＣＲ扩增鉴定阳性克隆。结果：阳性重组子在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度诱导可高效表达ＣａＭ蛋白,经１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一分子量与理论值相符的诱导表达条带,其表达     

DNA修复蛋白MGMT基因的克隆及转导脐血CD23^＋细胞后耐药特征的研究

目的：增强脐血ＣＤ３４＾＋造血细胞对化疗药物的耐药表型,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率和耐药基因特性,以及在脐血造血干细胞保护性基因治疗中的作用和意义。方法：应用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从人肝细胞中获得编码六氧甲基鸟嘌呤－ＤＮＡ－甲基转移酶（Ｏ＾６－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ＤＮＡ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ,ＭＧＭＴ）ｃＤＮＡ;利用基因重组技术,将其克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ质粒载体并构建了逆转录病毒载体Ｇ１Ｎａ－ＭＧＭＴ;应用脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ基因转移法将后者导入ＧＰ＋Ｅ８６和ＰＡ３１７病毒包装细胞,以卡氮芥１,３－Ｂｉｓ（２－Ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）－１－Ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ（ＢＣＮＵ）加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染脐血ＣＤ３４＾＋细胞。应用ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈ     

人核糖体磷酸蛋白P2基因的克隆及鉴定

利用聚合酶链式反应技术（ＰＣＲ），从人肺巨细胞癌ＰＬＡ－８０１母系细胞系统克隆化高转移细胞株Ｄ中特异性扩增Ｐ２ ｃＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ２ ｇｅｎｅ ｃＤＮＡ），并将扩增产物克隆入ｐＧＥＭ－３Ｚ载体，获得了重组质粒ｐＭＰ２，对其中两个克隆ｐＭＰ２－１、ｐＭＰ２－２的Ｐ２ ｃＤＮＡ进行了序列分析。结果表明：ｐＭＰ２－１的Ｐ２ｃＤＮＡ序列与文献报道基本     

表达人膜辅助因子蛋白基因的猪内皮细胞可抑制人血清补体的细胞毒作用

目的研究转染人膜辅助因子蛋白基因的猪内皮细胞抗补体的细胞毒作用。方法从人胎盘组织提取总ＲＮＡ,用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增得到人膜辅助因子蛋白（ｈＭＣＰ）基因全长ｃＤＮＡ,将其克隆到带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）ＩＥ启动子的ｐＣＩ－ｎｅｏ哺乳动物表达载体和以ｐＣＩ－ｎｅｏ为基础构建成的带有人ＥＦ－１α启动子的ｐＥＦ－ｎｅｏ哺乳动物表达载体上,得到质粒ｐＣＩＭ和ｐＥＦＭ。利用电穿孔基因转移方法分别转染猪内皮细胞（ＰＥＣ）,以Ｇ４１８筛选稳定表达克隆。用正常人血清处理此转基因细胞来检测其抗补体作用。结果Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明,在ＥＦ－１α启动子引导下的ｈＭＣＰ基因得到了高效表达。死细胞计数和ＬＤＨ释放实验结果表明,表达ｈＭＣＰ基因的ＰＥＣ可有效抑制人血清补体对其的裂解作用（Ｐ＜０．０１）。结论克隆的ｈＭＣＰ基因在ＥＦ－１α启动子引导下于ＰＥＣ可高效表达,且使ＰＥＣ能够抗人补体的细胞毒作用。     

人细胞色素P4502B6的GST融合蛋白及其抗体的制备

目的：获得纯化抗原用于制备ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体方法：ＰＣＲ扩增目的基因片段,亚克隆入融合蛋白表达载体ＰＧＥＸ－３ｂ,构建了重组质粒ＰＧＥＸ／２Ｂ６。然后将该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ分离,获纯化融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６。用ＧＳＴ－３Ｂ２免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,自腹水中获取ＣＹＰ２Ｂ６多克隆抗体。结果：融合蛋白ＧＳＴ－２Ｂ６（ＣＹＰ２Ｂ６２０２￣３５２ａａ）,并获     

采用 PCR-SSP法检测HLA-B27基因

目的：建立顺序特异引物聚合酶链反应（ＰＣＲ－ＳＳＰ）方法检测ＨＩＡ－Ｂ２７基因并与血清学方法比较。方法：设计合成Ｂ２７特异物３个和内源性阳性对照２个,建立ＰＣＲ－ＳＳＰ方法,用于Ｂ２７基因分型。血清学分型为一步法单克隆抗估方法。临床样本１００份,不源于可疑强直性脊柱炎患者。快速酚氯仿法提取模板ＤＮＡ。结果：１００例临床样本ＰＣＲ－ＳＳＰ行Ｂ２７基因分型均获成功。总耗时４ｈ。其中Ｂ２７阴性５８例,阳     

大鼠神经肽Y前体融合蛋白在大肠杆菌中的超表达

应用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从大鼠腋组织钓得神经肽Ｙ（ＮＰＹ）ｃＤＮＡ编码区序列。经ＤＮＡ序列测定证实其准确性后，将该ｃＤＮＡ定向亚克隆入一大肠杆菌的表达载体ｐＭＡＬ－Ｃ＿２的果糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因中。ＤＮＡ测序表明ＮＰＹｃＤＮＡ与表达载体中ＭＢＰ开放阅读框架一致。将重组质粒转入大肠杆茵ＤＨ５α菌系中，该重组大肠杆菌在液体ＬＢ培养基中经１ｍｍｏｌ／Ｌ终浓度的ＩＰＴＧ诱导４ｈ，所表达的ＮＰＹ－ＭＢＰ融合蛋白产量高达大肠杆菌总蛋白量的６０％～７０％。超表达的ＮＰＹ经纯化后将为进一步进行结构与功能研究提供材料来源。     

人睫状神经营养因子在基因在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人睫状神经营养因子（ｈＣＮＴＦ）基因，并大大肠杆菌宿主系统中高效表达出具有生物活性的ｈＣＮＴＦ蛋白。方法 从人外周神经组织总ＲＮＡ经逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增得到编码人ＣＮＴＦ的全长ｃＤＮＡＡ片段，此片段经回收和纯化后克隆进ＰＧＥＭ－５Ｚｆ（＋）质粒载体，并进行了ＤＮＡ序列分析，然后进一步亚克隆进Ｔ７启动子表达载体，用ＩＰＴＧ在大肠杆菌主中诱导ｈＣＮＴＦ蛋白表达，并以体外培     

恶性疟原虫疫苗研究VIPfCMR基因与人白细胞介素-2基因的连接与克隆

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ将恶性疟原虫复合抗原基因ＰｆＣＭＲ从质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ中切下，插入质粒ｐＢＶ２２０／ＩＬ－２中人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因的ＥｃｏＲＩ位点。重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，通过ＰＣＲ扩增和酶切鉴定，筛选出正向插入的重组载体ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２。为表达ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２融合蛋白打下基础。     

人生长分化因子-5完整成熟肽基因的克隆

目的：克隆人生长分化因子-5(hGDF-5)完整成熟肽基因。方法：根据Genbank中hGDF-5的序列化学合成两条引物，从人胎儿软骨组织提取总RNA，通过反转录聚合酶链式反应(RT—PCR)得到hGDF-5完整成熟肽基因。将所得基因片段插入克隆载体pMD18-T并转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒，酶切鉴定并测序。结果：DNA琼脂糖凝胶电泳显示：PCR产物为一长约380bp的带，阳性克隆质粒经双酶切可切出约380bp的片段。全自动DNA测序表明与Genbank中的序列完全相符。结论：通过反转录聚合酶链式反应从人胎儿软骨组织中成功克隆出人GDF-5完整成熟肽基因，基因序列完全正确。     

OPG与MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的 克隆人骨保护素（OPG）成熟肽段编码区基因，并在大肠杆菌中表达。方法 采用RT－PCR法，扩增人OPG成熟肽段编码区cDNA，并克隆入原核表达载体pMAL-c2x中，转化BL21（DE3）PlysS大肠杆菌感受态细胞，经0.1mmol/L IPTG诱导后，收集菌体蛋白，进行SDS－PAGE及Western blot鉴定。结果 获得人OPG成熟肽段编码区cDNA，以构建的原核表达载体pMAL-OPG转化菌株后，可表达人OPG和麦芽糖结合蛋白（MBP）的融合蛋白，相对分子质量（M）为85000。表达产物的蛋白量约为菌体总蛋白的13％。Western blot表明，融合蛋白能与抗人OPG多克隆抗体特异性结合。结论 获得人OPG成熟肽全长cDNA，并在大肠杆菌中以OPC－MBP融合蛋白的形式表达。     

前列腺分泌蛋白94基因的克隆及序列测定

目的:作为构建前列腺分泌蛋白94(PSP94)分泌型表达质粒的基础。方法:从正常前列腺组织中钓取PSP94 cDNA,构建重组质粒pUC19－PSP94,转化后提取目的基因并进行测序。结果:(1)构建了pUC19－PSP94的重组克隆质粒;(2)PCR扩增获得了280bp的PSP94成熟蛋白基因;(3)测定了PSP94的基因序列。结论:所构建的pUC19－PSP94重组质粒可成功地克隆PSP94蛋白基因。     

人骨形态发生蛋白4成熟肽cDNA的克隆及测序

背景：研究表明骨形态发生蛋白4的骨诱导能力最强,但在组织中含量甚微。 目的：克隆人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。 方法：从人胎盘组织中提取信使核糖核酸,根据基因库人骨形态发生蛋白4基因序列合成两条引物,利用一步法反转录聚合酶链式反应技术扩增出人骨形态发生蛋白4成熟肽的基因序列,将聚合酶链反应扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5α进行克隆筛选鉴定及测序。 结果与结论：琼脂糖凝胶电泳检测反转录聚合酶链式反应产物及阳性克隆质粒经双酶切产物显示一长约370 bp的条带,脱氧核糖核酸测序结果与基因库中的序列相符。结果证实,利用反转录聚合酶链式反应技术可成功的从人胎盘组织中克隆出人骨形态发生蛋白4成熟肽基因。     

人白细胞介素15（hIL—15）的基因克隆和序列测定

ＩＬ１５是一种促进Ｔ细胞、Ｂ细胞和ＮＫ细胞生长和分化的细胞因子。本文用ＲＴＰＣＲ方法，自行设计并合成两对引物，成功地从成人脾脏中扩增出ｈＩＬ１５ｃＤＮＡ，并定向克隆入ｐＵＣ１９载体中。经序列测定证实，为ｈＩＬ１５成熟肽ｃＤＮＡ基因。ｈＩＬ１５基因的获得，为进一步在大肠杆菌中高效表达有活性的重组ＩＬ１５，更深入地研究其作用机理，以及临床应用奠定了基础。     

重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体的构建与鉴定

背景：有研究表明骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)异源二聚体比同源二聚体的活性高20倍,但相关BMP 4/7融合基因的相关病毒载体的构建至今少有报道。 目的：构建重组人BMP-4/7 融合基因腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体并检测其表达。 方法：扩增BMP-4、7成熟肽基因;分别构建质粒pGEM-BMP-4和pGEM-BMP-7;采用DNA连接法获取BMP-4/7融合基因,克隆获得pGEM-BMP-4/7质粒,进行基因测序。AAV颗粒转染HEK293细胞,收获病毒载体AAV-BMP-4/7。用SDS-PAGE电泳检测BMP-4/7融合基因蛋白在大肠杆菌的表达。用不同感染复数的AAV-BMP-4/7转染骨髓间充质干细胞3 d,提取细胞总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和ELISA法检测融合基因BMP-4/7在骨髓间充质干细胞中的表达。 结果与结论：PCR 电泳,酶切鉴定及测序结果表明,装入pSNAV质粒中的BMP-4/7 基因正确,pSNAV-BMP-4/7重组成功。RT-PCR检测到骨髓间充质干细胞BMP-4/7融合基因的转录条带,ELISA检测显示经AAV转染的骨髓间充质干细胞中BMP-4/7蛋白随着感染复数的增加表达逐渐增高(P < 0.01)。结果证实,实验成功构建重组骨形成蛋白4/7融合基因腺相关病毒载体。     

人肝癌细胞系中肿瘤相关基因MAGE的克隆

目的 克隆人肝癌细胞系HHCC中的肿瘤相关基因MAGE－1的全长cDNA。方法 根据GenBank中MAGE－1基因编码区，设计PCR引物，用RT-PCR手稿,人人肝癌细胞系HHCC中获得MAGE－1全长cDNA，双酶切后连接入质粒pUC19中，转化入大肠杆菌DH5α。挑选阳性克隆提取质粒，进行DNA序列分析，并将测得的核苷酸序列与GenBank中的DNA序列进行BLAST同源性分析。结果 获得MAGE－1全长cDNA,MAGE-6基因463bp片段，以及1个与MAGE－6基因编码区有93％同源性的片段，可能为MAGE家族中的新成员。结论 人肝癌细胞系HHCC可表达多种MAGE基因，可能有效的MAGE基因出现，为研究MAGE基因在HCC中的表达模式及其在HCC免疫治疗中的靶点提供了新的资料。     

人白细胞分化抗原CD59基因克隆及序列分析

为了获得人ＣＤ５９ｃＤＮＡ完整序列,以建立表达人ＣＤ５９分子的小鼠Ｔ细胞模型,更深入地探补体ＭＡＣ及ＣＤ５９分子与Ｔ细胞活化的关系。方法通过设计和合成成引物,提取细胞总ＲＡＮ进行逆转录反应,经ＰＣＲ扩增目的片段,并将基克隆于ＰＵＣ１８及ＰＵＣ１９质粒上,测定其ＤＮＡ序列。     

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。     

人BDNF成熟肽基因克隆及序列分析(英文)

为研究人脑源性神经营养因子在大肠杆菌中的表达及其在治疗 Alzheimer病中的作用 ,本文作者等克隆了其成熟肽基因并进行了序列分析。提取健康成人末梢血白细胞基因组 DNA作为模板 ,应用 PCR技术扩增人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段 ,并将其插入 p GEM-T质粒。限制性内切酶鉴定重组质粒并进行序列测定和分析。与 Gen Bank提供的已知序列(M61181)比较 ,所克隆的人脑源性神经营养因子成熟肽基因片段长 3 5 7bp,序列完全相同。人脑源性神经营养因子成熟肽基因的克隆 ,为其在原核细胞中的表达、抗体的制备及神经系统疾病的治疗奠定了基础