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1.
目的:构建携带针对靶基因DNA甲基转移酶3b(DNA methyltransferase 3b,DNMT3b)mRNA的shRNA真核表达载体,并从构建成功的重组质粒中筛选出沉默效应最强的干扰质粒。方法:以基因DNMT3bmRNA为靶序列设计三条shRNA序列,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil-1中,构建重组质粒pGensil-1-DNMT3b-shRNA1、pGensil-1-DNMT3bshRNA2、pGensil-1-DNMT3b—shRNA3;经酶切鉴定和测序分析后,将重组质粒分别转染T24细胞中,应用RT—PCR和Western—blot检测各组质粒对DNMT3bmRNA和蛋白的表达抑制情况,并筛选最有效的干扰序列。结果:各重组质粒经酶切鉴定和测序分析显示插入完全正确。RT—PCR结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3bmRNA的抑制率分别为20.44%、79.91%和54.48%;Western blot结果经图像分析,shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3b蛋白的抑制率分别为17.27%、77.74%和56.79%。结论:成功构建了质粒pGensil-1-DNMT3bshRNA(1,2,3),并筛选出pGensil-1-DN—MT3bshRNA2为沉默效应最强的质粒。 相似文献
2.
目的构建并鉴定靶向PGRMC1基因的短发夹RNA (shRNA)真核表达载体。方法根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA (shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经MspI和smoi双酶切线性化的质粒载体中。为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染方法将构建好的3个重组载体导入人卵巢癌细胞株SKOV3中,采用免疫组化法和RT-PCR法检测SKOV3细胞系转染前、后PGRMC1基因表达。结果经限制性酶MsqI酶切位点的酶和Smo I双重消化,PGRMC1成功建立到pcDNA3.1(-)的真核表达载体中。通过RT-PCR和Western印迹分析证实重组质粒已经成功传递到SKOV3细胞系。结论靶向PGRMC1基因shRNA真核表达载体的构建成功,为进一步研究PGRMC1基因在SKOV3细胞中的作用奠定了实验基础。 相似文献
3.
克隆并构建人骨形成蛋白2真核表达载体 总被引:10,自引:1,他引:9
目的探讨构建人骨形成蛋白2(human bone morphgenetic protein 2,hBMP 2)真核表达载体的方法.方法由人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA,利用RT PCR方法扩增获得hBMP-2基因cDNA,将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM T hBMP-2重组质粒载体,转化到大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒.分别用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3.1( )真核表达载体,将克隆载体中hBMP基因重组到pcDNA3.1( )真核表达载体,提取质粒作酶切电泳、PCR鉴定及DNA测序.结果人骨肉瘤细胞中经RT-PCR得到1.2kbp的hBMP 2扩增条带,重组质粒pGEM T-hBMP 2经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP 2条带和4.0 kbp的载体片断;pcDNA3.1 hBMP-2质粒经酶切电泳可见1.2 kbp的hBMP-2条带和5.0kbp的载体片断,重组质粒酶谱分析与预期一致;DNA序列分析测序结果校对后经BLAST分析,表明核酸序列与Gene Bank中和hBMP-2的mRNA序列完全吻合.结论通过此方法能成功克隆获得hBMP-2基因,并构建其真核表达载体. 相似文献
4.
5.
目的 探索构建人血管生成素1(human angiopoietin 1,hAng-1)真核表达载体,转染体外培养兔骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stemcells,MSCs)修复骨缺损的可能性。方法 基因重组和限制性内切酶酶切构建真核表达载体pcDNA3-hAng 1,经脂质体DOTAP介导质粒转染兔MSCs,G418筛选阳性克隆,RTPCR及免疫印迹杂交检测hAng-1 mRNA及蛋白表达。结果 重组真核表达载体pcDNA3-hAng-1经限制性内切酶Xho-I和BamH-I酶切后,电泳显示1.4kb hAng-1目的片段和5.4kb pcDNA3载体片段,转染兔MSCs后,RT-PCR检测出目的基因mRNA,免疫印迹杂交检出hAng-1的蛋白表达。结论 构建的真核表达载体pcDNA3-hAng-1能在转染的兔MSCs中表达,可以为组织工程骨修复奠定基础。 相似文献
6.
目的克隆人脆性组氨酸三联体(FHIT)基因,构建其真核表达质粒pRcCMV-FHIT。方法提取人外周血总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)技术扩增人FHITcDNA全长开放阅读框序列,PCR产物与中间载体pGEM-T连接后转化到大肠杆菌DH5α。然后对单菌落进行菌落PCR、限制性内切酶酶切鉴定和测序。用EcoRI将目的片段切下,插入真核表达载体pRc/CMV2的相应位点,构建表达质粒pRc/CMV2-FHIT,将该重组质粒转化到大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR、酶切鉴定。结果测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的FHITcDNA含有781个碱基,与Genbank(NM_002012.1)序列完全一致。pRc/CMV2-FHIT经酶切鉴定与预期结果一致。结论成功构建重组真核表达质粒pRcCMV-FHIT,为进一步研究脂质体转染FHIT基因对结肠癌细胞株SW480凋亡作用的影响奠定基础。 相似文献
7.
目的:用反转录PCR法,调取肝内胆管癌细胞内的端粒醅RNA(hTR)基因,并针对其序列设计反义RNA封闭基因及锤头状核酶切割基因序列,并将其构建入真核表达载体pTriEx-4内。方法:根据hTR cDNA序列,设计引物,RT-PCR法从体外培养的肝内胆管癌细胞内调取hTR模板区基因,根据其测序结果,合成反义RNA基因及核酶基因,与经相应酶切的真核表达载体连接,酶切鉴定重组体的正确性。结果:经RT-PCR从细胞内调出68bp序列,与hTR cDNA比较.与模板区域碱基序列一致。反义RNA与核酶基因重组子经酶切鉴定序列正确。结论:RT-PCR法可调出其hTR基因有效片段;成功构建了针对hTR模板区的反义RNA基因和核酶基因的真核表达载体。 相似文献
8.
真核表达载体 pcDNA3.1-h转化生长因子-β1的构建 总被引:5,自引:1,他引:5
目的:为研究软骨细胞基因转染的可行性创造条件,从而为基因修饰的软骨组织工程研究奠定基础。方法:应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定pcDNA3.1-TGF-β1真核表达载体,经Fugene6介导质粒转染3T3细胞后应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTGF-β1 mRNA在真核细胞中的表达。结果:重组真核表达载体pcDNA3.1-TGF-β1经限制性内切酶Xho I和Hind Ⅲ酶切,电泳后显示1.35kb的hTGF-β1目的片段和5.40kb的pcDNA3.1载体片段,证明重组质粒连接正确;经RT-PCR检测了hTGF-β1在转录水平mRNA的表达情况,表明质粒转染3T3细胞后hTGF-β1mRNA的表达明显增强。结论:重组真核表达载体构建正确,并能在真核细胞3T3中表达hTGF-β1 mRNA,为其在软骨组织工程中的基因转染奠定了基础。 相似文献
9.
目的:构建含人OX40-IgG1融合基因的真核表达载体pDC315-0X40Ig,表达具有生物学活性的OX40Ig融合蛋白,为诱导异体复合组织移植免疫耐受的基因治疗作准备.方法:全基因合成目的基因OX40Ig,即人0X40胞外段序列及人IgG1 Fc段序列,将该片段插入到pUC57(+)载体后,亚克隆至真核表达载体pDC315(+),构建pDC315-0X40Ig重组质粒.构建的重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定后,用脂质体法转染于NIH/3T3细胞.以SDS-PAGE与Western Blotting检测细胞培养上清中OX40Ig融合蛋白的表达情况;MTT法观察OX40Ig对混合淋巴细胞反应(MLR)的抑制作用.结果:合成的目的基因全长1320bp,构建的重组质粒经PCR,双酶切及测序鉴定正确.SDS-PAGE与Western Blotting证实OX40Ig融合蛋白在3T3细胞中实现表达,表达产物相对分子量为48000左右,与理论预期值相符.体外实验证实OX40Ig蛋白能够抑制异基因淋巴细胞的MLR.结论:成功构建了人OX40-IgG1融合基因真核表达载体pDC315-OX40Ig,体外实验证实表达的OX40Ig蛋白可抑制淋巴细胞增殖,为干预同种异体复合组织移植排斥反应奠定了基础. 相似文献
10.
两种端粒酶逆转录酶启动子真核表达载体的构建 总被引:1,自引:2,他引:1
目的:构建hTERT启动子和保留HBV同源序列的缺失点变hTERT启动子(pGL3-del445)的真核表达载体,为进一步研究HBV与hTERT启动子的关系奠定实验基础。方法:通过双酶切及PCR方法从pCR-TRTP载体上将全长及含有HBV同源序列的hTERT启动子的基因序列克隆到pPL-basic多克隆位点上,构建真核表达载体pGL-3-TRTP与pGL3B-del445,将该两质粒与pRL-tk共转染不同细胞系,评估其端粒酶启动子活性。结果:经测序证明成功构建了全长及含有HBV同源序列曲hTERT启动子的真核表达载体pGL3-TRTP和pGL3B-del445,共转染实验中,证实在永生细胞系中重组子高效表达,在非永生正常细胞中重组子不表达。结论:构建的两种重组表达载体具有端粒酶启动子活性,在不同端粒酶表型的细胞系中其表达具有选择性。 相似文献
11.
VEGF15基因表达载体的构建和鉴定 总被引:2,自引:0,他引:2
目的:构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165并在哺乳动物细胞中实现目的基因的特异表达,为重组VEGF165进一步的生物学活性和临床研究奠定基础.方法:采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),在脂质体介导下将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,以抗生素培养基筛选抗性细胞,并对抗性细胞进行单克隆化,采用双抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blotting等方法对目的蛋白在细胞中的特异表达进行分析鉴定.结果:完成真核表达载体pcDNA3.1(+)-VEGF165的构建,并成功转染NIH/3T3细胞,筛选到一批G418抗性的阳性细胞,单克隆化的阳性细胞(吸光度值0.345±0.064)与空载体转染(吸光度值0.114±0.012)的对照比较,有显著的VEGF165表达(P〈0.01),SDS-PAGE和Western Blotting检测到VEGF165在扩大培养的克隆细胞中的特异表达.结论:应用pcDNA3.1(+)-VEGF165载体转染的NIH/3T3细胞可高效表达具生物学活性的VEGF165重组蛋白. 相似文献
12.
目的:构建经血管内皮生长因子(VEGF)165转染的成纤维细胞-脱细胞异种真皮替代物,观察其在促进大鼠深度创面愈合过程中的作用.方法:采用分子生物学方法将扩增的VEGF165基因克隆入真核表达载体pcDNA31(+),在脂质体介导下将重组质粒转染至经传代培养的鼠成纤维细胞(NIH/3T3),再将转染后的NIH/3T3接... 相似文献
13.
目的研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅱ(SPⅡ)与肝细胞蛋白——尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4(NADHDH4)结合机制及其调节功能。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术,参照HBVayw基因序列与NADHDH4cDNA序列全编码区设计相应引物,以pCP10质粒及肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板,扩增SPⅡ和NADHDH4的DNA片段,将其分别克隆至pCAT3及pcDNA3.1(-)中,构建pCAT3-SPⅡ报告基因表达载体和pcD-NA3.1(-)-NADHDH4真核表达载体,以其质粒共转染HepG2细胞。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测pCAT3-SPⅡ报告基因表达载体对pcDNA3.1(-)-NADHDH4真核表达载体的调节活性。结果成功构建了pCAT3-SPⅡ报告基因表达载体和pcDNA3.1(-)-NADHDH4真核表达载体,pCAT3-SPⅡ实验组酶表达为pCAT3的2.8倍,而pcDNA3.1(-)-NADHDH4+pCAT3-SPⅡ实验组酶表达约为pCAT3-SPⅡ的5倍,结果显示NADHDH4对HBVSPⅡ具有上调作用。结论共转染实验证实了NADHDH4对SPⅡ有明显的上调作用,为进一步阐明乙型肝炎病毒致病的分子生物学机制奠定了基础。 相似文献
14.
目的构建携带大鼠血管生成素.1(angiopoietin-1,ANG.1)基因的重组腺病毒载体,并检测其转染对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs)活力的影响。方法RT-PCR法获取大鼠ANG-1基因并亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,经测序无误后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组。重组质粒pAdEasy-1-ANG-1经鉴定后转染293细胞进行病毒包装扩增。体外转染BMSCs,检测转染后BMSCs中ANG-1的表达。MTT法评估常氧及缺氧环境下ANG-1对BMSCs的影响。结果重组腺病毒载体pAdEasy-1-ANG-1经测序及酶切鉴定正确;BMSCs经转染ANG-1基因后表达ANG-1。MTT法检测提示常氧及缺氧条件下转染前后BMSCs活性的差异均无统计学意义(缺氧组与缺氧下转染组相比,P〉0-05;常氧组与常氧下转染组相比,P〉0-05)。结论成功构建大鼠ANG-1基因重组腺病毒载体,且其转染在体外不影响BMSCs的活性。 相似文献
15.
目的观察乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对QSG7701细胞中DNA甲基转移酶(DNMT)3A/3B表达的影响。方法本研究室前期构建好的重组表达质粒pcDNA-X及空载体pcDNA3.0分别转染QSG7701细胞,经含G418的选择性培养基筛选获得稳定转染HBV-X基因的细胞克隆(pcDNA-X/QSG7701)及稳定转染空载体pcDNA3.0的细胞克隆(pcDNA3.0/QSG7701)。采用RT-PCR、Westernblot分别检测转染细胞中HBxmRNA和HBx蛋白的表达。Real-timePCR检测3种细胞DNMT3A/3BmRNA的表达情况。免疫组织化学法检测3种细胞DNMT3A/3B蛋白的表达情况。结果RT-PCR、Westernblot检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中有HBxmRNA及HBx蛋白的表达。Real-timePCR结果显示pcDNA-X/QSG7701中DNMT3A/3BmRNA表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及未转染的细胞QSG7701(P〈0.05)。免疫组织化学检测结果显示pcDNA-X/QSG7701细胞中DNMT3A/3B蛋白表达水平显著高于pcDNA3.0/QSG7701及QSG7701细胞(P〈0.05)。结论稳定转染HBV-X基因的人源性永生化非瘤性肝细胞QSG7701中DNMT3A/3BmRNA和蛋白的表达水平均显著升高,提示HBV-X基因在mRNA及蛋白水平能上调转染细胞中DNMT3A/3B的表达,而细胞中DNMT3A/3B表达的增加是否能进一步影响癌基因、抑癌基因的表达水平,从而导致细胞癌变,尚有待进一步研究。 相似文献
16.
目的:利用细菌内同源重组法构建含血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒,并观察其在内皮祖细胞(EPCs)中的表达,为进一步研究其在慢性肾脏病中的作用奠定基础。方法:用限制性内切酶XbaⅠ+HindⅢ从质粒载体中切出VEGFl65基因片段,与KpnⅠ+HindⅢ双酶切的pAdTrack-CMV形成转移质粒pAdTrack-CMV-VEGFl65,PmeI酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,由人胚肾293细胞包装成Ad-VEGFl65,PCR和westem blot法鉴定其表达。贴壁法体外培养获得大鼠骨髓来源的EPCs,Ad-VEGFl65基因体外转染EPCs,检测转染后目的基因的表达情况。结果:利用CSCI,法由pAdTrack-VEGFl65和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态茵,可获得阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因,病毒滴度1.4×10^10pfu/ml。Ad-VEGFl65转染培养第6天的EPCs后24h开始,培养上清中VEGF蛋白表达较对照组和转染前增加。结论:成功制备的重组体腺病毒Ad-VEGFl65转染体外培养的EPCs后,在体外能有效高表达目的基因产物,为今后VEGF在肾脏病中的深入研究奠定了基础。 相似文献
17.
目的:构建基于Tat细胞穿透肽和核定位信号NLS的重组酶Cre蛋白表达载体,引导Cre内化并人核实现细胞水平的基因敲除。方法:在带His标记的细胞穿透肽Tat和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b—SBP-Tat—EGFP基础上,利用酶切连接的方法将NLS—Cre片段插入带上述表达载体中,构建新的融合蛋白表达载体pET14b—SBP-Tat—NLS-cre-EGFP;经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经异丙基硫代一争I)I半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用Ni^2+亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入到培养的cdc42基因两端带Loxp位点的C57小鼠腹腔巨噬细胞中,在Zeiss荧光显微镜下观察蛋白转导效率,并用Westernblot方法在蛋白水平检测并验证细胞水平目的基因敲除效果。结果:经酶切、基因测序证实重组载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;Zeiss荧光显微镜下观察融合蛋白穿透细胞膜并进入细胞,细胞在经融合蛋白内化处理后目的基因蛋白的表达量与对照组没加Tat融合蛋白比较有明显降低。结论:利用Tat细胞穿透肽成功构建了基于细胞穿透肽的带有NLS-Cre的Tat蛋白表达运输载体,建立了可携带Cre进入细胞核进行基因敲除的系统,说明利用该系统可以实现细胞水平的基因敲除。 相似文献
18.
[摘要] 目的 探讨FOXO1对骨肉瘤细胞侵袭迁移能力的影响及机制。方法 采用实时荧光定量PCR(qRT?PCR)的方法检测人正常成骨细胞hFOB 1.19和人骨肉瘤细胞U2OS、MNNG/HOS中FOXO1的mRNA表达水平。利用pcDNA3.1?FOXO1重组质粒建立FOXO1过表达的细胞模型,空载质粒(pcDNA3.1?vector)作为对照,qRT?PCR和蛋白质印迹法(Western blot)验证转染效率。确定成功过表达FOXO1基因后利用Cell Counting Kit?8(CCK?8)实验检测骨肉瘤细胞的增殖能力(吸光度值),Transwell实验体外检测骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力,并采用qRT?PCR和western blot的方法检测基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达变化。结果 人骨肉瘤细胞MNNG/HOS、U2OS中FOXO1的mRNA的表达水平显著低于人成骨细胞hFOB 1.19(P<0.05),且骨肉瘤细胞U2OS的FOXO1的表达水平较低。重组质粒pcDNA3.1?FOXO1转染后,骨肉瘤细胞U2OS的FOXO1表达水平显著升高。与对照组(pcDNA3.1?vector)比较,U2OS?FOXO1过表达组的细胞的增殖能力降低(P<0.05),侵袭迁移和迁移能力降低,MMP9较对照组表达水平明显降低(P<0.05)。结论 骨肉瘤细胞中FOXO1表达水平明显低于正常成骨细胞。过表达FOXO1可能通过下调MMP9抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力。 相似文献
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目的:构建携带抑癌基因PTEN的腺病毒载体,探讨PTEN基因对前列腺癌细胞株PC-3增殖及cyclin D1、p21表达的影响。方法:采用RT-PCR方法从大鼠海马神经元扩增目的基因PTEN,连接入pENTR2A载体,在293A细胞中进行重组腺病毒的包装及扩增。以携带PTEN基因的腺病毒载体感染体外培养的前列腺癌细胞株PC-3。采用间接免疫荧光法检测细胞中PTEN的过表达情况。Western印迹检测PTEN、cyclin D1和p21表达的变化,通过细胞生长实验、平板克隆实验检测PTEN对PC-3细胞增殖能力的影响。结果:成功构建重组腺病毒载体Ad-PTEN;PC-3细胞经Ad-PTEN感染后PTEN蛋白表达水平明显增加。Western印迹实验所得条带进行灰度值分析后与β-actin求比值,PTEN蛋白在Ad-PTEN感染组细胞中表达(0.215±0.065)明显高于对照组[(0.052±0.009),t=4.30,P0.05]和Ad-LacZ组[(0.056±0.008),t=4.21,P0.05]。cyclin D1蛋白在Ad-PTEN感染组细胞中表达(0.256±0.072)明显低于对照组[(0.502±0.087,t=3.77,P0.05)]和Ad-LacZ组[(0.498±0.081,t=3.87,P0.05)]。p21蛋白在Ad-PTEN感染组细胞中表达(0.589±0.076)明显高于对照组[(0.146±0.026,t=9.55,P0.01)]和Ad-LacZ组[(0.163±0.024,t=9.26,P0.01)]。MTT实验显示Ad-PTEN对PC-3细胞的抑制作用自48h后(21.98%)有显著性(t=6.80,P0.01)。平板克隆实验显示Ad-PTEN组克隆形成率[(37.4±4.18)%]明显低于对照组[(54.9±4.81)%,t=4.76,P0.01]及Ad-LacZ组[(56.5±5.42)%,t=4.83,P0.01]。结论:通过腺病毒载体Ad-PTEN使PC-3细胞表达PTEN基因,可以明显抑制细胞的增殖,并可降低cyclin D1表达,同时增加p21的表达。 相似文献