含有人热休克蛋白基因的重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞的实验研究

目的:研究含有人热休克蛋白70(HSP70)基因的重组腺病毒对乳鼠心肌细胞的转染效率以及基因转染后HSP70的表达。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)体外感染心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建的腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。结果:Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法以及免疫组化染色法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。结论:重组腺病毒Ad.HSP70能够在体外高效、安全地感染心肌细胞,并成功地表达HSP70。     

姜黄素对缺氧复氧心肌细胞的保护作用及HSp70表达影响

目的：探讨姜黄素对缺氧复氧的乳鼠心肌细胞是否具有保护作用,这种保护作用是否与热休克蛋白70（HSp70）表达有关。方法：原代培养乳鼠心肌细胞,MTT法测IC50确定姜黄素浓度,建立缺氧复氧模型,分别测定各组细胞乳酸脱氢酶（LDH）活性、丙二醛（MDA）含量,缺氧/复氧细胞凋亡与坏死,并用免疫组织化学检测HSp70表达。结果：缺氧/复氧模型预先加姜黄素组较I/R组LDH活性与MDA含量下降,HSp70表达增加,细胞凋亡与坏死少。结论：姜黄素对体外培养的缺氧复氧心肌细胞具有保护和抗凋亡作用,姜黄素对缺氧复氧心肌细胞保护作用可能与HSp70表达增加有关。     

重组腺病毒介导的HSP70转染对肠上皮细胞缺氧再复氧损伤的防护作用

目的　研究重组腺病毒介导的热休克蛋白 70转染对肠上皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用。方法　将重组含人全长HSP70基因的腺病毒载体 (AdCMVHSP70 )转染体外培养的肠上皮细胞株IEC 6 ,检测转染细胞HSP70的基因表达水平。对照组 (转染空载体组 )、转染HSP70 2 4h、48h及72h组IEC 6细胞经缺氧再复氧处理后 ,分别对细胞的活力、凋亡及死亡水平进行检测分析。结果AdCMVHSP 70转染组细胞HSP70基因表达为阳性 ,对照组无表达。经缺氧再复氧处理后 ,AdCMVHSP70转染组细胞活力较对照组明显增强 (P <0 0 1 ) ,Annexin V Flous试剂盒检测死亡细胞明显减少 (P<0 0 1 ) ,凋亡有一定水平的抑制 (P <0 0 5)。结论　重组腺病毒介导的HSP70转染可保护肠上皮细胞抵抗缺氧再复氧损伤 ,具有明确的细胞保护作用。而其具体保护机制可能与抑制细胞凋亡有关     

重组bcl-xL腺病毒对心肌细胞凋亡的影响

[目的]探讨转染人类抗凋亡基因bcl-xL能否提高心肌细胞对缺氧的耐受性,评价它对心肌细胞的抗凋亡作用.[方法]体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,建立模拟心肌缺氧模型;将携带人类bcl-xL基因的重组腺病毒感染心肌细胞;免疫细胞化学染色法分析bcl-xL蛋白的表达;TUNEL法检测凋亡指数;荧光显微镜下观察心肌细胞表达绿色荧光蛋白,用Hoechst33342染色观察细胞核的形态变化.[结果]转染rAd-bcl-xL/s的心肌细胞表达bcl-xL蛋白阳性单位(PU)(17.84±3.42)明显高于正常对照组(11.02±2.56)与rAd-bcl-xL/as转染组(8.53±2.25)(P＜0.01);缺氧诱导后心肌细胞凋亡指数为(45.67±8.47)%,而转染rAd-bcl-xL/s后的细胞凋亡指数减少至(9.42±2.48)%,有显著性差异(P＜0.01),未见典型的凋亡小体.[结论]腺病毒介导的bcl-xL基因能高效转染心肌细胞,并表达目的基因;外源性bcl-xL基因对体外培养的心肌细胞具有抗凋亡作用,能够提高心肌细胞对缺氧的耐受性,促进损伤心肌的恢复.     

vAd-HSP70表达对低氧-复氧损伤后神经细胞生长影响

目的 探讨重组腺病毒介导的热休克蛋白70 (HSP70)表达对低氧-复氧损伤后神经细胞生长的影响.方法 用携带全长HSP70基因的重组腺病毒vAd-HSP70感染体外原代培养的神经细胞,RT-PCR和Wes-tern blotting方法 检测靶细胞中外源性HSP70基因表达.实验分为vAd-HSP70感染组、vAd-...     

丙泊酚对缺氧/复氧培养大鼠心肌细胞HSP70表达和LDH的影响

目的:研究丙泊酚对缺氧/复氧培养大鼠心肌细胞LDH漏出及HSP70表达的影响。方法:建立SD大鼠心肌细胞原代培养及缺氧/复氧模型。将原代培养大鼠心肌细胞分为6组,I组为对照组;II组为缺氧/复氧对照组;III组为在缺氧前开始加入脂肪乳;IV、V和VI组在缺氧前开始加入丙泊酚25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L。在复氧4h时用免疫组化法和图像平均灰度法测定HSP70的表达,在复氧3h时用生化比色法测培养基中LDH活力。结果:3种浓度丙泊酚均能减少心肌细胞LDH漏出(P<0.05)。II组与I组比较HSP70表达明显增加,VI组与II组比较HSP70表达明显被抑制,平均灰度值差异有统计学意义(P<0.05)。结论:3种浓度的丙泊酚能防治心肌细胞缺氧/复氧损伤。     

热休克蛋白70基因转染抗心肌细胞凋亡对缺氧/复氧损伤的保护作用

目的 观察比较热休克蛋白70对心肌细胞急性实验性缺氧/复氧损伤的保护作用及其与热休克心肌细胞保护模型之间作用的异同.方法 进行大鼠乳鼠原代心肌细胞培养,分为4组:空白组(对照),缺氧/再灌组(A/R),热休克蛋白组(A/R+HS)和pCDNA热休克蛋白质粒组(pCDNA HSP70).用脂质体对pCDNA HSP70质粒包裹,并转导入相关心肌细胞内.RT-PCR检测HSP70 mRNA表达、Western印迹检测HSP70蛋白质表达.检测心肌细胞存活率(四甲基偶氮唑蓝比色法)、培养液中乳酸脱氢酶活性、心肌细胞超微结构改变(透射电镜)及凋亡指数观察心肌细胞损伤程度.结果 A/R+HS组和A/R+pCDNA HSP70组细胞存活率显著提高(71.8±10.3)%、(73.4±12.2)%;(LDH)活性明显降低(14.3±2.6)IU/L、(14.6±2.9)IU/L;细胞超微结构明显改善;A/R组的HSP7o mRNA和蛋白质含量比A/R+HS组和A/R+pCDNA HSP70组,明显偏低(1.87±0.23、2.05±0.34倍P＜0.01).二者的细胞凋亡指数也较A/R组明显降低.结论 HSP70基因高表达能对抗缺氧/复氧对心肌细胞的损伤,其作用与抗细胞凋亡有关.     

颜氏活血复方对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

[目的]探讨颜氏活血复方对心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用及机制。[方法]通过制备含药血清、培养乳鼠原代心肌细胞、复制心肌细胞缺氧/复氧模型,采用细胞免疫化学法及TUNEL法,检测活血复方对心肌细胞缺氧/复氧损伤后心肌细胞存活率、Fas蛋白表达以及细胞原位凋亡的影响。[结果]颜氏活血复方能显著增加心肌细胞缺氧/复氧后细胞存活率、降低Fas蛋白表达以及细胞原位凋亡指数,从而减轻心肌细胞损伤。[结论]颜氏活血复方对心肌细胞缺氧/复氧后心肌细胞损伤有一定的保护作用。     

KATP抑制剂对七氟醚诱导乳鼠心肌细胞HSP70表达的影响

目的探讨HSP70在七氟醚诱导乳鼠心肌细胞预适应中的作用及其内在联系. 方法第2代培养心肌细胞随机分为正常对照组、缺氧/复氧组、七氟醚组、优降糖组、优降糖+七氟醚组,每组均缺氧2 h,复氧48 h.分别取复氧0、1、12、24、36和48 h的细胞用免疫组化染色检测乳鼠心肌细胞HSP70的表达.结果在各个时点,七氟醚组的HSP70表达最强,显著高于正常对照组、缺氧/复氧组、优降糖组和优降糖+七氟醚组(P<0.01),随着复氧时间的延长,七氟醚组HSP70表达从1 h开始增加,24 h表达最强, 具有显著统计学意义(P<0.05).且优降糖+七氟醚组HSP70表达与正常对照组、缺氧/ 复氧组、优降糖组组间无显著性差异(P>0.05).结论 HSP70和K ATP 通道均参与了七氟醚诱导乳鼠心肌细胞产生预适应过程,阻止KATP通道则抑制HSP70 的表达.     

siRNA靶向干扰IL28RA基因对缺氧复氧心肌细胞损伤的保护作用

目的:探讨小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)靶向干扰白细胞介素28受体α(interleukin 28 receptor alpha,IL28RA)基因对心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用?方法:设计合成干扰IL28RA基因表达的3对siRNA(siRNA-6158?siRNA-6160?siRNA-6162),采用脂质体转染原代乳大鼠心肌细胞,分为正常对照组?单纯缺氧复氧组?缺氧复氧+阴性对照转染组?缺氧复氧+siRNA-6158转染组?缺氧复氧+siRNA-6160转染组?缺氧复氧+siRNA-6162转染组,探索siRNA转染心肌细胞的合适浓度,检测心肌细胞存活率?培养液中LDH的水平及心肌细胞IL28RA蛋白表达,观察siRNA干扰IL28RA基因对心肌细胞缺氧复氧过程中的保护作用?结果:采用脂质体转染法,siRNA浓度在80 nmol/L对心肌细胞具有较高的转染效率?与单纯缺氧复氧组和缺氧复氧+阴性对照转染组比较,缺氧复氧+siRNA-6158转染组和缺氧复氧+siRNA-6160转染组的LDH活性明显降低(P < 0.05),心肌细胞存活率明显升高 (P < 0.05),IL28RA蛋白表达明显减少(P < 0.05)?结论:干扰IL28RA基因的表达有望成为保护缺氧复氧心肌损伤的重要手段?     

七氟醚和缺氧预适应诱导乳鼠心肌细胞HSP—70表达的改变

目的：探讨七氟醚预适应和缺氧预适应对乳鼠心肌细胞热休克蛋白70表达的影响。方法：第2代培养心肌细胞随机分为正常对照组(C组)、缺氧/复氧组(A／R组)、缺氧预适应组(IP组)和七氟醚预适应组(S组)，每组均缺氧2h，复氧48h。分别取复氧0，1，12，24，36和48h的细胞，用免疫组化染色检测HSP70表达并进行图象分析。结果：在各个时间点，S组和IP组间的HSP70表达均显著高于A／R组和C组(P＜0．01)，A／R组的HSP70表达略高于C组，S组和IP组间的HSP70表达差异无显著性(P＞0．05)。随着复氧时间的延长，S组和IP组间的HSP70表达从1h开始增加，24h表达最强，与1h相比差异具有显著性(P＜0．05)。结论：七氟醚预处理和缺氧预处理均可诱导乳鼠心肌细胞HSP70在延迟相呈高表达，提示HSP70参与了七氟醚预适应和缺氧预适应的延迟保护相。     

七氟醚和缺氧预适应诱导乳鼠心肌细胞HSP70表达的改变

目的 :探讨七氟醚预适应和缺氧预适应对乳鼠心肌细胞热休克蛋白 70表达的影响。方法 :第 2代培养心肌细胞随机分为正常对照组 (C组 )、缺氧 /复氧组 (A/R组 )、缺氧预适应组 (IP组 )和七氟醚预适应组 (S组 ) ,每组均缺氧 2h ,复氧 48h。分别取复氧 0 ,1,12 ,2 4,36和 48h的细胞 ,用免疫组化染色检测HSP70 表达并进行图象分析。结果 :在各个时间点 ,S组和IP组间的HSP70 表达均显著高于A/R组和C组 (P <0 .0 1) ,A/R组的HSP70 表达略高于C组 ,S组和IP组间的HSP70 表达差异无显著性 (P >0 .0 5 )。随着复氧时间的延长 ,S组和IP组间的HSP70 表达从 1h开始增加 ,2 4h表达最强 ,与 1h相比差异具有显著性 (P <0 .0 5 )。结论 :七氟醚预处理和缺氧预处理均可诱导乳鼠心肌细胞HSP70 在延迟相呈高表达 ,提示HSP70 参与了七氟醚预适应和缺氧预适应的延迟保护相。     

去甲肾上腺素诱导热休克蛋白70保护心肌细胞的机制

目的探讨去甲肾上腺素预处理心肌细胞后诱导心肌热休克蛋白70(HSP70)的表达及其对心肌细胞保护作用机制。方法 Wistar大鼠乳鼠心肌细胞培养,分为3组:对照组:心肌培养3～5天未施加任何因素;缺氧/复氧组:心肌细胞培养3～5天后,模拟缺氧(加入饱和氮气pH 6.8 D-Hank’s液培养细胞)3 h,复氧(用含20%新生牛血清的DMEM液培养细胞)孵育6 h;去甲肾+缺氧/复氧组:模拟缺氧前30 min加入100 nmol/L去甲肾,其它同缺氧/复氧组。测定心肌HSP70和bcl-2以及相关的细胞凋亡指标。结果 HSP70和bcl-2的表达在去甲肾+缺氧/复氧组明显高于缺氧/复氧组,去甲肾+缺氧/复氧组的细胞凋亡率明显低于缺氧/复氧组。结论去甲肾上腺素预处理可能通过诱导心肌组织HSP70和bcl-2高表达,发挥其对供心的保护作用。     

JNK抑制剂对H2O2诱导心肌细胞凋亡的保护作用

目的 观察特异性JNK抑制剂对H2O2诱导凋亡的培养乳鼠心肌细胞的保护作用，探讨热休克蛋白70（HSPT0）对H2O2诱导心肌细胞凋亡的保护作用机制。方法 培养大鼠乳鼠心肌细胞，随机分为4组，即正常对照组、H2O2损伤组、热休克组和JNK抑制剂组。应用免疫组化技术检测HSP70的表达；用透射电镜观察心肌细胞超微结构变化；用流式细胞仪分析心肌细胞凋亡百分率。结果 热休克预处理后HSP70在细胞浆内大量表达。JNK抑制剂明显抑制心肌细胞的凋亡率。结论 热应激预适应和JNK抑制剂对心肌细胞都具有保护作用，其保护机制可能与热应激时HSP70在心肌细胞内大量表达从而抑制了JNK的信号转导有关。     

酸性成纤维细胞生长因子在培养的乳鼠心肌细胞中分泌表达及其意义

目的:研究非促分裂型haFGF(non-mitogenic human acidic fibroblast growth factor,nm-haFGF)真核表达载体(pSecTag/nm-haFGF)在原代培养的新生SD乳鼠心肌细胞中的分泌表达及其对心肌细胞生理特性的影响.方法:采用脂质体转染的方法将真核表达载体pSecTag/nm-haFGF转染原代培养的心肌细胞,转染48h后用免疫印迹法(western blotting)检测nm-haFGF的表达状况,同时用H2O2造成心肌细胞损伤,观察nn-haFGF对心肌细胞的保护作用,并观察心肌细胞生理特性的变化.结果:转染后48h,心肌细胞在转染nm-haFGF基因后能够表达目标蛋白,而空载体实验组和未转染组均为阴性;MTF法检测结果表明,nn-haFGF基因的表达产物具有生物活性,对H2O2造成的心肌细胞损伤有一定的保护作用;pSecTag/nm-haFGF组的细胞搏动率明显高于阴性对照组,nn-haFGF基因的表达产物对维持心肌细胞的生理特性具有积极的作用.结论:转染nh-haFGF cDNA能够在原代培养的SD乳鼠心肌细胞中分泌表达,并具有其相应的生理活性,对H2O2损伤的心肌细胞具有保护作用.     

采用反义寡核苷酸探讨HSP70对活性氧所致心肌细胞损伤的影响

目的探讨HSP70对活性氧所致心肌细胞急性损伤的保护作用.方法用热休克预处理诱导新生大鼠心肌细胞中HSP70的表达,采用HSP70反义寡核苷酸阻断HSP70的表达,乳酸脱氢酶释放率和细胞总蛋白质合成能力来反映H2O2 0.5 mM所致心肌细胞损伤程度.结果H2O2引起心肌细胞乳酸脱氢酶释放率明显升高,而细胞总蛋白质的合成降低.热休克预处理导致心肌细胞中HSP70表达明显增加,并使H2O:所致心肌细胞LDH释放率显著降低,细胞总蛋白质的合成基本恢复正常水平.HSP70反义寡核苷酸很大程度上阻断了HSP70的表达及热休克预处理的心肌细胞保护作用.结论在热休克预处理减轻过氧化氢所致乳鼠心肌细胞急性损伤的作用中,HSP70发挥了最主要的作用.